Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

Header Page of 120 ViiÖn khoa häc Bé khoa học công nghệ việt nam công nghệ Viện Công nghệ Sinh học V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội V.KHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Đề tài Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Trần Bình 6288 25/01/2007 Hà Nội, 2006 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 ViiÖn khoa häc công nghệ việt nam Bộ khoa học công nghƯ ViƯn C«ng nghƯ Sinh häc V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH -V.KHCNVN V.CNSH B¸o c¸o tổng kết Đề tài Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc Tăng cờng tính chống chịu cải tiến chất lợng giống lúa công nghệ sinh học thực vật Chủ nhiệm Đề tài: PGS TS Lê Trần Bình Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Cơ quan chủ quản: Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Thêi gian thùc hiƯn: 2002 - 2005 Hµ Néi, 2006 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 LLờ ờii ccảảm mơ ơnn Trong khuôn khổ hợp tác song phương khoa học công nghệ CHLB Đức Việt Nam lĩnh vực cơng nghệ sinh học trọng lĩnh vực ưu tiên Tuy nhiên, hầu hết nội dung hợp tác đối tác Việt Nam đối tác Đức bật nội dung nặng chuyển giao công nghệ đào tạo nguồn nhân lực Lần lĩnh vực công nghệ sinh học có đề tài mà hai bên đối tác muốn tập trung khai thác thành tựu giới Giải mã genom lúa nước Đó lý quốc gia Đức, không trồng lúa nước đồng ruộng tự nhiên mà lại quan tâm đến nghiên cứu lúa nước Vì việc xây dựng đề tài đối ứng với Viện đầu ngành sinh học phân tử thực vật Viện Max Planck Sinh lý thực vật phân tử, Golm hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang Đào tạo nghiên cứu, CHLB Đức hỗ trợ hợp tác CƠ QUAN CHỦ TRÌ VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC PHĨ VIỆN TRƯỜNG CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI PGS.TS Trương Nam Hải PGS TS Lê Trần Bình Đề tài hợp tác Việt - Đức luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 i Header Page of 120 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic axít ADC Arginindecarboxylase APS Ammonium persulfate RNAse RNA polymerase ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine serum albumin Bc Bacillus cereus bp base pair Bt Bacillus thuringiensis CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor cDNA Complementary DNA CHLB Cộng Hoà Liên Bang CGS Cystathionin gamma-Synthase cry Crystal gene = Gen mã hố protein tinh thể độc tố diệt trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis DNA Deoxyribonucleic axít DAO Diaminoxidase DNAse DNA polymerase EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br Ethidium Bromide FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-TOF-MS Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers GCN Guanidium thiocyanate GUS β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase HSK Homoserine kinase HPLC High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp IRRI International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IPTG Isopropylthio-o-D-galacuan an -kinh te -Footer Page 133 of 120 11 Header Page 134 of 120 Hình 3.10: Hiệu hoạt động cặp mồi dùng phản ứng RT-PCR nhân đoạn gen điều khiển RNA tách chiết từ lúa Độ nhạy phản ứng RT-RT-PCR kiểm tra phép pha loãng nồng độ dung dịch RNA khuôn mẫu Với loại mẫu RNA thu từ loại mô khác cho thấy có mối tương quan tỷ lệ thuận tịnh tiến tốc độ phản ứng (Hình 3.11) Hình 3.11: Độ nhạy phản ứng RT-RT-PCR với mẫu RNA thu từ thân (trái) rễ (phải) mạ Trong nghiên cứu tiếp theo, mức độ biểu gen cảm ứng mạnh tác động khô hạn muối đánh giá Số liệu tính tốn xử lý bảo đảm ngun tắc thống kê Sau xử lý mặn áp suất thẩm thấu cao thấy có số gen chọn lựa tăng mức độ biểu hiện, đồng thời phát xuất nhiều nhóm ABRE-Cis đoạn điều khiển (promotor) gen TF (Hình 3.12) Hình 3.12: Đánh giá mức độ biểu gen điều khiển liên quan đến tính chịu mặn lúa kỹ thuật RT-RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế theo số liệu thu từ ngân hàng gen lúa Trên sở kết bước đầu, nguồn mồi đặt công ty MWG sản xuất nhằm sàng lọc cách có hệ thống yếu tố điều khiển 3.2.2 Xây dựng phương pháp: Áp dụng kỹ thuật trồng lúa xử lý hạn giống lúa Việt Nam thuộc loài phụ Indica Qui trình phân lập RNA từ mẫu mơ mạ xử lý 3.2.3 Xử lý hạn: Hai giống CR203 DR2 chọn để tiến hành xử lý hạn thơng qua rút dịch ni bình ni thủy canh Bộ phận rễ, thân thu hoạch để tách chiết RNA Đáng lưu ý RNA bắt đầu bị phân hủy sau xử lý 12 Vì thời gian xử lý chọn tối ưu cho nghiên cứu phút, 60 phút 360 phút với điều kiện có khơng có xử lý hạn RNA sau phân lập tổng hợp thành cDNA để tiến hành đo đạc RT-RT-PCR luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 134 of 120 12 Header Page 135 of 120 3.2.4 Xử lý muối Hình 3.13: Kiểm tra đánh giá chất lượng cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ đặc hiệu hiệu nhân đoạn gen điều khiển cDNA từ RNA mạ Biểu đồ phản ứng theo thời gian Hình 3.14: Kiểm tra đánh giá chất lượng cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ đặc hiệu hiệu nhân đoạn gen điều khiển cDNA từ RNA mạ Biểu đồ tốc độ phản ứng Hai giống Chăm DR2 chọn để xử lý hai điều kiện 0mM NaCl 100mM NaCl theo thời điểm phút, 30 phút 180 phút Nhằm giảm thiểu sai số thí nghiệm, 30 000 hỗn hợp phản ứng PCR chuẩn bị lần thiết bị “Evolution P3 Pipeting Platform” (Perkin ElmerTM) Kết RT-RT-PCR dạng “đồ thị nhân bản” dạng đồ thị tốc độ phản ứng trình bày Hình 3.13 Kết tổng thể thí nghiệm đánh giá hiệu cặp mồi thể biểu đồ Hình 3.14, cặp mồi không cho sản phẩm nhân gen không tính đến, cặp mồi bị loại khỏi tập hợp mồi dùng cho thí nghiệm Hình 3.15: Hiệu hoạt động cặp mồi chuyên dụng dùng phản ứng RT-RT-PCR đánh giá mức độ biểu gen điều khiển RNA tách chiết từ hai giống lúa xử lý mặn Hình 3.16 Tần suất lặp lại kết đánh giá mức độ biểu gen điều khiển RNA tách chiết từ hai giống lúa xử lý mặn phản ứng RTRT-PCR đánh giá Cơng thức tính tốn biến động mức độ biểu gen trình bày sau: ∆Ct = Ct gen quan tâm – Ct gen house-keeping ∆∆Ct = ∆Ct condition1 − ∆Ct condition (1 + E) ∆∆Ct = Lần biến đổi (Tăng/giảm) Mức độ biến động thí nghiệm lặp lại giá trị biểu gen thời điểm t=0min, nồng độ NaCl 0mM 100mM biểu thị dạng log ( FoldChange ) (Hình 3.16) Mặt khác, để tránh tác động học trình biểu gen xuất thơng qua thiết kế thí nghiệm, số liệu mức độ biểu gen đối chứng nồng độ muối 0mM sau thời gian 30 phút 180 phút tính tốn hai giống lúa tham gia thí nghiệm Giá trị ký hiệu là: “gen cảm ứng tiếp xúc” Tất gen có giá trị lặp lại log2(FoldChange)>1.5 xếp vào nhóm “cảm ứng tiếp xúc” Tổng số 788 gen đánh giá theo cách thức kết trình luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 135 of 120 13 Header Page 136 of 120 bày Hình 3.17 Hình 3.17: Sự phân bố tần suất gen “cảm ứng tiếp xúc” giống lúa tham gia thí nghiệm điều kiện đối chứng khơng có muối vào thời điểm 30 180 phút Hình 3.18: Sự phân bố tần suất gen chịu tác động cảm ứng ức chế tác động mặn giống lúa tham gia thí nghiệm điều kiện có muối (100mM) vào thời điểm 30 180 phút Có gen cảm ứng hai giống Chăm DR2, có gen cảm ứng riêng giống Hình 3.19: Tác động mặn (NaCl) lên độ dẫn điện dịch bào mạ hai giống DR2 Chàm bị xử lý thời gian khác từ đến 24 h Kết đánh giá mức độ biểu đoạn gen điều khiển (Hình 3.18) mạ bị xử lý mặn hai thời điểm cho thấy với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần kích thích ức chế có đến 12%, tức 313 gen số 2512 gen coi cảm ức ức chế mặn Việc lựa chọn gen để phân tích thực nhờ có dòng “loại-gen = knout-out = KO” Hiện nay, giới có tất ngân hàng dòng KO Đó là: (1) NIAS Tos17 đột biến ghép - insertion mutants, Nhật Bản; (2) Genoplante oryza tag lines, Pháp; (3) POSTECH RISD, Hàn Quốc; (4) RIFGP T-DNA, Trung Quốc Trong 52 gen kết luận tìm thấy vài dòng KO ngân hàng Mặt khác, việc lựa chọn gene nhằm tìm chế liên quan đến gen chịu tác động chọn lọc riêng gen đặc hiệu giống có biểu cảm ứng ức chế mặn chọn lọc cho nghiên cứu Ngưỡng gia tăng hoạt động biểu chọn abs(log2(FoldChange))>3.32 trường hợp abs(log2(FoldChange))