THU NHẬN ENZYM CELLULASE TỪ TRICHODERMA SP.

THU NHẬN ENZYM CELLULASE TỪ TRICHODERMA SP Đinh Thị Kim1, Nguyễn Thị Kim Tuyến1, Hồ Thiên Hồng1 1.Phòng thí nghiệm Hóa sinh-Sinh học phân tử , Đại học Cơng Nghiệp TP.HCM 1.Giới thiệu Những năm gần đây, nguồn lượng hóa thạch ngày cạn kiệt Dưới áp lực trên, nguồn lượng tái tạo quốc gia quan tâm Việc sử dụng cellulase Trichoderma viride để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose thành ethanol nghiên cứu áp dụng Việt Nam có nguồn sinh khối tự nhiên dồi Thêm vào đó, nước ta nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú đa dạng Trước tình hình trên, tiến hành nghiên cứu “Thu nhận enzym cellulase từ Trichoderma sp.” Enzym Cellulase phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose thơng qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid cellulose tạo sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men Nguồn thu enzym cellulase lớn vi sinh vật Trong đó, vi nấm Trichoderma nguồn thu enzym cellulase quan trọng enzym có hoạt tính cao thời gian nuôi cấy ngắn Chúng tiến hành khảo sát hoạt tính sinh enzym cellulase Trichoderma phân lập lại từ chế phẩm Trichoderma môi trường nuôi cấy: môi trường bán rắn (môi trường cám gạo), môi trường cám gạo bổ sung cỏ đóng vai trò chất cảm ứng sinh enzyme cellulase Trichoderma, môi trường bã đậu nành thay cho cám gạo có bổ sung cỏ Vật liệu phương pháp nghiên cứu: 2.1.Vi sinh vật điều kiện nuôi cấy: Trichoderma phân lập giữ giống 40C môi trường PGA Vi nấm nuôi cấy môi trường bán rắn erlen 250ml chứa 50g môi trường bao gồm cám gạo, bã đậu nành, cỏ Dung dịch Iod loãng, thuốc thử DNS, CMC, đệm acetate 2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzym: Để xác định hoạt tính enzym cellulose, chúng tơi sử dụng CMC (Carbonxyl Methyl Cellulose) làm chất Hệ enzym cellulose tác dụng lên CMC, phóng thích phân tử glucose, dựa vào lượng glucose xác định hoạt tính enzym cellulose 2.3 Thiết kế thí nghiệm ¾ Quy trình thực hiện: Phân lập vi sinh vật hiếu khí Định tính khả sinh enzym cellulase Trichoderma Lập đường chuẩn mật độ bào tử Trichoderma phương pháp đo quang bước sóng 610nm Dựa vào đường chuẩn, bổ sung bào tử Trichoderma vào môi trường nuôi cấy 106 bào tử/g mơi trường Xác định hoạt tính chung enzym cellulase phương pháp xác định hàm lượng đường khử (phương pháp Miler) ¾ Các khảo sát khả sinh enzym cellulase bố trí theo nghiệm thức: Mơi trường cám gạo (môi trường bán rắn bản) không bổ sung chất cảm ứng Môi trường cám gạo bổ sung cỏ nồng độ từ 1% đến 6% Môi trường bã đậu nành bổ sung cỏ nồng độ từ 1% đến 4% ¾ Mỗi nghiệm thức cấy Trichoderma ni nhiệt độ phòng sau 48 đến 60 giờ, Tiến hành khảo sát hoạt tính chung enzym cellulase theo thời gian nuôi cấy Kết biện luận: 3.1 Kết quả: ¾ Kết định tính khả sinh enzym cellulase Trichoderma: Chúng tơi tiến hành nuôi cấy Trichoderma môi trường Agar + CMC 1%, Sau ngày nuôi cấy, đo đường kính vòng phân giải 22mm Điều chứng tỏ chủng Trichoderma khảo sát có sinh enzym cellulase ¾ Kết khảo sát hoạt tính chung celulase mơi trường cám gạo: Nồng độ cỏ (%) Hoạt tính chung cellulase (đơn 37,351 40,327 52,976 54,216 57,688 39,831 42,808 Hoạt tính chung enzym cellulase (đvht/g canh trường) vị hoạt tính/g canh trường) 80 60 40 52.97654.21657.688 39.83142.808 37.35140.327 20 0 Lượng cỏ bổ sung vào môi trường nuôi cấy (%) Biểu đồ 1: Kết khảo sát hoạt tính chung cellulase mơi trường cám gạo ¾ Kết khảo sát hoạt tính chung celulase môi trường bã đậu nành: Nồng độ cỏ (%) Hoạt tính chung cellulase (đơn vị 52,480 78,026 61,409 68,849 Hoạt tính chung enzym cellulase (đvht/g canh trường) hoạt tính/g canh trường) 100 78.026 80 60 61.409 52.48 68.849 40 20 Lượng cỏ nămg bổ sung vào môi trường nuôi cấy (%) Biểu đồ 2: Kết khảo sát hoạt tính chung cellulase mơi trường bã đậu nành 3.2 Nhận xét: Trong mơi trường cám gạo, hoạt tính chung enzym cellulase chủng Trichoderma khảo sát cao nồng độ 4% cỏ với 57,688 đvht/g canh trường (gấp 1,54 lần so với mơi trường khơng có chất cảm ứng) Trong mơi trường bã đậu nành, hoạt tính chung enzym cellulase chủng Trichoderma khảo sát tăng so với mơi trường cám gạo Hoạt tính chung enzym cellulase cao môi trường bã đậu nành bổ sung 2% cỏ IV Kết luận: Trong môi trường nuôi cấy khơng có chất cảm ứng, chủng nấm mốc Trichoderma khảo sát có khả sinh tổng hợp enzym cellulase Nếu bổ sung vào môi trường chất cảm ứng cellulose nồng độ thích hợp, Trichoderma có khả sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao Điều phù hợp với nghiên cứu tác giả trước Trichoderma sinh enzym cellulase tăng mơi trường có chất cảm ứng nồng độ thích hợp Chúng tơi chọn mơi trường bã đậu nành bổ sung 2% cỏ nuôi cấy Trichoderma thu enzym cellulase có hoạt tính cao thời gian ni cấy ngắn mơi trường lại khảo sát với 78,026 đvht/g canh trường 60 nuôi cấy Abstract The present study is concerned with the optimization of the cultural conditions of locally isolated mould cultures for the production of cellulose enzymes by both surface culture and submerged culture methods in conical flasks and stirred fomenter The cultures of Trichoderma sp however were best producer of cellulases The agricultural by products such as wheat bran, bagasse, rice straw, wheat straw, waste soybeen and grass etc were evaluated as substrate by both mould culture for the production of enzymes Of all the substrates tested, however, waste soybeen and grass was found to be an ideal substrate providing all the nutrients for the synthesis of cellulases High cellulsse activity (78,026U/g substrate) activities were detected in the culture include waste soybeen and grass 2% Acknowledgements This work was supported from Deparment of Biochemistry , HCM University of Natural sciences We thank Dinh Minh Hiep for provide us with Trichoderma sp Tài liệu tham khảo: Allen, A L., and C D Roche (1989), Effects of strain and fermentation conditions on production of cellulase by Trichoderma reesei Biotechnol.Bioeng 33:650–656 Bailey,M J., and K.M H Nevalainen 1981 Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase Enzyme Microb Technol 3:153–157 Penttila, M., P Lehtovaara, H Nevalainen, R Bhikhabhai, and J Knowles.1986 Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene Gene 45:253– 263 Phạm Thị Ánh Hồng (2001) Kỹ thuật sinh hoá, NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết - Thí nghiệm Công nghệ sinh học tập Nguyễn Đức Lượng, Cao Tường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền - Công nghệ enzym, NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Trần Linh Thước - Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo Dục, 2003 Lê Thị Hồng Nga – Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc¸ Luận văn thạc sĩ sinh học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM, 2005 Võ Thị Thu Trâm - Khảo sát hoạt tính enzym cellulose tách chiết từ hệ sợi nấm bào ngư (Pleurotus Sp) nuôi cấy môi trường bã khoai mì, Khóa luận cử nhân sinh học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM, 2004 Tài liệu internet: 10 http://baigiang.bachkim.vn/presentation/show/pr_id/40540 11 http://bdu.edu.vn/webbdu/DiễnđànSinhViên/tabid/54/forumid/23/Scope/thre ads/Default.aspx 12 http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm#3.2.3.1development of process for high titer cellulase production 13 http://www.h2vn.com/community/index.php?topic=5416.msg37045 14 www.sigmaaldrich.com/img/assets/22940/Plant_L 15 http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1839 16 http://www.sinhhocvietnam.com/ 17 http://www.thuvienhoasen.org/anchay-21-daunanh.htm 18 http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_t%C6%B0%C6%A1 ng 19 http://wapedia.mobi/vi/Danh_ph%C3%A1p_khoa_h%E1%BB%8Dc 20 http://wapedia.mobi/vi/Eleocharis_acicularis 21 http://wapedia.mobi/vi/H%C3%ACnh:Eleocharis_dulcis_Blanco1.15.jpg 22 http://xttm.agroviet.gov.vn/images/Nong nghiep/Tieu/QNtrongtieu1small.jpg 23 www.enzymeindia.com/enzymes/hemicellulase.asp ... tác giả trước Trichoderma sinh enzym cellulase tăng mơi trường có chất cảm ứng nồng độ thích hợp Chúng tơi chọn mơi trường bã đậu nành bổ sung 2% cỏ nuôi cấy Trichoderma thu enzym cellulase có... chủng nấm mốc Trichoderma khảo sát có khả sinh tổng hợp enzym cellulase Nếu bổ sung vào môi trường chất cảm ứng cellulose nồng độ thích hợp, Trichoderma có khả sinh tổng hợp enzym cellulase có... tính khả sinh enzym cellulase Trichoderma: Chúng tiến hành nuôi cấy Trichoderma môi trường Agar + CMC 1%, Sau ngày ni cấy, đo đường kính vòng phân giải 22mm Điều chứng tỏ chủng Trichoderma khảo