Tuy nhiên, một trong những trở ngại lớn đối với công tác chăn nuôi là các dịch bệnh xảy ra thường xuyên gây thiệt hại không nhỏ, làm hạn chế sự phát triển của ngành.. Các chất kháng sinh
CƠ SỞ LÝ LUẬN
CÂY RAU SAM (Portulaca oleracea)
Họ (familia): Portulacaceae Chi (genus): Portulaca Loài (species): Portulaca oleracea (http://www.vi.wikipedia.org)
Tên khác: xỉ mã hiện, phjăc bỉa, slổm ca (Tày), Garden purslane, purple- flowered purslane, vegetable portulaca (Anh), pourpier commun (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
(http://www.dobelden.files.wordpress.com)
Thân thảo, sống hằng năm, mọc bò Thân hình trụ, mập, mọng nước, nhẵn, màu đỏ tím nhạt, dài 15 – 30 cm, phình lên ở những mấu Lá mọc so le hoặc gần đối, phiến dày, phẳng, hình niêm, dài 0,8 - 1,5 cm, rộng 5 – 8 mm, gốc thuôn dần thành cuống ngắn, đầu lá bẹt, mép có viền đỏ, không có lá kèm
Hoa màu vàng, mọc đơn độc hoặc tụ tập ít hoa ở ngọn thân, lá bắc hình tam giác, dạng vảy, 2 lá đài, hình tam giác nhọn không đều; 5 cánh hoa, hình trứng ngược, khuyết ở đầu, to hơn lá đài; 8 - 10 nhị, bao phấn hình mắt chim; bầu trung
Quả nan hình cầu hoặc hình trứng, mở theo một đường tròn ngang ở giữa quả thành cái nắp, chứa nhiều hạt màu đen bóng Mùa hoa quả: tháng 6 - 8 (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Hạt hình cầu, hình thận, phôi bao quanh nội nhủ có nhiều hột (Hutchinson,
Chi Portulaca có khoảng 40 loài trên thế giới, chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Vùng Đông – Nam Á có khoảng 5 loài, trong đó Việt Nam có
4 loài Cây còn được trồng làm rau ở Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia và Trung Quốc (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Cây RS phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên thế giới RS mọc hoang dại khắp nơi, thường mọc ở những nơi đất ẩm quanh vườn, bờ ruộng, bãi cỏ, các chân ruộng đất cát pha ẩm ướt Ở các tỉnh phía Bắc RS phát triển mạnh mẽ vào mùa hè và tàn lụi vào mùa đông (Nguyễn Ngọc Bích, 2000)
100 g RS chứa 92 g nước, 1,7 g protein, 0,4 g chất béo, 3,8 g carbohydrat,
103 mg Ca, 39 mg P, 3,6 mg Fe, 2550 đơn vị quốc tế vitamin A, 0,03 mg vitamin
Tinh dầu RS có 11 thành phần, chủ yếu là linalol 18,96% và 2 - hexadecen -
1 - ol, 3, 7, 11 - 15 - tetramethyl 13,55% Hạt RS chứa các acid linolcic 47,16%, acid linoleic 22%, acid palmitic 17,46%
Trong RS chứa nhiều hợp chất phenol gồm scopoletin, bergapten, isopimpinnelin, acid lonchocarpic, lonchocarpenin, robustin, genistein, genistin, portulosid A với tên khoa học là (3S) - 3 - (3, 7 - dimethylocta - 1, 7 - dien - 6 - onyl) - β - D - glucopyranosid (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Ngoài ra, RS còn chứa lượng cao omega - 3 (Ezekwe et al, 1999) và l - norepinephrin (l - noradrenalin) (Albert et al, 1996)
Trong RS còn có glycosid, saponin, chất nhày, acid hữu cơ, các muối kalium, vitamin A, B 1 , B 2 , C, PP và men urenasa,… tác dụng làm co mạch ức chế vi trùng lỵ, thương hàn, vi trùng gây bệnh ngoài da và bệnh ho lao (Võ Văn Chi, 2005) và có coumarins, flavonoids (http://www.astf.net)
Trong các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy RS không độc Nhưng trong thành phần của RS có cardiac glycosides và oxalic acids có thể gây độc (http://www.ansci.cornell.edu)
Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), RS có tác dụng lợi tiểu và chống choáng phản vệ trên động vật thí nghiệm Cao cồn RS tiêm dưới da cho chuột nhắt trắng với liều 50 mg/con/ngày trong 30 ngày gây giảm sự sinh tinh trùng
RS được điều trị thử nghiệm có hiệu quả tốt đối với lỵ trực khuẩn cấp tính, ho lâu ngày, lao phổi, chữa mụn nhọt, sưng đau, trĩ Cao RS ức chế in vitro các trực khuẩn lỵ, thương hàn, E coli Cao nước có tác dụng gây tăng huyết áp, tăng sức co bóp của tim trên mèo, giảm nhịp tim trên ếch, kích thích tử cung của động vật thí nghiệm, giãn cơ xương của chuột cống trắng
Hạt có tác dụng lợi tiểu, chống lỵ và cũng được dùng đắp chữa bỏng và bệnh vẩy da Chống độc khi bị rắn độc và sâu bọ cắn Hạt phối hợp với các dược liệu khác để hạ sốt Chữa eczema, viêm da do sán vịt
Theo Trần Văn Kì (2000), RS còn có công dụng chỉ huyết dùng trong các trường hợp xuất huyết, xuất huyết tử cung, sau khi đẻ ra nhiều máu Trị bệnh viêm đường ruột do vi khuẩn ở cá (Từ Thanh Dung và ctv, 2005)
Nước ta và một số nước khác dùng RS làm rau ăn, nhất là ở đảo Crêt (Hy Lạp), người dân dùng RS ăn sống, mọi người đều thấy RS ảnh hưởng tốt đến sức khỏe, đặc biệt là người dân ở đây ít bị bệnh tim mạch (http://www.moh.gov.vn)
2.1.6 Các bài thuốc cổ truyền
Chữa lỵ: RS, cỏ nhọ nồi, cỏ sữa lá to, lá nhót, búp ổi, mỗi vị 10 g Dạng thuốc bột, thuốc hoàn, ngày uống 2 - 3 lần, mỗi lần 15 g (Đỗ Huy Bích và ctv,
Chữa giun kim: RS (50 g) để tươi, rửa sạch, giã nhỏ với ít muối, rồi vắt kiệt nước cốt, uống vào buổi tối trước khi đi ngủ, trong 3 ngày (Đỗ Huy Bích, 1995) Chữa đái buốt, đái ra máu: RS tươi giã lấy nước vắt uống thường xuyên, hoặc nấu canh rau ăn mỗi ngày Dùng 3 - 7 ngày
CÂY THUỐC GIÒI (Pouzolzia zeylanica)
Họ (familia): Urticaceae Chi (genus): Pouzolzia Loài (species): Pouzolzia zeylanica (http://www.vi.wikipedia.org)
Tên khác: cây TG, bọ mắm
(http://www.ctu.edu.vn)
Thân thảo, mọc bò, cao 0,2 - 0,3 cm Thân cành mảnh, có lông áp sát Lá mọc so le, mép nguyên hình mác-bầu dục, gốc tròn, đầu nhọn, dài 4 – 9 cm, rộng 1,5 - 2,5 cm, có 3 gân tỏa từ gốc, mặt trên có đốm trắng, mặt dưới có ít lông ở gân nổi lên, cuống lá ngắn có lông trắng; lá kèm hình dãy nhọn Cụm hoa mọc thành xim ở kẽ lá, đường kính 5 mm, không cuống, gồm hoa đực, hoa cái hoặc hoa lưỡng tính; hoa nhỏ màu trắng; hoa đực có lông ngắn, 4 lá đài có lông ở lưng, 4 nhị, nhụy lép; hoa cái có bao hoa dạng túi, miệng khía răng có lông, bầu hình quả lê, có lông, vòi nhụy dài và mảnh Quả hình trứng nhọn, màu hồng tím, có lông Mùa hoa quả: tháng 7 - 9 (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Chi Pouzolzia gồm nhiều loài thân thảo hoặc bụi nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, chỉ có 6 loài, trong đó có cây TG Phân bố rộng khắp cả vùng đồng bằng, trung du và miền núi Còn thấy ở nhiều nước châu Á khác như Trung Quốc, Lào, Campuchia, Ấn độ, Thái lan (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Theo Nguyễn Thanh Thủy (2008), cây TG chứa các hợp chất như phylanthin, methyl stearate, β - sitosterol - 3 - O - β - D - glucopyrannoside, vitexin, isovitexin và quercetin
TG dùng toàn cây, chiết bằng cồn 50 o được cao thô có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng kháng amip, giun sán, virus, làm hạ đường huyết và tác dụng trên hô hấp
Ngoài ra còn có tác dụng giảm đau trên mô hình kẹp đuôi chuột, chống co giật do sốc điện, lợi tiểu và tác dụng trên tế bào ung thư in vitro (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Theo kinh nghiệm dân gian, lấy cây TG tươi rửa sạch, để ráo nước, giã nhỏ cho vào vại mắm để trừ giòi, bọ (Đỗ Huy Bích, 1995) và người ta thu hoạch phần trên mặt đất, rửa sạch đem hái lá dùng làm rau ăn sống giống như các loài rau khác hoặc xay với rau má hay trái cây làm nước sinh tố (Võ Văn Chi, 2004)
Về mặt y học, có tác dụng chữa ho lâu ngày, ho có đàm, tiểu tiện ít, tắc sữa, giảm sưng tấy, áp xe (Đỗ Huy Bích, 1995)
TG cũng dùng trị mụn mủ (http://www.banglajol.info), mau liền sẹo, vết loét (http://www.bpi.da.gov.ph) và trị bệnh phổi (http://www.sibthorp.org.uk) hoặc dùng lá giã nát nhét vào răng sâu chữa sâu răng (Đỗ Tất Lợi, 2003)
Theo Võ Văn Chi (2004), cây TG còn có tác dụng là trị viêm họng, lỵ, viêm ruột, nhiễm trùng đường tiểu, viêm vú Ở Ấn Độ, cây dùng trị giang mai, lậu, nọc rắn độc
Chữa ho lâu ngày: cây TG bỏ rễ, ngày 40 g sắc uống, hoặc nấu cao lỏng pha mật ong, ngày uống 15 – 20 ml
Chữa viêm họng, đau răng: Dùng lá tươi nhai ngậm nuốt nước
Chữa đụng đập: sau khi cố định vết thương dùng cây tươi giã đắp, hoặc bột cây khô, tưới rượu vào đắp, rồi bó lại (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004) Đinh nhọt và viêm mủ da: TG, rau má, lá rau muống giã tươi đắp
Viêm vú: TG, Tử hoa địa đinh, Phù dung, Bồ công anh giã tươi đắp (Võ Văn Chi, 1991).
CÂY TẦN DẦY LÁ (Plectranthus amboinicus)
Họ (familia): Lamiaceae (Hoa môi) Chi (genus): Plectranthus Loài (species): Plectranthus amboinicus Tên đồng nghĩa: Coleus amboinicus (Lour),
(http://www.vi.wikipedia.org)
Tên thường gọi: rau TDL, húng chanh, rau thơm lông, dương tử tô, sak đam ray (Campuchia), Aromate des Javanais, indian borage (Anh), coliole aromatique (Pháp),…
Hình 2.3 Cây Tần Dầy Lá
Cây thảo, sống lâu năm, cao 20 – 50 cm, thân mọc đứng hay ngã, phần sát gốc hóa gỗ Lá mọc đối, dày, mọng nước, hình trứng rộng, gốc hình niêm, đầu hơi nhọn hoặc tù dài 3 – 6 cm, rộng 2 – 5 cm, mép khía răng tròn (Đỗ Huy Bích và ctv,
2004), lá có lông phủ ở lớp mặt trên, có một lớp lông đơn tận cùng là một tuyến trong suốt, lấp lánh; ở mặt dưới lớp lông này dày hơn và gân nổi rõ hơn Hoa màu tía, nhỏ, xếp thành từng cụm hoa, khoảng 20 - 30 hoa (Võ Văn Chi, 1998), cụm hoa mọc ở ngọn thân, và đầu cành, đài hình chum ngắn, có lông, chia 5 răng, răng trên hình trứng rộng, răng dưới và răng bên gần bằng nhau, tràng cong, có ống hình phễu, mặt ngoài có lông, mặt trong nhẵn, môi dưới dài bằng ống tràng, môi trên ngắn, 3 thùy, thùy trên rộng, 2 thùy bên hình mũi mác, nhị 4 thò ra ngoài tràng Quả bế tự, nhỏ hình cầu, màu nâu Toàn cây có lông, mùi thơm như chanh Mùa hoa quả: tháng 3 - 5 (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Chi Coleus có khoảng 300 loài, phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và một số đảo ở Thái Bình Dương Chi này có 3 loài ở Việt Nam Nguồn gốc ở Ấn Độ và đảo Moluques, sau được trồng phổ biến ở Malaysia, Philippin, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc Ở Việt Nam, đây là cây trồng lâu đời, rải rác trong dân gian và chưa trở thành cây trồng sản xuất Cây ưa sáng, ẩm, đôi khi chịu hạn Các cây trồng ở các tỉnh miền Bắc có hiện tượng rụng lá vào mùa đông, có khả năng tái sinh vô tính khỏe (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Tùy thuộc vào từng khu vực phân bố, nguồn gen, điều kiện môi trường sống, thời điểm thu hái, bảo quản và biện pháp chưng cất mà hàm lượng tinh dầu có thể thay đổi trong giới hạn rất rộng: 0,02 - 0,09% trong lá tươi, 0,5 - 1,2% trong lá khô tuyệt đối Sau khi thu hái, nguyên liệu cần được chưng cất tinh dầu ngay Nếu thời gian bảo quản càng lâu thì hàm lượng tinh dầu càng giảm Tinh dầu nhẹ hơn nước, màu vàng nhạt Thành phần hóa học khoảng hơn 35 hợp chất và hiện đã biết được trên 20 hợp chất
Các thành phần hóa học chủ yếu trong tinh dầu của TDL mọc ở nước ta: carvacrol (39,5 - 82,8%), γ - terpinen (2,3 - 19,0%), α - terpinen (vết - 16,8%), β - caryophyllen (2,6 - 5,9%), α - bergamoten (1,9 - 3,0%), myrcen (vết - 1,9%), α - humulen (0,7 - 1,7%), caryophyllen oxit (1,1 - 1,2%), terpinen - 4 - ol (1,2 - 1,3%), p - cymen (0,8 - 2,6%) và eugenol (vết - 1,6%)
Trong tinh dầu TDL nhóm hợp chất monoterpen hydrocabon thường là thành phần chủ yếu và chiếm khoảng 53% trong tinh dầu Các thành phần trong đó là: 3 - caren (16%), γ - terpen (12%), camphor (12%) và carvacrol (13%) (Lã Đình Mỡi và Dương Đức Huyến, 2002)
Lá có chứa tinh dầu mà thành phần chính là carvacrol: 40,40% (Bos et al,
1983) Tuy nhiên, theo Baslas et al (1981), chứng minh thành phần trong tinh dầu là Thymol 41,30% Lá mọc ở Pnom Penh (Campuchia) chứa 0,03% tinh dầu, trong đó có carvacrol 61,45%, γ - terpinen 9,91%, α - terpinen 8,03% (Đỗ Huy Bích và ctv,
Lá mọc ở Hà Nội chứa 0,002 - 0,003% tinh dầu trong đó carvacrol 39,5%, γ - terpinen 19,0%, α - terpinen 16,8% (Nguyễn Xuân Dũng và ctv, 1990)
Trong tinh dầu có chất màu đỏ là colein (Đỗ Tất Lợi, 2003)
TDL cũng chứa hexacosanol, β-sistosterol, axit oleanolic, betulin và các nhóm triterpenoid Lá mọc ở khu vực Nam Mỹ còn chứa các hợp chất flavon salvigenin, 6 - mothoxygenkwanin, quercetin, chrysoeriol, luteolin, apigenin,
Tinh dầu có tác dụng kháng sinh mạnh với Staphylococcus, Salmolnella typhi, Shigella flexneri – Shigella sonnei, Shigella dysenteria (Shiga) Subtilis,
Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), nồng độ ức chế thấp nhất của tinh dầu tương ứng như sau: trực khuẩn mycoides (1 : 1000), trực khuẩn subtilis (1 : 1000), trực khuẩn lao (giảm độc) (1 : 1000), trực khuẩn lỵ Flexner (1:1000), tụ cầu khuẩn vàng (1 : 1000), trực khuẩn lỵ (1 : 500), liên cầu khuẩn tan máu (1 : 500), trực khuẩn thương hàn (1 : 500), phế cầu khuẩn (1 : 500), nấm Cadida albicans
(1 : 500), amip Entamoeba moshkowskii (1 : 1280); Tinh dầu còn có tác dụng ức chế trực khuẩn E coli, liên cầu khuẩn, trực khuẩn bạch hầu và trực khuẩn ho gà, chủng phẩy khuẩn tả Inaba và Ogawa
Ngoài ra, cao nước của cây TDL cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của phế cầu khuẩn và tụ cầu vàng Như vậy tính kháng khuẩn không chỉ do tinh dầu mà còn do những thành phần khác trong cao nước như flavon, acid nhân thơm, tanin, vì lượng tinh dầu trong cao nước rất ít TDL còn có tác dụng ức chế hoạt tính gây co thắt cơ trơn ruột cô lập của histamin và acetycholin (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
Ngoài công dụng làm gia vị, TDL còn là thuốc chữa cảm cúm, chữa ho hen, giã đắp lên những vết do rết và bọ cạp cắn Thường dùng tươi với liều 10 -16 g một ngày (Đỗ Tất Lợi, 2003)
Tinh dầu và bột khô cũng được dùng phòng trừ một số loài sâu hại trong bảo quản các loại hạt ngũ cốc, như dùng để diệt các loài sâu Sitophilus zeamai,
Rhizopertha domicana và Callosobruchus chinensis Những thử nghiệm tại Philipin đã xác nhận tinh dầu còn có thể gây độc đối với nhiều loài sâu khác (bọ cánh cứng màu đỏ gây hại cây non, sâu róm, sâu đen, mọt lúa) (Lã Đình Mỡi và Dương Đức
Chữa viêm họng, ho, khản tiếng: lá tần tươi ngậm nhai với muối, nuốt nước hoặc lấy 20 g lá tươi giã nhỏ, thêm nước gạn uống làm 2 lần/ngày
Chữa cảm mạo do lạnh: TDL 10 g, bách bộ 12 g, tía tô 12 g, xạ can 10 g, gừng 8 g, bạch chỉ 6 g Sắc uống ngày 1 thang, dùng 5 ngày liền (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004).
VI KHUẨN
* Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Aeromonas hydrophila thuộc nhóm Aeromonas di động, giống Aeromonas, dễ phát triển ở 37 o C hoặc 25 - 30 o C, không sinh nha bào Khi nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28 - 30 o C Sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1 - 7,2 (Từ Thanh Dung và ctv, 2005)
(http://www.wikimd.org/index.php/Food_poisoning)
Là vi khuẩn lên men đường có hoặc không có sinh hơi, yếm khí tùy tiện, Cytochrom oxidase dương tính, khử nitrate, không mẫn cảm với thuốc thử vibrios 0/129 (2, 4 - diamino, 6, 7 - di-isopropyl pteridine) Tỷ lệ Guanin và Cytozin trong ADN là 57 - 63 mol% (Bùi Quang Tề, 2006)
Một số đặc điểm sinh hóa của Aeromonas hydrophilađược trình bày qua bảng 2.1
Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh vật hóa học của Aeromonas hydrophila Đặc điểm sinh hóa Phản ứng
Aeromonas hydrophila có khả năng sinh các độc tố như: độc tố đường ruột
(enterotoxins), dung huyết (hemolysins), phân giải protein (proteinase), độc tố gây hoại tử da (dermonecrotic), đông máu (haemagglutinins) và nội độc tố (endotoxin) (Cahill, 1990)
Vi khuẩn có thể phát triển ở 5 o C và bị tiêu diệt ở 70 o C
Vi khuẩn không có khả năng gây ngưng kết trong acriflavine, không thay đổi sau đun sôi và đề kháng với tác động diệt khuẩn của huyết thanh động vật hữu nhũ và chlorin (Roccoc, 2001)
Theo Tachusong và Saitanu (1984), trong nước sạch khử hoạt tính
Aeromonas hydrophila bằng potassium permanganate (PP) với nồng độ 2,5 ppm không diệt được vi khuẩn, tuy nhiên ở các nồng độ 5 ppm, 50 ppm và 100 ppm PP khử hoạt tính A hydrophila trong vòng 120, 15 và 1 phút (Hứa Thị Phương Liên,
Theo Josh Martin (2004), vi khuẩn có khả năng đề kháng với penicillin, ampicillin, carbenicillin và ticarcillin (http://www.web.mst.edu)
A hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu (đốm đỏ) Theo Bùi Quang Tề và ctv (2004), cá bị bệnh thể hiện sự xuất huyết ở các gốc vây, đuôi, xung quanh miệng, có thể xuất hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, trên vết loét thường có nấm và ký sinh trùng ký sinh, bụng cá chướng to, mắt lồi mờ đục, cá ngửa bụng trôi theo dòng nước, uốn cong thân, cá kém ăn hoặc bỏ ăn
Theo Josh Martin (2004), ở người vi khuẩn được lây truyền qua đường miệng do tiếp xúc với thức ăn, nước uống, chất thải, phân bị nhiễm khuẩn hoặc do ăn phải cá hay bò sát bị nhiễm bệnh và xâm nhập qua vết thương hở trong môi trường nước có sự hiện diện của vi khuẩn Thời kỳ đầu người bệnh sốt và cảm lạnh Sau đó vết thương bị nhiễm trùng gây buồn nôn, ói mửa, tiêu chảy… Nếu điều trị kịp thời với thuốc thích hợp thì kết quả rất tốt Trường hợp nặng hơn thường phải cắt bỏ vùng mô bị nhiễm trùng Khi điều trị có thể sử dụng một số kháng sinh như: chloramphenicol và tetracycline (http://www.web.mst.edu)
* Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae có một số đặc điểm: hỡnh que mảnh, gram õm, kớch thước 1 ì 2 – 3 àm, khụng sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao (Bùi Quang Tề, 2006)
Khuẩn lạc bóng, tròn, màu trắng đục, kích thướt khoảng 2 mm phát triển trên brain heart infusion (BHI) agar hoặc Trypticase Soy agar (TSA) sau 48 giờ ủ ở
25 - 30 o C Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 25 - 30 o C (Francis - Floyd,
(http://www.hiroshima-u.ac.jp/gsbs/kenkyu_syokai/nakai/index.html)
Là vi khuẩn kị khí, tăng trưởng chậm trong môi trường nuôi cấy, cần từ 36 -
48 giờ ở 28 - 30 o C để phát triển mọc thành khuẩn lạc nhỏ, tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng ở 37 o C (Valerie et al, 1993) Edwardsiella ictaluri có khả năng gây dung huyết Nhưng dấu hiệu của sự dung huyết chỉ xuất hiện một vùng hẹp xung quanh khuẩn lạc (Waltman et al, 1985)
Một số đặc điểm sinh hóa của E ictaluriđược trình bày qua bảng 2.2
Bảng 2.2 Một số đặc điểm sinh hóa của Edwardsiella ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006) Đặc điểm sinh hóa Edwardsiella ictaluri
Sinh H 2 S trong triple sugar iron -
Sinh H 2 S trong peptone iron agar -
Edwardsiella ictaluri có khả năng làm thoái hóa chondroitin sulfate nhờ vào enzyme chondroitinase (Blazer, 1985), gây dung huyết (hemolysins) (Waltman et al, 1985)
Edwardsiella ictaluri khả năng đề kháng với muối mật
Khả năng chịu muối kém, không phát triển được ở môi trường dinh dưỡng có nồng độ muối khoảng 2 - 3% (Waltman et al, 1985)
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2003), Edwardsiella ictaluri kháng lại Oxytetracyline, Oxolinic acid, nhóm Sulfonamide; tỉ lệ đề kháng với Bactrime là 100% và Colistin là 97,9% (Trương Ngọc Loan và ctv, 2007)
Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ ở cá tra Với các triệu chứng như: mắt hơi lồi, không biểu hiện xuất huyết, gan ,thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng (nhẹ); xuất huyết toàn thân, không phản ứng với tiếng động, bỏ ăn, cá thường nhào lộn hoặc xoay tròn (nặng) Số lượng cá chết ngày càng cao và tỉ lệ tăng dần (http://www.vemedim.vn)
* Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Edwardsiella tarda thuộc họ Enterobacteriaceae có một số đặc điểm: hình que mảnh, gram õm, kớch thước 1 ì 2 – 3 àm, khụng sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao (Bùi Quang Tề, 2006)
Khuẩn lạc nhỏ, phát triển ở 24 - 48 giờ sau khi cấy môi trường, ủ 28 - 30 o C thì Edwardsiella tarda mọc nhanh hơn Edwardsiella ictaluri (Plumb et al, 1989)
(http://www.fws.gov/wildfishsurvey/regionalpath.htm)
Một số đặc điểm sinh hóa của E tarda được trình bày qua bảng 2.3
Bảng 2.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Edwardsiella tarda (Bùi Quang Tề, 2006) Đặc điểm sinh hóa Edwardsiella tarda
Sinh H 2 S trong triple sugar iron +
Sinh H 2 S trong peptone iron agar +
Edwardsiella tarda không sinh nội độc tố như các vi khuẩn Gram âm khác, nhưng nó sinh 2 ngoại độc tố, đây là nguyên nhân gây tổn thương (Plumb et al,
Edwardsiella tarda có khả năng làm tan huyết do tiết cytotoxin
(http://www3.interscience.wiley.com)
Edwardsiella tarda phát triển được trong môi trường muối 3% và ở nhiệt độ
40 o C nên có thể tách riêng được với Edwardsiella ictaluri (Waltman et al, 1985)
Ewardsiella tarda kháng lại Oxytetracycline (Plumb et al, 1989)
E tarda kháng tự nhiên đối với nhóm kháng sinh benzylpenicillin
(http://www.mekongfish.net.vn)
Edwardsiella tarda gây bệnh viêm ruột dạ dày cấp tính, tiêu chảy dạng phân lỏng, kiết lỵ Đối với bệnh nhân bị tổn thương hệ miễn dịch, người lớn tuổi, trẻ em thường bị nhiễm Edwardsiella tarda Nhiễm bệnh dạng bên ngoài đường tiêu hóa như nhiễm trùng máu với tỉ lệ tử vong tương đương 50% Edwardsiella tarda cũng gây viêm màng não, viêm phúc mạc, viêm tủy, abscess ở gan (Janda et al, 1993)
Edwardsiella tarda gây bệnh nhiễm khuẩn huyết với những triệu chứng: các vết thương tổn nhỏ 3 – 5 mm trên da, nằm ở mặt lưng và hai bên cơ thể Các vết
- không đi sắc tố bình thường Từ cá bệnh tỏa ra mùi hôi thối do các vết thương tổn chứa mô bị hoại tử Ở bên trong cơ thể gan thận xung huyết phù nề bởi các vết hoại tử Quan sát mô bệnh học cho thấy các vết thương tổn được đặc trưng bởi sự hoại tử, thường phát triển ở mô cơ, mô tạo máu và mô gan (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)
* Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae có hình que thẳng, hai đầu trũn, kớch thước dài từ 2-3 àm, rộng 0,5 àm, di động, khụng sinh nha bào, cú thể cú vỏ (Hoàng Thủy Nguyên và ctv, 1974)
(http://www.foxnews.com/ /4_61_bacteria_e_coli.jpg)
Chuyển hóa đường: E coli lên men rất nhiều loại đường: glucoza, levuloza, galactoza, xyloza, lactoza kèm sinh hơi Trừ adonit và inozit là E coli không lên men
Các E coli có phản ứng sinh indol (I) (+), decarboxyla đối với lyzin, ocnitin, acginin và axit glutamic, betaglactozidaza (+)
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thử hoạt tính khánh khuẩn của 3 loại cao RS, TG và TDL
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 3 loại cao RS, TG và TDL.
PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
Thời gian thí nghiệm: từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 04 năm 2009 Địa điểm:
Phòng thí nghiệm Dược lý, phòng thí nghiệm Vi sinh - Bộ môn Thú y Phòng thí nghiệm Sinh hóa - Bộ môn Sinh hóa
Phòng thí nghiệm Chuyên Sâu - trường Đại học Cần Thơ
RS: bộ phận dùng là thân cây và lá
TG: bộ phận dùng là thân cây và lá TDL: bộ phận dùng là lá Địa điểm: mẫu được thu hái vào buổi sáng (8-10 giờ) tại huyện Mang Thít - tỉnh Vĩnh Long
Hóa chất dùng để chiết xuất cao: methanol
Hóa chất dùng cho thử nghiệm vi sinh vật:
Dung môi DMSO Nước cất
Nước muối sinh lý (nồng độ 0,9%) Môi trường NA (Nutrient agar), MHA (Muller Hinton agar) Cồn 96 o , cồn 70 o
3.2.4 Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy dụng cụ thủy tinh (Classware Drying Oven)
Máy cô quay chân không
Cân điện tử, bình nón, phễu, đũa thủy tinh, đĩa petri, que cấy, ống nghiệm,
Các chủng vi khuẩn được viện Pasteur- Tp Hồ Chí Minh cung cấp:
Chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda 280208 Chủng Aeromonas hydrophila 011004
Chủng Staphylococcus aureus 081008 Chủng Streptococcus faecalis 010408 Chủng Escherichia coli 101008 Chủng Pseudomonas aeruginosa 111008 Chủng Salmonella spp 291003
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Điều chế cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần Dầy Lá
3.3.1.1 Chiết xuất cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần Dầy Lá Áp dụng phương pháp chiết xuất nhằm thu lấy dịch chiết thô (Huỳnh Kim Diệu, 2008)
Tên thuốc: cao RS, cao TG, cao TDL
Cao được chiết xuất bằng cách: thân lá (RS, TG), lá (TDL) thu hái vào buổi sáng, rửa sạch không còn tạp chất bẩn, sấy khô ở 50 o C đến khi trọng lượng không đổi, nghiền nhỏ thành bột, ngâm trong methanol 3 ngày, chiết lấy dịch chiết, sau đó tiếp tục ngâm bằng methanol trong 2 ngày (sau 24 giờ thì chiết 1 lần) Loại dung môi trong dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay đến khi có trọng lượng không đổi, thu được cao thô và dùng thử hoạt tính kháng sinh
3.3.1.2 Tính hiệu suất của 3 loại cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần DầyLá
Hiệu suất (HS%)của cao được tính theo công thức: msau cô quay
3.3.1.3 Tính ẩm độ của 3 loại cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần Dầy Lá Áp dụng theo phương pháp sấy khô (Lưu Hữa Mãnh và Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 1997)
Chén dùng để đựng mẫu được sấy ở nhiệt độ 105 o C cho đến khi cân 3 lần có trọng lượng không đổi (sai số cho phép là 3%) được trọng lượng chén sau sấy
Cân 1 g mẫu vào chén đem sấy ở nhiệt 105 o C đến khi có trọng lượng không đổi được trọng lượng chén và mẫu sau sấy
+ Vật chất khô (DM%) của cao
+ Ẩm độ của cao (H%) H% = 100% – DM%
Từ ẩm độ trên qui về 100% vật chất khô theo công thức sau
3.3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn Áp dụng theo quy trình của đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2005)
Sử dụng thang độ đục Mac Facland 0,5 được pha chế như sau: thêm 0,5ml BaCl 2 0,048 M (cân BaCl 2 2H 2 O 11,75 g trong 1000 ml H 2 O cất) vào 99,5 ml
H 2 SO 4 0,18 M (1%) đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền dịch Điều chỉnh độ đục của huyền dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng
Phân phối thành các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn bị vi sinh vật, mỗi ống 4 – 6 ml huyền dịch, nút chặt
Chuẩn độ đục được bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng, trước khi sử dụng phải lắc mạnh để huyền dịch phân tán đều trở lại Nếu thấy lợn cợn phải loại bỏ Hàng tháng phải kiểm tra lại độ hấp thu (Nguyễn Thanh Bảo và ctv, 2005)
Vi khuẩn được nuôi trên môi trường NA ủ 28 – 30 o C trong 24 – 48 giờ đối với nhóm Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ trong 24 giờ ở 37 o C đối với các chủng sau: S aureus, S faecalis, E coli, P aeruginosa, Salmonella spp., A hydrophila
Dùng que cấy đã được làm tiệt trùng lấy riêng một ít khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn trên và cho vào các ống nghiệm chứa dung dịch NaCl 0,9% có cùng kích thước với ống chuẩn độ đục, sau đó khuấy đều các ống này để vi khuẩn phân m sau sấy – m chén
Ghi chú: H%: ẩm độ; DM%: vật chất khô
Ghi chú: H%: ẩm độ; DM%: vật chất khô; m: khối lượng bố đều trong dung dịch Điều chỉnh độ đục của các ống nghiệm dùng chuẩn độ vi khuẩn sao cho bằng với ống chuẩn độ đục Mac Facland 0,5 để mật độ của ống vi khuẩn đạt 10 8 CFU/ml
Các chủng vi khuẩn khác nhau được chuẩn độ vi khuẩn ở những ống khác nhau theo cùng nguyên tắc so màu với chuẩn độ đục Mac Facland 0,5 Các ống chuẩn độ vi khuẩn này (đã được pha loãng đến 10 6 CFU/ml) được dùng để thử hoạt tính kháng sinh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao (Charu Gupta et al, 2008)
Vi khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục nên được sử dụng trong vòng 15 phút
3.3.2.3 Thử tính kháng khuẩn Áp dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (bằng khoanh giấy) để thử tính kháng khuẩn (Nguyễn Hữu Bảy và ctv, 1986)
Cân 0,5 g mỗi loại cao RS, TG và TDL sau đó hòa tan riêng mỗi loại này vào
1 ml dung môi DMSO đã được tiệt trùng, lần lượt được các dung dịch gốc của cao
RS, TG và TDL cùng nồng độ 500 mg/ml Sử dụng nồng độ của các loại cao này để thử hoạt tính kháng khuẩn
Dùng máy bấm giấy lọc thành các đĩa giấy hình tròn có đường kính là 5mm, hấp tiệt trùng các đĩa giấy này bằng Autoclave, tiếp theo đem sấy khô và để nguội Dựng micropipette lần lượt rỳt 10 àl cỏc dung dịch gốc của cỏc cao cú nồng độ 500 mg/ml ở trên tẩm riêng và đều vào các đĩa giấy, các đĩa giấy được tẩm các loại cao khác nhau phải được để riêng, sau đó đem sấy khô ở 45 o C và để nguội để dùng thử hoạt tính kháng sinh của các loại cao này
Dùng tăm bông vô khuẩn tẩm huyễn dịch trong ống đã được chuẩn độ vi khuẩn với nồng độ 10 6 CFU/ml, đè tăm bông lên thành ống nghiệm để ép hết nước Sau đó dùng tăm bông này quét nhẹ lên khắp mặt thạch từ trái sang phải, từ trên xuống dưới để được vi khuẩn trải đều trên mặt thạch, tiếp tục ta xoay hộp đĩa petri
90 o , một lần nữa đánh đều tăm bông lên khắp mặt thạch cũng từ trái qua phải, từ trên xuống dưới và cuối là kéo tăm bông theo vòng mặt rìa của đĩa petri Thao tác này lập lại 3 lần Để yên chờ mặt thạch khô Thực hiện đối với các chủng vi khuẩn còn lại
Quá trình thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao RS, TG và TDL được tiến hành trên 8 chủng vi khuẩn: Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, S aureus, S faecalis, E coli, P aeruginosa, Salmonella spp., A hydrophila cấy cả 8 chủng vi khuẩn này trên 8 đĩa petri khác nhau để thử nghiệm
Dùng kẹp đã được tiệt trùng bằng đèn cồn, để nguội và lần lượt gắp 3 đĩa giấy có tẩm 3 loại cao RS, TG và TDL và đĩa giấy đối chứng chứa DMSO không có trên sao cho khoảng cách giữa chúng đều nhau trên mặt thạch Đặt tất cả các đĩa petri vào tủ lạnh ở 4 o C trong vòng 6 giờ Sau đó đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 –
30 o C trong 24 – 48 giờ đối với chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ trong 24 giờ ở 37 o C đối với các chủng sau: S aureus, S faecalis, E coli, P aeruginosa, Salmonella spp., A hydrophila
3.3.2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu
* Chuẩn bị nồng độ chất thử Áp dụng theo phương pháp pha loãng liên tiếp trên MHA (Nguyễn Thanh Bảo và ctv, 2005)
Lần lượt cân 800 mg cao RS, TG và TDL sau đó hòa tan riêng mỗi loại cao này vào 10 ml dung môi DMSO đã được tiệt trùng, ta được dung dịch gốc có nồng độ 80 mg/ml, pha loãng dung dịch gốc sao cho tạo thành các nồng độ trong môi trường thử nghiệm (cú nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ trước) như sau: 4096 àg/ml,
2048 àg/ml, 1024 àg/ml, 512 àg/ml, 256 àg/ml, 128 àg/ml Khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đoán của chất thử
Lần lượt trộn riêng các chất thử nghiệm này vào môi trường thạch MHA đã nấu chảy và để nguội đến 48 – 50 o C, lắc để đảm bảo trộn đều chất thử trong môi trường thạch, đổ riêng vào đĩa petri đối với từng loại chất thử và để cho thạch đông lại
* Tiến hành cấy vi khuẩn
Dựng micropipette lần lượt lấy 1 àl huyền dịch cỏc vi khuẩn đó chuẩn độ và cấy lên bề mặt môi trường thạch có chứa chất thử nghiệm
Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất Mỗi chủng vi sinh vật được cấy thành một chấm Khi thay đổi các chủng vi khuẩn thì thay đổi đầu cấy Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda được cấy trên cùng 1 đĩa petri và 6 chủng vi khuẩn còn lại được cấy cùng trên một đĩa petri