CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Điều chế cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần Dầy Lá 3.3.1.1 Chiết xuất cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần Dầy Lá
Áp dụng phương pháp chiết xuất nhằm thu lấy dịch chiết thô (Huỳnh Kim Diệu, 2008).
Tên thuốc: cao RS, cao TG, cao TDL.
Cách tiến hành:
Cao được chiết xuất bằng cách: thân lá (RS, TG), lá (TDL) thu hái vào buổi sáng, rửa sạch không còn tạp chất bẩn, sấy khô ở 50oC đến khi trọng lượng không đổi, nghiền nhỏ thành bột, ngâm trong methanol 3 ngày, chiết lấy dịch chiết, sau đó tiếp tục ngâm bằng methanol trong 2 ngày (sau 24 giờ thì chiết 1 lần). Loại dung môi trong dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay đến khi có trọng lượng không đổi, thu được cao thô và dùng thử hoạt tính kháng sinh.
3.3.1.2 Tính hiệu suất của 3 loại cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần DầyLá Hiệu suất (HS%)của cao được tính theo công thức:
msau cô quay
HS% = x lượng100 mtươi
3.3.1.3 Tính ẩm độ của 3 loại cao Rau Sam, Thuốc Giòi và Tần Dầy Lá
Áp dụng theo phương pháp sấy khô (Lưu Hữa Mãnh và Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 1997).
Cách tiến hành
Chén dùng để đựng mẫu được sấy ở nhiệt độ 105o C cho đến khi cân 3 lần có trọng lượng không đổi (sai số cho phép là 3%) được trọng lượng chén sau sấy.
Ghi chú: m khối lượng.
Cân 1 g mẫu vào chén đem sấy ở nhiệt 105oC đến khi có trọng lượng không đổi được trọng lượng chén và mẫu sau sấy.
+ Vật chất khô (DM%) của cao
+ Ẩm độ của cao (H%) H% = 100% – DM%
Từ ẩm độ trên qui về 100% vật chất khô theo công thức sau DM100%= H% x mcao
3.3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Áp dụng theo quy trình của đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh (2005).
3.3.2.1 Chuẩn độ đục
Sử dụng thang độ đục Mac Facland 0,5 được pha chế như sau: thêm 0,5ml BaCl2 0,048 M (cân BaCl2.2H2O 11,75 g trong 1000 ml H2O cất) vào 99,5 ml H2SO4 0,18 M (1%) đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền dịch.
Điều chỉnh độ đục của huyền dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng 625 nm nằm trong khoảng 0,08 – 0,1.
Phân phối thành các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn bị vi sinh vật, mỗi ống 4 – 6 ml huyền dịch, nút chặt.
Chuẩn độ đục được bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng, trước khi sử dụng phải lắc mạnh để huyền dịch phân tán đều trở lại. Nếu thấy lợn cợn phải loại bỏ.
Hàng tháng phải kiểm tra lại độ hấp thu (Nguyễn Thanh Bảo và ctv, 2005).
3.3.2.2 Chuẩn độ vi khuẩn
Vi khuẩn được nuôi trên môi trường NA ủ 28 – 30oC trong 24 – 48 giờ đối với nhóm Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ trong 24 giờ ở 37oC đối với các chủng sau: S. aureus, S. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella spp., A.
hydrophila.
Dùng que cấy đã được làm tiệt trùng lấy riêng một ít khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn trên và cho vào các ống nghiệm chứa dung dịch NaCl 0,9% có cùng kích thước với ống chuẩn độ đục, sau đó khuấy đều các ống này để vi khuẩn phân
msau sấy – mchén
DM% = x100
mmẫu
Ghi chú: m khối lượng.
Ghi chú: H%: ẩm độ; DM%: vật chất khô
Ghi chú: H%: ẩm độ; DM%: vật chất khô; m: khối lượng.
bố đều trong dung dịch. Điều chỉnh độ đục của các ống nghiệm dùng chuẩn độ vi khuẩn sao cho bằng với ống chuẩn độ đục Mac Facland 0,5 để mật độ của ống vi khuẩn đạt 108 CFU/ml.
Các chủng vi khuẩn khác nhau được chuẩn độ vi khuẩn ở những ống khác nhau theo cùng nguyên tắc so màu với chuẩn độ đục Mac Facland 0,5. Các ống chuẩn độ vi khuẩn này (đã được pha loãng đến 106 CFU/ml) được dùng để thử hoạt tính kháng sinh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao (Charu Gupta et al, 2008).
Vi khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục nên được sử dụng trong vòng 15 phút.
3.3.2.3 Thử tính kháng khuẩn
Áp dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (bằng khoanh giấy) để thử tính kháng khuẩn (Nguyễn Hữu Bảy và ctv, 1986).
Tiến hành:
Cân 0,5 g mỗi loại cao RS, TG và TDL sau đó hòa tan riêng mỗi loại này vào 1 ml dung môi DMSO đã được tiệt trùng, lần lượt được các dung dịch gốc của cao RS, TG và TDL cùng nồng độ 500 mg/ml. Sử dụng nồng độ của các loại cao này để thử hoạt tính kháng khuẩn.
Dùng máy bấm giấy lọc thành các đĩa giấy hình tròn có đường kính là 5mm, hấp tiệt trùng các đĩa giấy này bằng Autoclave, tiếp theo đem sấy khô và để nguội.
Dựng micropipette lần lượt rỳt 10 àl cỏc dung dịch gốc của cỏc cao cú nồng độ 500 mg/ml ở trên tẩm riêng và đều vào các đĩa giấy, các đĩa giấy được tẩm các loại cao khác nhau phải được để riêng, sau đó đem sấy khô ở 45oC và để nguội để dùng thử hoạt tính kháng sinh của các loại cao này.
Dùng tăm bông vô khuẩn tẩm huyễn dịch trong ống đã được chuẩn độ vi khuẩn với nồng độ 106 CFU/ml, đè tăm bông lên thành ống nghiệm để ép hết nước.
Sau đó dùng tăm bông này quét nhẹ lên khắp mặt thạch từ trái sang phải, từ trên xuống dưới để được vi khuẩn trải đều trên mặt thạch, tiếp tục ta xoay hộp đĩa petri 90o, một lần nữa đánh đều tăm bông lên khắp mặt thạch cũng từ trái qua phải, từ trên xuống dưới và cuối là kéo tăm bông theo vòng mặt rìa của đĩa petri. Thao tác này lập lại 3 lần. Để yên chờ mặt thạch khô. Thực hiện đối với các chủng vi khuẩn còn lại.
Quá trình thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao RS, TG và TDL được tiến hành trên 8 chủng vi khuẩn: Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, S.
aureus, S. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella spp., A. hydrophila cấy cả 8 chủng vi khuẩn này trên 8 đĩa petri khác nhau để thử nghiệm.
Dùng kẹp đã được tiệt trùng bằng đèn cồn, để nguội và lần lượt gắp 3 đĩa giấy có tẩm 3 loại cao RS, TG và TDL và đĩa giấy đối chứng chứa DMSO không có
trên sao cho khoảng cách giữa chúng đều nhau trên mặt thạch. Đặt tất cả các đĩa petri vào tủ lạnh ở 4oC trong vòng 6 giờ. Sau đó đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 24 – 48 giờ đối với chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ trong 24 giờ ở 37oC đối với các chủng sau: S. aureus, S. faecalis, E. coli, P.
aeruginosa, Salmonella spp., A. hydrophila.
3.3.2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu
* Chuẩn bị nồng độ chất thử
Áp dụng theo phương pháp pha loãng liên tiếp trên MHA (Nguyễn Thanh Bảo và ctv, 2005).
Tiến hành:
Lần lượt cân 800 mg cao RS, TG và TDL sau đó hòa tan riêng mỗi loại cao này vào 10 ml dung môi DMSO đã được tiệt trùng, ta được dung dịch gốc có nồng độ 80 mg/ml, pha loãng dung dịch gốc sao cho tạo thành các nồng độ trong môi trường thử nghiệm (cú nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ trước) như sau: 4096 àg/ml, 2048 àg/ml, 1024 àg/ml, 512 àg/ml, 256 àg/ml, 128 àg/ml. Khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đoán của chất thử.
Lần lượt trộn riêng các chất thử nghiệm này vào môi trường thạch MHA đã nấu chảy và để nguội đến 48 – 50oC, lắc để đảm bảo trộn đều chất thử trong môi trường thạch, đổ riêng vào đĩa petri đối với từng loại chất thử và để cho thạch đông lại.
* Tiến hành cấy vi khuẩn
Dựng micropipette lần lượt lấy 1 àl huyền dịch cỏc vi khuẩn đó chuẩn độ và cấy lên bề mặt môi trường thạch có chứa chất thử nghiệm.
Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất. Mỗi chủng vi sinh vật được cấy thành một chấm. Khi thay đổi các chủng vi khuẩn thì thay đổi đầu cấy. Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda được cấy trên cùng 1 đĩa petri và 6 chủng vi khuẩn còn lại được cấy cùng trên một đĩa petri.
Lần lượt tiến hành cấy các chủng vi khuẩn trên tất cả các môi trường chứa các loại cao thử nghiệm. Song song tiến hành các đĩa đối chứng không chứa chất thử và có chứa dung môi pha loãng (DMSO).
Để yên 15 phút cho vết chấm khô. Lật ngược hộp thạch đã cấy. Sau đó đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 24 – 48 giờ đối với chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ trong 24 giờ ở 37oC đối với các chủng sau: S.
aureus, S. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella spp., A. hydrophila.
3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi
Tính hiệu suất của các loại cao RS, TG, TDL.
Tính ẩm độ của các loại cao RS, TG, TDL.
Đọc kết quả thử tính kháng khuẩn bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn sau khi ủ 24 giờ ở 37oC đối với các chủng: S. aureus, S. faecalis, E. coli, P.
aeruginosa, Salmonella spp., A. hydrophila và 24 - 48 giờ ở 28 - 30oC đối với hai chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda.
Đọc kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) khi quan sát không thấy khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch sau khi ủ 24 giờ ở 37oC đối với các chủng: S.
aureus, S. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella spp., A. hydrophila và 24 - 48 giờ ở 28 - 30oC đối với hai chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda (MIC: minimum inhibitory concentration).
Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần.
CHƯƠNG 4