Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân lơxêmi cấp dòng tủy

Để đánh giá vai trò của 2 đột biến gen NPM1 và FLT3 trong tiên lượng và điều trị bệnh nhân LXMc dòng tủy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen NPM1 và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN HUY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2011 – 2015

HÀ NỘI - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN HUY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2011 – 2015

Người hướng dẫn khoa học:

Th.S NGUYỄN VŨ BẢO ANH

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin gửi lời cảm ơn tới Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Quang Vinh, chủ nhiệm Bộ

môn Huyết học Trường Đại học Y Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô trong Bộ môn đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Em xin gửi tới ThS Nguyễn Vũ Bảo Anh lòng kính trọng và biết ơn

sâu sắc, người thầy đã cho em những bài học đầu tiên về nghiên cứu khoa học, luôn tận tình dành thời gian quý báu và công sức chỉ bảo cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện tốt nhất cho e hoàn thành khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bác sỹ, các anh chị kỹ thuật viên đang làm việc tại khoa Tế bào tổ chức học, khoa Di truyền sinh học phân tử, phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bệnh nhân đã cung cấp cho em những

số liệu quý giá để thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, cổ vũ và động viên cả em học tập và hoàn thành khóa luận này

Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Văn Huy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, do nỗ lực của bản thân dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS Nguyễn Vũ Bảo Anh Các

số liệu, kết quả được trình bày trong nghiên cứu này là trung thực do tôi thu thập tỷ mỉ và chính xác tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

Kết quả nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích khoa học, không nhằm mục đích riêng nào khác

Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Văn Huy

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP 2

1.2 CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP 2

1.2.1 Sinh tế bào máu bình thường và LXMc 2

1.2.2 Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư 3

1.2.3 Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc 3

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc 5

1.3.1 Phương pháp hình thái học 5

1.3.2 Phương pháp hóa học tế bào 6

1.3.3 Phương pháp miễn dịch học 7

1.3.4 Phương pháp di truyền tế bào 7

1.3.5 Xếp loại LXMc 7

1.4 CÁC ĐỘT BIẾN GEN TRONG LXMc DÒNG TỦY 10

1.4.1 Đột biến gen NPM1 10

1.4.2 Đột biến gen FLT3 12

1.4.3 Một số đột biến gen khác 13

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 15

2.2.2 Nội dung và biến số nghiên cứu 15

2.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc dòng tủy 16

2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 21

2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 22

2.5 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU 23

3.1.1 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo tuổi 23

3.1.2 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo giới 24

3.1.3 Phân bố bệnh nhân theo thể bệnh FAB 24

3.2 ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3-TKD CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU 25

3.2.1 Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD 25 3.2.2 Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo giới 25

3.2.3 Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo nhóm tuổi 26

3.2.4 Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo xếp loại FAB 27

3.3 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC Ở BỆNH NHÂN CÓ CÁC ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3-TKD 28

3.3.1 Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA 28

3.3.2 Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD 30

3.3.3 Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD 32

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 34

4.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU 34

4.1.1 Đặc điểm về tuổi 344.1.2 Đặc điểm về giới 344.1.3 Đặc điểm phân bố thể bệnh của bệnh nhân theo xếp loại FAB 35

FLT3-TKD CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 354.2.1 Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và

FLT3-TKD trong nhóm nghiên cứu 35

FLT3-TKD theo giới 364.2.3 Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và

FLT3-TKD theo nhóm tuổi 37

FLT3-TKD theo xếp loại FAB 37

ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD, FLT3-TKD 384.3.1 Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen

NPM1-mutA 384.3.2 Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen

FLT3-ITD 394.3.3 Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen

FLT3-TKD 41

KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung 8

Bảng 1.2: Xếp loại LXMc dòng tủy theo WHO 2008 9

Bảng 3.1: Phân bố tuổi của nhóm nghiên cứu 23

Bảng 3.2: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD 25

Bảng 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo nhóm tuổi 26

Bảng 3.4: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo xếp loại FAB 27

Bảng 3.5: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA 29

Bảng 3.6: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD 31

Bảng 3.7: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD 33

Bảng 4.1: Tỷ lệ LXMc dòng tủy theo xếp loại FAB của một số tác giả 35

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính của nhóm nghiên cứu 24

Biểu đồ 3.2: Phân bố bệnh nhân theo xếp loại FAB 24

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD 25

Biểu đồ 3.4: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA 28

Biểu đồ 3.5: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD 30

Biểu đồ 3.6: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD 32

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST 11

Hình 1.2: Vị trí của gen FLT3 trên NST 12

Hình 2.1: Kết quả điện di trên gel của gen NPM1 21

Hình 2.2: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-ITD 21

Hình 2.3: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-TKD 21

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu 22

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi cấp (LXMc) là một bệnh lý ác tính không thuần nhất, bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy các tế bào non ác tính trong tủy xương và ở máu ngoại vi Những tế bào này lấn át và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các tế bào bình thường trong tủy xương [1]

Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã đề xuất phân loại LXMc dòng tủy dựa trên những biến đổi di truyền Một số gen đã được nghiên cứu và ghi nhận có vai trò quan trọng trong tiên lượng và đáp ứng điều trị bệnh Trong

đó, 2 đột biến gen đặc trưng cho LXMc dòng tủy là NPM1 và FLT3 [2]

Đột biến gen NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự năm

2005 Đột biến gen NPM1 gặp khoảng 50% bệnh nhân LXMc dòng tuỷ có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường và thường xuất hiện ở bệnh nhi (2-8%) Bệnh nhân có đột biến gen này thường có tiên lượng tốt [3]

Đột biến gen FLT3 gặp khoảng 30% bệnh nhân LXMc dòng tủy có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường Bệnh nhân có đột biến gen FLT3 có tiên lượng xấu ở cả người lớn lẫn trẻ em, hiệu quả điều trị thấp, tỷ lệ tái phát cao

và thời gian sống chung ngắn [4]

Để đánh giá vai trò của 2 đột biến gen NPM1 và FLT3 trong tiên lượng

và điều trị bệnh nhân LXMc dòng tủy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” với mục tiêu:

1 Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân LXMc dòng tủy tại viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

2 Mô tả đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP

Năm 1827, Velpeau thông báo ca bệnh đầu tiên Năm 1845, Bennett đã đặt tên cho bệnh là “leucocythemia” (tăng bạch cầu)

Năm 1856, nhà sinh lý bệnh người Đức Virchow đã dùng kính hiển vi quang học để soi tiêu bản máu bệnh nhân và ông đã thấy bạch cầu ở những bệnh nhân này tăng rất cao làm máu trắng như sữa Virchow gọi bệnh này là

“leukemia” (theo tiếng Hy lạp là bệnh máu trắng) hay tiếng Việt gọi là Lơ xê

mi, tên gọi này được sử dụng cho đến hiện nay

Năm 1877, nhờ vào phát minh nhuộm tiêu bản máu, Ehrlich đã phân biệt được những dạng khác nhau của bạch cầu

Năm 1889, Ebstein đã dùng thuật ngữ “acute leukemia” (lơ xê mi cấp)

để chỉ tình trạng bệnh tiến triển cấp tính Năm 1900, Naegeli đã chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy và dòng lympho Schilling đã phát hiện bệnh tổn thương đơn dòng mono năm 1913 Vào năm 1957, Gillestad đã mô tả bệnh lơ xê mi cấp tiền tủy bào lần đầu tiên

Đến nay, bằng các phương pháp hình thái học và hóa học tế bào, miễn dịch, di truyền chúng ta đã hiểu rõ và có cái nhìn cụ thể về bệnh lơ xê mi cấp

1.2 CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP

1.2.1 Sinh tế bào máu bình thường và LXMc

Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro, người ta phát hiện rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa, bắt nguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra các tế bào máu đa năng rồi tới tế bào máu đầu dòng cho từng dòng [5] Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là do

nhu cầu của cơ thể thông qua cơ chế điều khiển ngược mà đích tác động cuối cùng là gen có vai trò trong biệt hóa Khi có rối loạn một khâu nào trong dây chuyền này sẽ dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát được của tế bào, hoặc làm tế bào ngừng trưởng thành nhưng vẫn phân chia và dẫn đến LXMc [6]

1.2.2 Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư

Có hai hệ thống gen với các chức năng khác nhau, cùng phối hợp để kiểm soát sự tăng sinh ác tính, duy trì quá trình sống bình thường của tế bào

 Các gen ức chế khối u (anti - oncogene): Có vai trò ức chế sự phát triển của khối u Sự đột biến, sắp xếp lại hoặc chuyển đoạn làm bất hoạt các gen này, mất khả năng ức chế sự tăng sinh ác tính [7] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các gen này thường đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh từ

âm ỉ trở thành toàn phát

Sự hoạt hoá proto - oncogene và bất hoạt anti - oncogene làm cho tế bào tăng sinh dễ dàng và không bị kiểm soát, ngăn cản sự biệt hóa và ngăn cản quá trình tế bào chết theo chương trình dẫn đến các bệnh ác tính Trong cơ thể, gen sinh ung thư và gen bình thường có thể tồn tại song hành, trong đó gen sinh ung thư là gen trội [8]

1.2.3 Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc

 Tổn thương gen truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào

Những gen này truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào thông qua receptor tyrosin kinase kích hoạt phosphoryn hóa làm cho tế bào tăng sinh

Do đột biến, gen này trở thành gen ung thư làm thay đổi hình thể protein dẫn đến thay đổi chức năng của chúng Một số gen hoạt động theo con đường này

là BCR-ABL, c-Kit, FLT3 Gen này có vai trò trong sự tiến triển thành LXMc chứ không có vai trò trong biến đổi ác tính tiên phát [6]

 Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép

Các gen Ig lymphocyte B và gen receptor lymphocyte T: khi các tế bào

T và B chưa trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn của ADN lại để tạo ra các protein đa dạng, có khả năng gắn với các protein lạ (các

Ig và các receptor tế bào T) Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu sai lạc xảy ra ở các proto - oncogene thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [8]

 Tổn thương gen liên quan đến quá trình tế bào chết theo chương trình

Nhiều loại tế bào được lập trình trước bởi các gen đặc biệt để biệt hóa rồi chết sau đó qua một thời gian sống nhất định Khi các gen này bị tổn thương,

tế bào tiếp tục được sinh ra nhưng không già và chết đi như bình thường đã lập trình trước, nên sẽ ứ đọng lại và gây mất cân bằng Hai gen tổng hợp protein tyrosin kinase và protein P53 tác động theo cơ chế này [6], [8]

 Hoạt hóa oncogene ở bệnh máu ác tính

Có nhiều mối liên quan rõ ràng giữa sự hoạt hóa các oncogene hoặc sự bất hoạt các anti-oncogene với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào Nếu chỉ có sự hoạt hóa của một oncogene thì chưa đủ điều kiện dẫn tới chuyển dạng ác tính Cần có sự phối hợp của nhiều oncogen hoặc sự biến đổi anti-oncogene mới làm các tế bào bình thường chuyển thành ác tính Cơ chế chuyển dạng ác tính

gồm 4 dạng chính sau [9]:

 Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST:

Chuyển một đoạn của NST này tới NST khác tạo nên sự sắp xếp mới, tạo ra gen lai mới, phiên mã một protein mới có hoạt tính tăng sinh tế bào

 Đột biến điểm:

Là những bất thường do thay đổi thành phần hoặc số lượng các nucleotid trên ADN gồm các dạng thêm bớt, thay thế hay đảo vị trí của một vài cặp nucleotid trên gen [10], [11]

 Nhân gen:

Có nhiều nghiên cứu cho thấy thừa NST số 8 sẽ thừa gen MYC và gây LXMc

Khác với virus gây bệnh nhiễm trùng khi vào tế bào sẽ nhân lên nhiều lần và phá vỡ tế bào tiếp tục chu kỳ mới, các virus gây ung thư tìm cách gắn

bộ gen vào vị trí các oncogene làm cho các gen này hoạt động dẫn đến kích thích tế bào tăng sinh và gây bệnh ác tính [11]

 Bất hoạt gen ức chế khối u

Trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát hiện tượng tăng sinh

tế bào, đó là gen ức chế khối u Khi những gen này bị mất hay bất hoạt, dẫn tới không kiểm soát, không kiềm chế được sự phân bào, gây ra khối u Gen ức chế khối u hoạt động theo cơ chế điều khiển ngược Khi tế bào phân chia quá mức sẽ tạo cơ chế feedback, chính các yếu tố phiên mã sẽ kích thích gen ức chế khối u để tạo ra một yếu tố ức chế lại yếu tố phiên mã Trong trường hợp gen ức chế khối u bị mất vai trò, yếu tố phiên mã sẽ tự tác động làm tế bào phân chia quá mức và gây bệnh ác tính [12]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc

1.3.1 Phương pháp hình thái học

Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và tiêu bản tủy xương, dựa vào hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bào blast, ngoài ra ta có thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào ác tính

1.3.2 Phương pháp hóa học tế bào

Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặc trưng cho từng dòng tế bào đã được vận dụng để hình thành các phương pháp nhuộm hóa học tế bào, các phương pháp phổ biến hiện nay đang sử dụng cho xếp loại LXMc như: nhuộm Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen, Periodic Acid - Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chế bằng NaF, Esterase đặc hiệu [13], [14]

Kỹ thuật nhuộm MPO dựa trên nguyên lý là các tế bào hạt dòng tủy và mono có chứa men MPO có tác dụng oxy hóa các cơ chất như gốc phenol, một số acid thơm và acid amin Các tế bào hạt dòng tủy cho phản ứng dương tính, dòng mono có thể dương tính ở mức độ thấp riêng dòng lympho thì hoàn toàn âm tính

Phương pháp nhuộm Sudan đen sử dụng Sudan đen là chất tan trong lipid nhằm phát hiện các hạt lipid trong tế bào Kết quả nhuộm Sudan đen dòng bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức

độ khác nhau còn dòng lympho thường âm tính Trên cùng một tế bào thì mức

độ dương tính của Sudan đen thường mạnh hơn MPO nhưng thường có sự song hành kết quả giữa hai phương pháp này [13]

Phương pháp nhuộm PAS là sử dụng Periodic Acid - Schiff để nhuộm glycogen, các tế bào máu có sự phân bố glycogen khác nhau trong bào tương Nhuộm PAS cho kết quả thường âm tính với các tế bào dòng bạch cầu hạt và mono nhưng lại dương tính mạnh với dòng lympho [14]

Nhuộm Esterase không đặc hiệu được sử dụng trong chẩn đoán LXMc dòng mono vì các tế bào thuộc dòng mono cho phản ứng dương tính mạnh và bị

ức chế bởi NaF [14] Phương pháp nhuộm Esterase đặc hiệu để phân biệt tế bào dòng mono và dòng bạch cầu hạt, dòng bạch cầu hạt sẽ cho phản ứng dương tính Nhuộm Esterase đặc hiệu và không đặc hiệu đều âm tính với dòng lympho

1.3.3 Phương pháp miễn dịch học

Đây là phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện những dấu ấn trên bề mặt tế bào hoặc trong bào tương Dấu ấn miễn dịch tế bào thay đổi tùy theo lứa tuổi và dòng tế bào Hiện nay, có hai phương pháp đang sử dụng rộng rãi là phân loại miễn dịch trên kính hiển vi huỳnh quang và phân loại miễn dịch bằng máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) Các tế bào LXMc thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các CD13, CD14, CD33, CD34, CD117 Các tế bào thuộc dòng lympho dương tính với CD3, CD7, CD10, CD19, CD20 [15], [16]

1.3.4 Phương pháp di truyền tế bào

Nghiên cứu bệnh sinh LXMc nhận thấy có liên quan đến tổn thương di truyền trong các tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ các tế bào non gây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh LXMc, biểu hiện tổn thương di truyền trong LXMc rất đa dạng bao gồm cả những bất thường

về số lượng đến những bất thường về cấu trúc phân tử Những bất thường NST và gen đặc trưng rất có ý nghĩa trong chẩn đoán thể bệnh, lựa chọn điều trị và tiên lượng Một số bất thường NST và gen hay gặp trong bệnh LXMc dòng tủy là t(15;17), t(8;21), t(9;22), inv(16), del(7), đột biến gen NPM1, FLT3, CEBPA Trong LXMc dòng lympho hay những bất thường NST và gen là NST Philadelphia, đột biến gen ABL/BCR, MLL/AF4 [17], [18]

1.3.5 Xếp loại LXMc

 Xếp loại LXMc theo FAB 1986 có bổ sung

Xếp loại LXMc theo FAB năm 1986 được dựa vào hình thái học tế bào, hóa học tế bào và dấu ấn miễn dịch

LXMc được chia làm 2 nhóm bệnh là LXMc dòng tủy và LXMc dòng lympho LXMc dòng lympho có 3 thể: L1, L2, L3; dòng tủy có 8 thể

từ M0 đến M7

Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung

M0

Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào

có nhân không thuộc dòng hồng cầu,

không có thể Auer, < 3% MPO+

CD34+

M1

Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào

có nhân không thuộc dòng hồng cầu, hiếm

thể Auer, > 3% MPO+

HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11±

M2

Tế bào non chưa biệt hóa < 90% các tế bào

có nhân không thuộc dòng hồng cầu, nhiều

thể Auer

HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11±

M3 LXMc tiền tủy bào, tế bào blast > 30%

Dưới nhóm: M4eo tăng tế nào non bất

thường dòng bạch cầu ưa acid

HLA-DR, CD34±, CD33, CD15±, CD14, CD64, CD11

mono chiếm > 80% các tế bào trong tủy

HLA-DR, CD34±, CD33, CD15±, CD14, CD64, CD11

M6

≥ 50% là các tiền thân hồng cầu, blast dòng

tủy ≥ 30% các tế bào có nhân không thuộc

Năm 2001, WHO đã đưa ra bảng xếp loại mới cho LXMc dòng tủy dựa trên đặc điểm tế bào di truyền, miễn dịch và bất thường di truyền ở mức độ NST và gen Năm 2008 được cập nhật bổ sung

WHO đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc với tỷ lệ blast ≥ 20% tế bào

có nhân trong tủy

Bảng 1.2: Xếp loại LXMc dòng tủy theo WHO 2008

1 LXMc dòng tủy có những bất thường vật chất di truyền tái diễn:

 LXMc dòng tủy với t(8;21)(q22;q22): gen AML1/ETO

 LXMc tiền tủy bào với t(15;17)(q22;q12): gen PML/RARα

 LXMc dòng tủy với t(6;9)(q23;q34): gen DEK/NUP214

 LXMc dòng tủy inv(3)(q21;q26.2): gen RPN1/EVI1

 LXMc dòng tủy (dòng mẫu tiểu cầu) với t(1;22)(p13;q13): gen

RBM15 - MKL1

 LXMc dòng tủy có biến đổi gen NPM1

 LXMc dòng tủy có biến đổi gen CEBPA

2 LXMc dòng tủy có có liên quan đến hội chứng rối loạn sinh tủy (MDS hoặc MPD/MDS)

3 LXMc dòng tủy có liên quan đến điều trị

4 LXMc dòng tủy không xếp loại (tương đồng xếp loại FAB):

 LXMc dòng tủy có sự biệt hóa tối thiểu

 LXMc dòng tủy không có sự trưởng thành

 LXMc dòng bạch cầu hạt ưa base

 Tăng tế bào tủy cấp kèm theo xơ tủy

5 Sarcoma tủy

6 Tăng sinh dòng tủy có liên quan đến hội chứng Down

7 Tân sản tế bào tua non dạng tương bào

1.4 CÁC ĐỘT BIẾN GEN TRONG LXMc DÒNG TỦY

Bất thường về cấu trúc và/hoặc số lượng NST có thể phát hiện được ở 60 đến 80% bệnh nhân LXMc dòng tủy Những bất thường hay gặp nhất đó là trisomy 8, monosomy 7, monosomy 21, trisomy 21, mất một NST X hoặc NST Y Trên thực tế thì bất kỳ một NST nào cũng có thể bị ảnh hưởng Ở những bệnh nhân bị LXMc dòng tủy thứ phát sau điều trị hóa chất hay tia xạ, bất thường di truyền hay gặp nhất là mất một phần hoặc toàn bộ NST số 5 Đã

từ lâu, những biến đổi NST được sử dụng để xếp loại LXMc dòng tủy và đã từng được coi là một trong các yếu tố quan trọng để phân nhóm nguy cơ, tiên lượng khả năng đáp ứng với hóa trị liệu, đánh giá nguy cơ tái phát và thời gian sống thêm của bệnh nhân [17], [18]

Bên cạnh các biến đổi nhiễm sắc thể, một số đột biến gen cũng tham gia vào các yếu tố tiên lượng quan trọng của LXMc dòng tủy, hay gặp nhất là các gen sau: NPM1, FLT3, CEBPA, MLL, NRAS [19]

1.4.1 Đột biến gen NPM1 (Nucleophosmin 1)

Gen NPM1 nằm trên NST số 5q35.1 bao gồm 12 exon mã hóa 259 acid amin Đột biến gen NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự năm 2005 [2], [3]

Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST

NPM1 có rất nhiều vai trò như tham gia vào quá trình phân bào, tháo xoắn ADN, dịch mã kết hợp với riboxom tham gia tổng hợp protein và sửa chữa ADN Ở các tế bào bình thường, NPM1 là một phosphoprotein trong nhân tế bào và hoạt động như một yếu tố điều hòa chu trình tế bào và con đường ức chế khối u (ARF)/TP53

Đột biến gen NPM1 hay gặp nhất là ở exon 12 (thêm 4 nucleotid TCTG)

là đột biến NPM1-mutA Kết quả là protein đột biến NPM1 không tồn tại trong nhân tế bào nữa mà xuất hiện ở trong bào tương tế bào Có thể phát hiện được protein NPM1 trong bào tương bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch Đột biến gen NPM1 là một biến đổi về vật chất di truyền hay gặp nhất ở LXMc dòng tủy Đột biến này gặp khoảng 50% ở bệnh nhân LXMc dòng tuỷ

có kiểu hình NST bình thường và thường xuất hiện ở bệnh nhi 2-8% [3] Đột biến gen NPM1 thường phối hợp với một số đột biến gen khác: 40% các bệnh nhân có NPM1 thường có phối hợp đột biến gen FLT3 (cả ITD và TKD), có tới 60% kèm theo đột biến gen FLT3-ITD; có thể đi kèm với một số bất thường NST hay gặp là +4, -Y, del(9q) và một số ít t(8,21), inv(16), t(15,17), 11q23/MLL; rất hiếm xuất hiện cùng đột biến gen CEBPA Một số các nghiên cứu lớn với những bằng chứng rõ ràng đã chỉ ra rằng nhóm bệnh nhân có đột biến gen NPM1 có tiên lượng tốt hơn hẳn nếu không có đột biến gen FLT3-ITD

đi cùng Thời gian sống của bệnh nhân khi có đột biến gen NPM1 60% trong khi

tỷ lệ này là 20 đến 30% bệnh nhân có đột biến gen FLT3 [2], [3]

Đột biến gen NPM1 tồn tại khá bền vững từ khi bệnh nhân được chẩn đoán cho đến khi tái phát, dường như đây là một yếu tố chính trong quá trình sản sinh các tế bào LXMc Tính bền vững và tỷ lệ gặp cao trong LXMc dòng tủy nên người ta nghĩ đến việc sử dụng đột biến này như một marker sinh học

phân tử để theo dõi và đánh giá bệnh tồn dư tối thiểu trong tương lai [3]

1.4.2 Đột biến gen FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3)

Gen FLT3 nằm trên NST 13q12 và có 24 exon Nó mã hóa cho một receptor có hoạt tính tyrosin kinase gắn trên màng tế bào, có vai trò rất quan trọng đối với sự tăng sinh, biệt hóa và sống sót của các tế bào gốc tạo máu

Hình 1.2: Vị trí của gen FLT3 trên NST

Đột biến gen FLT3 gặp với tỷ lệ khá cao khoảng 30% ở bệnh nhân LXMc dòng tủy có kiểu hình NST bình thường Hai kiểu đột biến của gen FLT3 hay gặp phổ biến là đột biến lặp đoạn liên tục (ITD - Internal Tandem Duplication) và đột biến vùng tyrosin kinase (TKD - Tyrosin Kinase Domain) Trong đó kiểu đột biến FLT3-ITD gặp với tỷ lệ cao 20-25%, đoạn lặp có kích thước thay đổi từ 3 cho đến 400 nucleotide và kết quả làm tăng thêm chiều dài của protein được mã hóa Đột biến FLT3-ITD dẫn đến sự hoạt hóa tyrosine kinase và hệ thống truyền tín hiệu PI3K/AKT, Ras/MAPK và JAK2/STAT Đột biến FLT3-TKD xảy ra ở codon 835-836 của vùng tyrosine

kinase thứ hai, gặp khoảng 5-10% ở bệnh nhân LXMc dòng tủy [2], [4]

Tỷ lệ gặp đột biến gen FLT3 thay đổi giữa các dưới nhóm của LXMc dòng tủy, tỷ lệ gặp cao nhất ở nhóm có kiểu hình NST bình thường và nhóm LXMc tiền tủy bào có chuyển đoạn t(15;17) Hầu hết các nghiên cứu đã chỉ ra

rằng bệnh nhân LXMc dòng tủy có đột biến gen FLT3-ITD có tiên lượng xấu

ở cả người lớn lẫn trẻ em, hiệu quả điều trị thấp, tỷ lệ tái phát cao và thời gian sống chung ngắn hơn nhóm không có FLT3-ITD Trong khi đó, ảnh hưởng của đột biến gen FLT3-TDK lên điều trị và tiên lượng còn gây nhiều tranh cãi

và cần thêm nhiều nghiên cứu lớn khác để đánh giá tác động của đột biến này trên LXMc dòng tủy Khác với đột biến NPM1, đột biến gen FLT3 có thể thay đổi giữa thời điểm chẩn đoán và tái phát, với khoảng 9% bệnh nhân sẽ mất đột biến FLT3-ITD Thêm nữa chiều dài của gen FLT3-ITD cũng có sự thay đổi giữa các thời điểm chẩn đoán và tái phát, chính vì thế mà người ta không thể sử dụng đột biến FLT3-ITD làm một marker trong theo dõi bệnh

tồn dư tối thiểu ở những bệnh nhân này [4], [20]

1.4.3 Một số đột biến gen khác

Đột biến gen CEBPA (CCAAT/Enhancer Binding Protein, Alpha)

Gen CEBPA nằm trên NST số 19q13.11 Gen CEBPA là một yếu tố phiên mã có tác dụng điều hòa những gen tham gia quá trình biệt hóa dòng tủy, đặc biệt là dòng bạch cầu hạt và tế bào tiền thân dòng tủy Có hai loại đột biến gen CEBPA trong LXMc dòng tủy Một loại ảnh hưởng đến vùng N- terminal, một loại ảnh hưởng đến vùng C-terminal Đột biến gen CEBPA xuất hiện ở 9% bệnh nhân LXMc dòng tủy nói chung và 70% trường hợp có kiểu

hình NST bình thường Về hình thái học tế bào thì LXMc dòng tủy thể M1 và

M2 là hay gặp đột biến này nhất Một số nghiên cứu cho rằng đột biến gen CEBPA có tiên lượng tốt, nó tương tự như thể có đột biến gen NPM1 không phối hợp với FLT3-ITD [19], [21] Tuy nhiên vẫn chưa xác định được rõ là tiên lượng của những bệnh nhân có đột biến gen CEBPA như thế nào nếu có phối hợp đột biến gen FLT3

Đột biến gen MLL (Mixed-Lineage Leukemia)

Gen MLL nằm trên NST số 1q21 Đột biến gen MLL là đột biến lặp đoạn liên tục một phần Phần lớn đột biến gen MLL liên quan với lặp đoạn gen từ exon 5 đến 11 và xen lặp đoạn này vào intron 4 của gen Đột biến này xuất hiện ở 8% các bệnh nhân LXMc dòng tủy có kiểu hình NST bình thường Đột biến gen MLL là một yếu tố tiên lượng xấu, thường đi kèm với tỷ

lệ lui bệnh thấp, thời gian sống không bệnh và thời gian sống thêm ngắn Tuy nhiên chưa có những nghiên cứu đánh giá về thời gian sống toàn bộ Một vài nghiên cứu về sinh bệnh học LXMc cho thấy đột biến MLL có thể là một yếu

tố thứ phát trong quá trình sinh LXMc Điều này rất quan trọng trong công cuộc tìm kiếm các thuốc mới có tác dụng điều trị nhắm đích LXMc dòng tủy, như các thuốc ức chế sự methyl hóa và ức chế deacetylase histone

Đột biến gen NRAS (Neuroblastoma RAS Viral)

Gen NRAS nằm trên NST số 1p13.2 Đột biến này bao gồm thay đổi ở vị trí codon 12, 13 và 61, kết quả là làm bất hoạt GTP nội sinh và hoạt động cơ bản của protein RAS Đột biến gen NRAS xuất hiện khoảng 9 đến 14% ở bệnh nhân LXMc dòng tuỷ trẻ tuổi với kiểu hình NST bình thường [19], [20] Chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến vai trò của NRAS trong tiên lượng bệnh đối với cả hai nhóm LXMc dòng tủy có kiểu hình bình thường hoặc có biến đổi NST trong nhóm nguy cơ trung bình Tuy nhiên đột biến gen này cũng có thể là một mục tiêu trong điều trị nhắm đích

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là 60 bệnh nhân mới được chẩn đoán LXMc dòng tủy tại Viện Huyết học - Truyền máu trung ương thời gian từ tháng 1/2014 đến tháng 5/2015 có các tiêu chuẩn sau:

 Bệnh nhân được chẩn đoán xác định LXMc dòng tủy theo tiêu chuẩn

WHO 2008

 Bệnh nhân được xếp loại thể bệnh theo FAB bổ sung năm 1986

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả hồi cứu: hồi cứu bệnh án thu thập đặc điểm lâm sàng, huyết học và đặc điểm đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD

2.2.2 Nội dung và biến số nghiên cứu

FLT3-TKD ở bệnh nhân LXMc dòng tủy

 Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, huyết học của bệnh nhân LXMc có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD:

 Đặc điểm lâm sàng: thiếu máu, xuất huyết, gan, lách, hạch to

 Đặc điểm tế bào máu ngoại vi và tủy xương: Hb, SLHC, SLBC, SLTC, tỷ lệ blast máu, SLTBTX, tỷ lệ blast tủy

2.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc dòng tủy

 Chẩn đoán LXMc : theo tiêu chuẩn của WHO 2008

 Lâm sàng: bệnh nhân có các hội chứng thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và thâm nhiễm

 Xét nghiệm: bệnh nhân có tỷ lệ blast ≥ 20% tế bào có nhân trong tủy xương

MPO và sudan đen dương tính, các CD dòng tủy (CD13, 14, 33, 34, 117) dương tính, các CD dòng lympho (CD3, 7, 10, 19, 20) âm tính

2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.4.1 Kỹ thuật Huyết tủy đồ và hóa học tế bào

Tiến hành theo quy trình tiêu chuẩn của khoa Tế bào tổ chức học Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

2.2.4.2 Kỹ thuật PCR xác định biến đổi gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD:

Tiến hành theo quy trình chuẩn của khoa Di truyền và Sinh học phân tử Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương như sau:

 Chuẩn bị với hộp kít mới:

 Thêm 60µl 2-mercaptoethanol vào 30ml NTL Lysis Buffer

 Chuẩn bị khay đá

 Bật máy ly tâm 40C

 Cho ống DEFC Water (1,5)ml vào máy heat 700C

4 Giữ lại dịch qua cột, loại bỏ cột

5 Thêm 500 µl Ethanol 70%, invert đều

- Nếu có tủa tạo thành sẽ làm giảm hiệu suất thu ARN

8 Ly tâm 13000 rpm/2phút Loại bỏ dịch qua cột

9 Chuyển hết dịch còn lại lên cột

10 Ly tâm 13000 rpm/2phút Loại bỏ dịch qua cột

14 Ly tâm 13000 rpm/2phút Loại bỏ dịch qua cột

15 Lặp lại bước 19-20 một lần nữa

16 Chuyển cột sang ống 2 ml mới, ly tâm 13000 rpm/2phút Chuyển cột sang ống 1.5 ml

ở nhiệt độ phòng

19 Bảo quản ARN ở -700C

Đo kiểm tra chất lượng ARN trên máy đo quang phổ nanodrop

 Thành phần hóa chất, sinh phẩm:

 5X VILO Reaction Mix: 4.0 µl

 10X SuperScript Enzyme Mix: 2.0 µl

 Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose

 Chuẩn bị gel agarose

 Lựa chọn nồng độ agarose thích hợp cho sản phẩm ADN

 Cân lượng agarose phù hợp, cho vào bình cách thủy cùng với đệm 100 ml TBE 0,5x

 Đun sôi hỗn hợp bằng lò vi sóng, lắc đều cho agarose tan hết

 Để nguội tự nhiên hoặc trong bể ổn nhiệt xuống 65oC

 Thêm 5 µl hóa chất nhuộm ADN (Redsafe 20000X), lắc nhẹ để hòa tan

 Đổ từ từ dung dịch agarose lên khuôn đúc gel tránh tạo bọt khí

 Để gel nguội tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30’-45’