khảo sát môi trường lên men enzyme pectinase

Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thànhcác pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid, vì vậy các pectin tan này không đồng dạng

mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tựtin.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Kim Dung – giảngviên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn tôi trongsuốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin kính chúc các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinhhọc Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt đượcnhiều thành công trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp nghiên cứu và giảngdạy

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS Vũ Kim Dung Phạm Nhật Thành

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Tổng quan về enzyme pectinase 2

1.1.1 Cơ chất pectin 2

1.1.2 Hệ Enzyme Pectinase 3

CHƯƠNG 2MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.3 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3.1 Vật liệu 25

2.3.2 Hóa chất 25

2.3.3 Thiết bị 25

2.3.4 Môi trường nuôi cấy 26

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2 31

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectinase 31

3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin 31

3.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường 32

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 33

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men 34

3.3 Đặc tính của peptinase từ chủng A niger CF2 36

3.3.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzyme 36

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme 37

3.3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme 39

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase 4Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp 20Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme 20

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin 3

Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc 16

Hình 1.3: Hình ảnh nấm Aspergillus niger 22

Hình 2.1: Môi trường lên men trước khi được bổ sung dịch khoáng 27

Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan 29

Hình 3.1: A niger sau 3 ngày nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC 31

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase 31

Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD .32

Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2 33

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme 34

Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger CF2 34

Hình 3.7: Môi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày 35

Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5 ngày35 Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF236 Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của pectinase từ A niger CF2 37

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A niger CF2 38

Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger CF2 39

Hình 3.13: Ảnh hưởng của tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhưpolygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân các phân tửpectin tạo các sản phẩm khác nhau Ban đầu, enzyme này được phát hiệntrong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch Đặc biệt phải

kể đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 trênđối tượng cà rốt

Với vai trò quan trọng, pectinase được sử dụng rộng rãi, đem lại lợi íchkhá lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp nhẹ Trước đâynguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật Ngày nay, người ta

đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng vàmang lại lợi ích kinh tế Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzymenày được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sứckhỏe con người Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triểnnhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật là lựa chọnhàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành,tăng năng suất sản xuất lên cao nhất Sự sản xuất pectinase quy mô công

nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009).

Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích

hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên

cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suấtquá trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ đó phục vụ nhu cầu sảnxuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về enzyme pectinase

1.1.1 Cơ chất pectin

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acidgalacturonic bằng liên kết -1,4 glucoside Tùy nguồn pectin khác nhau màpectin có khối lượng phân tử 80.000 200.000 Da

Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri,glycerine nóng

Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kếtvới các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin khôngtan Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thànhcác pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid,

vì vậy các pectin tan này không đồng dạng vớinhau

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng:

- Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự

nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được esterhóa bằng methanol Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịchacid và trong dung dịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác độnglên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa họckhông đồng dạng Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là -D-galacturonanhay -D-galacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị D-galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4) Mặt khác, mức độ oxyhóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất địnhcác nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl Trong một số trườnghợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự ester hóa giữa các nhómcarboxyl và các nhóm acetyl

- Pectin acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm

carboxyl được ester hóa bằng methanol Pectinate là muối của pectinic acid.Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vịgalacturonic acid Pectate là muối của pectic acid.

- Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có

cấu tạo hóa học phức tạp Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân

tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+ các gốc phosphoric acid, acetic acid vàđường Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hòatan

1.1.2 Hệ Enzyme Pectinase

1.1.2.1 Giới thiệu enzyme pectinase

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymerpectin và sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose,arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trongcông nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease Sự phân hủy pectin trong tựnhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai tròhết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin

1.1.2.2 Phân loại

Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng nhưbảng 1.1

- Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl

ester Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị

galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy(COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặcacid pectic và methanol Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau cógiá trị pH tối ưu khác nhau Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion

Thủy phân liên kết galacturonid trong

-1,4-D-galacturonid không theo mộttrật tự nào

3

Poly--1,4-D-galacturonidgalacturo

n-hydrolase

Exopolygalacturonase(exo-PG)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid

Endopolymetil-Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định

-1,4-D-5

Poly--1,4-D-galacturonid

digalacturonoliase

Exo-pectatliase(exo-PKTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat với

-1,4-D-sự tạo thành -4,5 aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định.6

-D Polygalacturonase (PG): còn có tên gọi khác là poly 1,4-D

1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết glycoside Các exo-PG (exo-poly -1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase,phân cắt từ đầu không khử, và endo-PG (endo- poly -1,4-D-galacturonide)glycanohydrolase tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất Polygalacturonase

-1,4-là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đốivới cơ chất

- Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate

không không bị ester hóa Cả hai enzyme exo-PEL (exo-poly (1,4-galacturonide)lyase) và endo-PEL (endo-poly (1,4--D-galacturonic) lyase)đều tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợpcho các enzyme này Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đanằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động Pectate lyasekhông được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm Cácenzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trìnhgây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm vàlàm mục mô thực vật

-D-Ngoài ra còn có:

- Pectin-transeliminase (poly 1,4--galaturonid-methylesteglucanolise)

là enzyme tác dụng lên pectin và pectinic acid

- Polygalactorunate-transeliminase (poly1,4-- galaturonid–

glucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.

- Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã

bị ester hóa Tất cả các PNL đều là endo-enzyme

1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme pectinase

- Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinaseduới dạng tinh khiết Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường

nấm mốc sấy khô Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệuđem chế biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10%.

- Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và cácnước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả Nhờtác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễdàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâunghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25% Bởi lẽkhi có pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bịđục và lọc rất dễ dàng Không những vậy, enzyme pectinase còn góp phầnchiết rút được các chất màu, tannin và những chất hoà tan nữa, do đó làm tăngthêm chất lượng thành phẩm

- Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng mộttrong sáu nhóm enzyme sau:

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục Mục đích

sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thuđược luợng sản phẩm lớn

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, khôngchứa pectin Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly vàthuỷ phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệttiêu nguyên nhân làm đục nước quả

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nướcquả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vangnhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làmcản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trongrượu vang

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trongsản suất siro thành phẩm.

Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên

cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý Trong các đặc điểm của tráicây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sảnphẩm.Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ đượcmàu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theoý muốn bằng cáchđiều khiển những phản ứng enzyme Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái câyđược chia làm hai loại:

Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi…

Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho

đỏ, mận đen, dâu…

Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạtcác enzyme sau:

- Enzym endo-PmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả

- Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly

- Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc

1.1.2.3.1 Làm trong nước quả

- Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầutiên vào năm 1930 Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên rấtphổ biến ở nhiều nước trên thế giới Việc thu nhận nước quả từ trước đến naychủ yếu bằng phương pháp ép Syrup quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàmlượng pectine đáng kể Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả nhưsau:

- Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thìpectinase phải có enzym endo và exo-polygalacturonase, enzympectinestenase Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên lànhững enzym quyết định hiệu quả của chế phẩm Vì endo và exo-polygalacturonase sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzyme PE cũnggóp phần vào tác dụng của enzym này Enzym proteinase của chế phẩm sẽthuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoátcủa dịch quả dễ dàng Sự có mặt của cellulase và hemicellulase ở trong chếphẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc Khi sử dụng cho các loại quả như táo,

lê thì trong chế phẩm không được phép có enzyme pectinaseliminase vàenzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn các tế bào riêng biệt của mô quảlại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt của dịch quả và kếtquả là làm giảm hiệu suất dịch quả Ngược lại, khi sử dụng cho các loại quảmọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vìenzym này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bàotăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống

Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quảtrong cũng không được phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase,poliphenoloxydase)

Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemicellulase vàcellulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chếphẩm.Trong đó vai trò dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷprotopectin của mô quả Hemicellulase và cellulase sẽ cùng với PTE làm cho

độ đồng thể của nước quả có màu sáng thì trong chế phẩm không chứa enzymoxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoxian thì không chứaenzym phá huỷ các chất này

Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase,người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả Bã nghiền nhanh được đem

xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm Trong trường hợp có sử

dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi chotác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quátrình ép sau này.

Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làmtrong dịch quả Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả Bởi lẽ nhờtác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàntoàn Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa mộtphần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chấthoà tan

Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loạitrừ được trường hợp làm trong không hoàn toàn

Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàntoàn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn

Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể chia làm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt mộtcách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “phá vỡ”

+ Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khikết tủa hoàn toàn

+ Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt cácpectin kết tủa bởi ion canxi

- Để làm trong nước trong quả nên sử dụng chế phẩm enzyme có hoạt

độ 1,950 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp so màu) Dưới tác dụng củapectinase, pectine - một polysacharide được tạo thành từ sự liên kết giữa cácmạch của phân tử acid galacturonic (C6H10O7) mà một phần đã được este hoávới rượu metylic (CH3OH) bị phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozic.Pectine là 1 chất điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm (-) dọc theochiều dài của mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm điện tích cùng dấu (-

COO-) nên mạch có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trongtoàn bộ dung dịch có chứa pectin Nước quả đục là hệ huyền phù trong đóphần tử thịt quả có kích thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớnnên không bền vững về mặt nhiệt động học Mặt khác, chúng là những phân

tử tích điện nên dưới tác dụng của lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thànhnhững phân tử lớn dễ dàng lắng xuống Trong nước quả, sự có mặt của hợpchất polyphenol (đặc biệt là tanin) tạo nên với pectine những kết tủa khôngtan v.v Sự có mặt của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên.Xác định giá trị mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo thờigian để so sánh tốc độ lắng thịt quả giữa các mẫu

- Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95% Nếu ta chỉ nghiềnsau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa Khi ta chopectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30% Nhiều trường hợp, hiệu suất éptăng đến 50% Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03-0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 – 2% Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷphân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8 giờ Dịch quả thu được bằngpectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ

1.1.2.3.2 Trong sản xuất rượu vang

Giúp cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ Enzymepectin được thêm vào các loại trái cây trước khi bổ sung các men rượu trongquá trình sản xuất rượu vang đỏ để cải thiện màu sắc và độ đục Rượu vang

đỏ được bổ sung enzym có màu sắc tốt hơn so với các loại rượu vang khôngđược bổ sung enzyme Những loại rượu này cũng cho thấy sự ổn định lớn hơn

so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme

1.1.2.4 Một số phương pháp sản xuất enzyme pectinase

1.1.2.4.1 Nguồn gốc thu nhận

 Từ vi sinh vật: Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzymethì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú Vi sinh vật phân giảipectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:

Môi trường Dụng cụ nuôi cấy

Phối vào dụng cụ

Cấy vào môi trường Nhân giống Giống vi sinhvật

Nuôi cấy trong 36

giờ

Thu nhận enzyme

thô

Nấm mốc: A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus…

Nấm men: S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii …

Vi khuẩn: B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum…

1.1.2.4.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Quy trình sản xuất

 Thuyết minh quy trình:

 Môi trường nuôi cấy

Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngômảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng Môi trường rắn thường dùngnhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng

và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ranhiều enzyme Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cảiđường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao.Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khítốt, giúp cho sự phát triển của nấm Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấygồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dinh dưỡng khác(mầm mạ, nước khoai tây… để cung cấp thêm nguồn nitơ, photphat, kali…).Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thìnhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môitrường nhanh khô, sinh bào tử mạnh

 Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng

nuôi có sẵn các giá

 Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở

1210C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm

 Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay

đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 300C thìtiến hành cấy giống

 Giống

Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránhnhiễm tạp Giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môitrường trên để giống quen với điều kiện sản xuất Khi nhân giống thường đểcho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theophương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín

Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2% Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào10kg môi trường.

 Nuôi cấy

Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵncác giá Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-320C Nếu nhiệt độ xuống dưới 240Cthì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy

sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme

Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ đầu: giai đoạn này có những thayđổi sau:

Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa

Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉcần làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ

Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có

độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 300 C và độ ẩm trong phòngkhoảng 90%.

Các loại enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase đượchình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng

 Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20giờ: giai đoạn này cónhững biến đổi

Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng

sẽ chậm lại Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khíkhông quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồngnuôi duy trì ở 300C

Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy

có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, enzyme vẫn đượchình thành ở giai đoạn này

Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiềnnhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm Sản phẩm này là chếphẩm enzyme thô

 Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinhvật và không được tiết ra môi trường bên ngoài Những tế bào vi sinh vật saukhi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào Mục đích của việc này làgiải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào Hỗn hợpthu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn

enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối Enzyme sau đó sẽ được đem tinhsạch.

Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bàoThường lẫn chung với các chất khác của tế

bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất

nguyên sinh, lipid…)

Không lẫn chung với các thànhphần nội bào, nếu có chỉ là mộtvài enzyme ngoại bào khac

Chỉ bền vững trong môi trường nội bào Bền vững hơn

Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy

trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt

Phương pháp tinh sạch dễ và rẻhơn

+ Từ môi trường nuôi cấy bề mặt

Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton) Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan Nước thường dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28 0 C Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một

ít focmalin hoăc chất sát trùng khác Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 12 0 C.

Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton) Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường Như

ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi Vì vậy, các enzyme, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.

Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme Để tránh mất hoạt tính của enzyme dịch phải được làm lạnh xuống 3 – 5 o C Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa, lắng xuống dưới cần tách ly ngay

Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc

+ Từ môi trường nuôi cấy bề sâu

 Phương pháp hiếu khí

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của

vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khilượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấythường đạt từ 6-7,2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợpsinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase Khi pH dịch về phía acid, ngay cảkhi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnhhưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48 giờ tuổi và với hàm

lượng từ 2-10% Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm

được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào

tử, thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42 giờ Lượng sợi nấm đem gieo cấythường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môitrường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Côđặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồisấy khô trên thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đivào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC Thời gian lưu của chế phẩmenzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩmsau khi sấy phải không quá 40oC Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín

để tránh hút ẩm

 Phương pháp yếm khí

Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO30.3%; nước chiết ngô 0.5%

Clostridium pectinofermentants15 có khả năng tổng hợp pectinase một

cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thờivới sự tích luỹ sinh khối Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổnđịnh của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ, pH ban đầu của môi trường dinhdưỡng là 6.5-7.0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canhtrường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôicấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC

C.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase Thành

phần môi trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2HPO40,4%;K2HPO4 0,7%; KH2PO4 0,3%; NaCl 0,1%; MgSO4 0,025%; FeSO4 dạng vết;CaCO3 0,5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic acid 0,5%

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kếttủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat Nếu kếttủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8 Nếu kết tủa

bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so vớihoạt độ ban đầu.

Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0,2 thì sẽ thu đượcchế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là0,9-1,0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase vàexopolygalacturonase

1.1.2.5 Đặc điểm của enzyme pectinase

Pectinesterase:

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu

khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còncủa chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0đến6,5 Trái lại pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật là từ 6 đến 7,5– 8

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C Từ 55đến 620C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzymepectinesterase từ thực vật cao hơn: từ 55 – 600C

Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có

nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, pHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oC và từthực vật (pHopt=7,5-8, to opt= 55-60 oC) Khả năng hoạt động của chúng phụthuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin Ion natri và đặc biệt

là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ

nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger Trái lại các cation hóa trị 3

và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tácdụng của pectinesterase

Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn

vi sinh vật Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại

bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis, Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum,

neurosrora crassa, các loàiAscomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum.

pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vàonguồn thu và cơ chất Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa(endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu nằmtrong khoảng từ 4,0 – 5,5 Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thìlại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6 Còn polygalacturonase đường hóa khitác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acidpectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6

Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6

Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa

bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5

Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40-450C Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vôhoạt khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C

1.1.2.6 Trung tâm hoạt động của pectinase

Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với

2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất

Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate vàLysine Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khảnăng xúc tác của enzyme

1.1.2.7 Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới

Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme loàingười đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong côngnghiệp Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzymeđược ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều Các enzyme quantrọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình bày qua bảngsau:

Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp

Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme

1.1.3 Tổng quan về Aspergillus niger

1.1.3.1 Lịch sử nghiên cứu

A niger đã là chủ đề được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp trong nhiều thập kỷ qua Năm 1919, A niger được sử dụng để sinh tổng hợp

citric acid và đánh dấu tầm quan trọng trong sản xuất citric acid trong quy mô

công nghiệp Ngoài ra, A niger còn có khả năng sinh tổng hợp acid gluconic, acid fumaric Tuy nhiên, kể từ năm 1960, A niger đã trở thành nguồn sinh

tổng hợp một loạt các enzyme tham gia vào kỹ thuật chế biến hoa quả, bánh

và trong các ngành công nghệ tinh bột và thực phẩm Công nghệ gen đã áp

dụng thành công để cải thiện quy trình sản xuất và sử dụng các chủng A.