Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương giai đoạn 2013 – 2016 (LA tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN VÀ THEO DÕI ĐIỀU TRỊ THẢI SẮT Ở BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG GIAI ĐOẠN 2013 - 2016 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN VÀ THEO DÕI ĐIỀU TRỊ THẢI SẮT Ở BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG GIAI ĐOẠN 2013 - 2016 Chuyên ngành : Huyết học Truyền máu M s : 62720151 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Anh Trí PGS.TS Lê Xuân Hải HÀ NỘI - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Thu Hà, nghiên cứu sinh khóa 32 - Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học Truyền máu, xin cam đoan: Đây luận án trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Nguyễn Anh Trí – Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Phó Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội Công trình không trùng lặp với nghiên cứu khác đ công b Việt Nam Các s liệu thông tin nghiên cứu xác, trung thực khách quan, đ xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nguyễn Thị Thu Hà LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học - Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội đ tạo điều kiện, giúp đỡ hoàn thành luận án Tiến sĩ – Khóa 32 - Đảng ủy, Ban L nh đạo Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, Hội đồng khoa học, khoa/phòng Viện đ ủng hộ tạo điều kiện cho trình công tác thực đề tài nghiên cứu Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lòng biết ơn tới: - GS.TS Nguyễn Anh Trí - Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, người thầy đ tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá; động viên tạo điều kiện t t cho su t trình thực luận án - GS.TS Phạm Quang Vinh - Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền máu, người thầy động viên, giúp đỡ để có kiến thức giá trị, tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu cho su t thời gian học tập thực nghiên cứu - TS Lê Xuân Hải – trưởng khoa Miễn dịch Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, người thầy đ tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá; giúp đỡ động viên su t trình thực luận án - TS Bạch Quốc Khánh – Phó Viện trưởng Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, người thầy đ truyền đạt cho kiến thức chuyên môn quý báu, động viên tạo điều kiện t t cho su t trình công tác thực luận án - PGS.TS Nguyễn Hà Thanh, TS Dương Qu c Chính, PGS.TS Bùi Thị Mai An đ tận tình giúp đỡ, chia sẻ với kiến thức, kinh nghiệm, tài liệu tham khảo quý giá trình thực nghiên cứu - Tập thể cán Trung tâm thalassemia, khoa Di truyền sinh học phân tử, khoa Miễn dịch, khoa Tế bào tổ chức học, khoa Sinh hóa đồng nghiệp Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đ dành cho tình cảm quý mến, động viên kịp thời, hỗ trợ, chia sẻ công việc trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Chẩn đoán hình ảnh Bệnh Viện Bạch Mai, Trung tâm Tim mạch Bệnh viện E, Trung tâm Cơ xương khớp Bệnh viện E đ tạo điều kiện giúp đỡ su t năm tháng thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn bệnh nhân thalassemia người nhà bệnh nhân đ tin tưởng ủng hộ, hợp tác với su t trình làm việc nghiên cứu trung tâm thalassemia để hoàn thành luận án Tôi vô biết ơn cha mẹ, chồng, người thân gia đình đ thường xuyên động viên, khích lệ, tạo cho nguồn động lực, giúp chuyên tâm học tập, nghiên cứu không ngừng phấn đấu Xin cảm ơn bạn bè đ chia sẻ, giúp đỡ mặt trình học tập hoàn thành luận án t t nghiệp Hà Nội, tháng năm 2017 NCS Nguyễn Thị Thu Hà i LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Thu Hà, nghiên cứu sinh khóa 32 - Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học - Truyền máu, xin cam đoan: Đây luận án trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Nguyễn Anh Trí - Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Phó Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội PGS.TS Lê Xuân Hải - Trưởng khoa Miễn dịch Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Công trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2017 ii LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, cho phép bày tỏ lòng biết ơn cảm ơn chân thành tới : - Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học - Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ hoàn thành luận án Tiến sĩ - Đảng ủy, Ban Lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Hội đồng khoa học, khoa/phòng Viện ủng hộ tạo điều kiện cho trình công tác thực đề tài nghiên cứu Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lòng biết ơn tới: - GS.TS Nguyễn Anh Trí - Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, người Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá; động viên tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực luận án - GS.TS Phạm Quang Vinh - Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền máu, người Thầy dành nhiều tâm sức đào tạo, hướng dẫn động viên giúp đỡ để có kiến thức giá trị, ý kiến quý báu suốt thời gian học tập thực nghiên cứu - PGS.TS Lê Xuân Hải - Trưởng khoa Miễn dịch Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, người thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá; giúp đỡ động viên suốt trình thực luận án - TS Bạch Quốc Khánh - Phó Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, người Thầy truyền đạt cho kiến thức chuyên môn quý báu, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt trình công tác thực luận án iii - PGS.TS Nguyễn Hà Thanh, PGS.TS Bùi Thị Mai An, TS Dƣơng Quốc Chính tận tình giúp đỡ, chia sẻ với kiến thức, kinh nghiệm, tài liệu tham khảo quý giá trình thực nghiên cứu - Tập thể cán Trung tâm thalassemia, khoa Di truyền sinh học phân tử, khoa Miễn dịch, khoa Tế bào tổ chức học, khoa Sinh hóa đồng nghiệp Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương dành cho tình cảm quý mến, động viên kịp thời, hỗ trợ, chia sẻ công việc trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Chẩn đoán hình ảnh Bệnh Viện Bạch Mai, Trung tâm Tim mạch Bệnh viện E, tạo điều kiện giúp đỡ suốt năm tháng thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn bệnh nhân thalassemia người nhà bệnh nhân tin tưởng ủng hộ, hợp tác với suốt trình làm việc nghiên cứu trung tâm thalassemia để hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ, Chồng, Con người thân gia đình thường xuyên động viên, khích lệ, tạo cho nguồn động lực, giúp chuyên tâm học tập, nghiên cứu không ngừng phấn đấu Xin cảm ơn bạn bè chia sẻ, giúp đỡ mặt trình học tập hoàn thành luận án tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nguyễn Thị Thu Hà iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh thalassemia 1.1.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh thalassemia 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 1.1.3 Chẩn đoán, phân loại bệnh thalassemia 1.1.4 Điều trị bệnh thalassemia 1.2 Đột biến gen globin phương pháp phát 1.2.1 Gen globin đột biến 1.2.2 Các phương pháp xác định đột biến gen globin thông dụng 13 1.2.3 Các nghiên cứu xác định đột biến gen globin 17 1.3 Quá tải sắt bệnh nhân thalassemia phương pháp đánh giá 19 1.3.1 Phân bố sắt người bình thường: 19 1.3.2 Quá trình chuyển hóa sắt 21 1.3.3 Quá tải sắt bệnh nhân thalassemia 23 1.3.4 Các phương pháp đánh giá tải sắt 28 1.3.5 Các nghiên cứu tình trạng tải sắt bệnh nhân thalassemia 34 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng nghiên cứu 37 v 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.2.2 Các số nghiên cứu 41 2.2.3 Cách chọn mẫu, bước tiến hành 44 2.3 Các tiêu chuẩn đánh giá, kỹ thuật phương pháp 47 2.3.1 Các tiêu chuẩn chẩn đoán 47 2.3.2 Các phương pháp kỹ thuật xét nghiệm 55 2.4 Xử lý số liệu 60 2.5 Đạo đức nghiên cứu 61 2.6 Thời gian nghiên cứu 61 2.7 Địa điểm nghiên cứu 61 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 62 3.1 Xét nghiệm phát đột biến gen globin Globin Strip Asssay 62 3.1.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 62 3.1.2 Kết chẩn đoán đột biến gen globin StripAssay 65 3.2 Kết đánh giá tải sắt MRI 74 3.2.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 74 3.2.2 Kết đánh giá mức độ tải sắt bệnh nhân thalassemia 75 3.2.3 Mối liên quan tải sắt với tổn thương quan 81 3.2.4 Sự thay đổi số tải sắt sau năm điều trị 88 CHƢƠNG BÀN LUẬN 95 4.1 Bàn luận đặc điểm đột biến gen globin xác định Strip Assay Viện Huyết học Truyền máu Trung ương 95 4.1.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 95 2) Để tất teststrip, ADNT, Conjugate Solution, Wash Solution B Color Developer nhiệt độ phòng 3) Lấy máng lai viết ký hiệu rãnh tương ứng với teststrip bệnh nhân 4) Sử dụng kẹp nhíp lấy teststrip A teststrip B cho mẫu bệnh phẩm (chỉ cầm teststrip đeo bao tay!) Ghi ký hiệu vạch đánh dấu teststrip sử dụng bút chì (không sử dụng bút bi, bút đánh dấu…) 5) Trộn thành phần cho phản ứng lai theo bảng sau: Đối với rãnh lai teststrip A Đối với rãnh lai teststrip B •Hút 20 µl ADNT (nắp xanh) vào góc rãnh đánh dấu máng lai •Thêm 10 µl sản phẩm PCR A1 vào giọt ADNT tương ứng •Thêm 10 µl sản phẩm PCR A2 vào giọt Trộn pipette (Dung dịch trì màu xanh) •Hút 10 µl ADNT (nắp xanh) vào góc rãnh đánh dấu máng lai •Thêm 10 µl sản phẩm PCR B vào giọt ADNT tương ứng Trộn pipette (Dung dịch trì màu xanh) 6) Để yên phút nhiệt độ phòng 7) Thêm ml Hybridization Buffer (đã làm ấm tới 45°C) rãnh Lắc máng lai nhẹ nhàng (màu xanh biến mất) 8) Chèn teststrip A teststrip B đánh dấu vào rãnh Nhấn chìm hoàn toàn teststrip 9) Ủ 30 phút 45°C máy lắc ổn nhiệt Tốc độ 250 rpm, đậy nắp ủ 10) Kết thúc ủ, loại bỏ đệm lai pipet 7.5.2 Rửa teststrip (45°C; máy lắc ổn nhiệt) 11) Thêm ml Wash Solution A (đã làm ấm tới 45°C) Rửa nhanh (10 giây) Loại bỏ dịch pipet 12) Thêm ml Wash Solution A (45°C) 13) Ủ 15 phút 45°C bể ổn nhiệt Loại bỏ dịch pipet 14) Thêm ml Wash Solution A (45°C) 15) Ủ 15 phút 45°C bể ổn nhiệt Loại bỏ dịch pipet Sau bước cài nhiệt độ 25oC mở nắp máy lắc 7.5.3 Phát triển màu (nhiệt độ phòng) 16) Thêm ml Conjugate Solution 17) Ủ 15 phút nhiệt độ phòng máy lắc Loại bỏ dịch pipet 18) Thêm ml Wash Solution B Rửa nhanh (10 giây) Loại bỏ dịch pipet 19) Thêm ml Wash Solution B 20) Ủ phút nhiệt độ phòng máy lắc Loại bỏ dịch pipet 21) Thêm ml Wash Solution B 22) Ủ phút nhiệt độ phòng máy lắc Loại bỏ dịch pipet 23) Thêm ml Color Developer 24) Ủ 15 phút nhiệt độ phòng tối máy lắc Chất nhuộm mầu tía xuất phản ứng dương tính 25) Rửa teststrip vài lần với nước khử ion 26) Để teststrip khô tối giấy thấm Tránh để teststrip tiếp xúc với ánh sáng mạnh sau phát triển màu Phân tích kết  Kiểu gen mẫu xét nghiệm xác định từ Teststrip A B tương ứng, qua việc đối chiếu Teststrip với thang đo  Đặt hai Teststrip vào vị trí định sẵn cạnh thang đo chỉnh dựa theo vạch màu đỏ vạch màu xanh bên dưới, sau có định Teststrip với băng dính  Kết chấp nhận xuất đủ vạch: vạch Control cùng, vạch Control A vạch Control B  Qui trình α-globin Stripassay sử dụng đồng thời đầu dò kiểu dại đầu dò đột biến nhằm xác định đồng hợp/dị hợp tử đột biến Qui trình phát đồng thời 21 đột biến tương đương với 21 vạch màu tương đương với 21 đầu dò đột biến Ngoài ra, đầu dò kiểu dại xác định tính đồng hợp/dị hợp tử 21 đột biến  Mẫu dị hợp tử xuất đồng thời vạch đột biến vạch kiểu dại  Mẫu đồng hợp tử đột biến xuất vạch đột không xuất vạch kiểu dại Hoàn thiện hồ sơ xét nghiệm  Hoàn thiện thông tin hồ sơ xét nghiệm thông tin sổ xét nghiệm ADN 10 Nguyên nhân sai lầm Trong trình chuẩn bị sản phẩm PCR cho trình lai gặp số vấn đề sau: bảo quản mẫu chưa qui cách; sai sót dán mã xử lý mẫu dẫn đến nhầm mẫu, sót mẫu; lây nhiễm trình PCR Trong trình lai phải tuyệt đối tuân thủ qui trình thực Nhằm tránh vấn đề lai không đặc hiệu, chất màu bị phân hủy, vạch tín hiệu yếu 11 Tiêu chuẩn đánh giá kiểm tra chất lượng Trong lần xét nghiệm kết chấp nhận khi: vạch nội kiểm tất mẫu xét nghiệm; vạch kiểu dại (wild type) xuất mẫu xét nghiệm vạch đột biến (mutant); vạch xuất phải đậm rõ nét PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM β-THALASSEMIA BẰNG STRIPASSAY Mục đích: phát đột biến bệnh beta thalassemia Phạm vi áp dụng  Đối tượng áp dụng: Những bệnh nhân có tiền sử gia đình mang gen beta thalassemia, bệnh nhân có triệu chứng chẩn đoán mắc bệnh thalassaemia Những bệnh nhân xét nghiệm phát 22 đột biến beta thalassemia phổ biến khu vực Đông Nam Á  Người thực xét nghiệm: Tất nhân viên làm việc khoa Di truyền Sinh học phân tử đào tạo Các thuật ngữ sử dụng quy trình  PCR: Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi tổng hợp  ADN: Axit deoxyribonucleic  KQXN: Kết xét nghiệm 11 Yêu cầu vật liệu 11.1.Hóa chất sinh phẩm  Kit tách ADN hãng OMEGA gồm: cột lọc, Elution Buffer, OB Protease Solution, BL Buffer, HBC Buffer, ADN Wash Buffer  Bộ kit β-globin StripAssay SEATM  Hóa chất chạy PCR gồm: PCR Master trộn 2X, Nuclease free H2O  Các mồi tương ứng IDT tổng hợp  Các mồi tương ứng IDT tổng hợp  Thạch agarose, loading dye, đánh dấu  Thuốc nhuộm ethidium bromide 11.2.Thiết bị  Máy ly cho ống eppendoff  Máy trộn mẫu  Máy PCR  Hệ thống máy điện di  Hệ thống máy chụp ảnh gel 11.3.Dụng cụ  Các pipet man loại 1000 µl, 200 µl, 20 µl  Các đầu côn có phin lọc 1000 µl, 200 µl, 20 µl  Đầu côn không phin lọc 200 µl  Ống eppendoff 1.5 ml 0.2 ml 11.4.Vật liệu khác 12 Yêu cầu mẫu bệnh phẩm  Bệnh phẩm 2ml máu toàn phần chống đông EDTA 13 Nguyên lý xét nghiệm Xét nghiệm β-globin stripassay phát triển dựa nguyên lý kỹ thuật lai ADN ngược Sử dụng Teststrip có đính nhiều đầu dò để phát đột biến xác định tính đồng hợp/dị hợp tử 22 đột biến phổ biến khu vực Đông Nam Á 14 Qui trình thực 14.1 Tách ADN Thực theo Qui trình tách ADN (QT.DT.17) 14.2 Điện di kiểm tra ADN Thực theo Qui trình điện di ADN gel agarose (QT.DT.23) 14.3 Thực phản ứng PCR 6) Giữ tất hóa chất ADN khuôn khay giữ lạnh Tiến thành tất bước khay trữ lạnh (0-40C) bắt đầu chạy máy 7) Chuẩn bị working dilution gồm Taq ADN Polymerase (nắp đỏ) Taq Dilution Buffer (nắp trong) với tỷ lệ 1:25 (nồng độ cuối 0.2U/μl) 8) Chuẩn bị ống phản ứng cho mẫu, đặt ống khay trữ lạnh 9) Mỗi mẫu chuẩn bị phản ứng PCR với thành phần: 15 µl Amplification Mix (nắp vàng) µl Taq ADN Polymerase hòa đệm (1 U) µl ADN khuôn Khuyến cáo nồng độ ADN phải từ - 40 ng/µl (25 - 200 ng ADN phản ứng) 10) Đậy chặt nắp ống, khởi động nóng máy PCR tới 95°C 11) Đặt ống phản ứng vào máy chạy theo chương trình: Tiền biến tính : 94°C/2 phút Chu tình nhiệt : 94°C/15 giây - 58°C/30 giây - 72°C/45 giây (35 chu kỳ) Kéo dài bước cuối : 72°C/3 phút Bảo quản sản phẩm PCR 2-8°C 14.4 Điện di kiểm tra ADN sản phẩm PCR  Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel 3% (không bắt buộc) Thực theo Qui trình điện di ADN gel agarose (QT.DT.23)  Chiều dài đoạn: 310, 381, 755 bp 14.5 Qui trình lai ADN  Trước lai: khởi động bể ổn nhiệt máy lắc ổn nhiệt tới 45°C (± 0.5°C) Cho lọ Hybridization Buffer Wash Solution A vào bể ổn nhiệt để làm ấm trước sử dụng 7.5.1 Lai ADN - Teststrip cho mẫu (45°C; máy lắc ổn nhiệt) 27) Kiểm tra nhiệt độ bể ổn nhiệt máy lắc Đảm bảo đạt 45oC trước tiến hành 28) Để tất teststrip, ADNT, Conjugate Solution, Wash Solution B Color Developer nhiệt độ phòng 29) Lấy máng lai viết ký hiệu rãnh tương ứng với teststrip bệnh nhân 30) Sử dụng kẹp nhíp lấy teststrip cho mẫu bệnh phẩm (chỉ cầm teststrip đeo bao tay!) Ghi ký hiệu vạch đánh dấu teststrip sử dụng bút chì (không sử dụng bút bi, bút đánh dấu…) 31) Hút 10 µl DNAT (nắp xanh) vào góc rãnh đánh dấu máng lai (1 rãnh mẫu) 32) Thêm 10 µl sản phẩm khuếch đại vào giọt DNAT tương ứng Trộn pipette (Dung dịch trì màu xanh) 33) Để yên phút nhiệt độ phòng 34) Thêm ml Hybridization Buffer (đã làm ấm tới 45°C) rãnh Lắc máng lai nhẹ nhàng (màu xanh biến mất) 35) Chèn teststrip A teststrip B đánh dấu vào rãnh Nhấn chìm hoàn toàn teststrip 36) Ủ 30 phút 45°C máy lắc ổn nhiệt Tốc độ 250 rpm, đậy nắp ủ 37) Kết thúc ủ, loại bỏ đệm lai pipet 7.5.2 Rửa teststrip (45°C; máy lắc ổn nhiệt) 38) Thêm ml Wash Solution A (đã làm ấm tới 45°C) Rửa nhanh (10 giây) Loại bỏ dịch pipet 39) Thêm ml Wash Solution A (45°C) 40) Ủ 15 phút 45°C bể ổn nhiệt Loại bỏ dịch pipet 41) Thêm ml Wash Solution A (45°C) 42) Ủ 15 phút 45°C bể ổn nhiệt Loại bỏ dịch pipet Sau bước cài nhiệt độ 25oC mở nắp máy lắc 7.5.3 Phát triển màu (nhiệt độ phòng) 43) Thêm ml Conjugate Solution 44) Ủ 15 phút nhiệt độ phòng máy lắc Loại bỏ dịch pipet 45) Thêm ml Wash Solution B Rửa nhanh (10 giây) Loại bỏ dịch pipet 46) Thêm ml Wash Solution B 47) Ủ phút nhiệt độ phòng máy lắc Loại bỏ dịch pipet 48) Thêm ml Wash Solution B 49) Ủ phút nhiệt độ phòng máy lắc Loại bỏ dịch pipet 50) Thêm ml Color Developer 51) Ủ 15 phút nhiệt độ phòng tối máy lắc Chất nhuộm mầu tía xuất phản ứng dương tính 52) Rửa teststrip vài lần với nước khử ion 53) Để teststrip khô tối giấy thấm Tránh để teststrip tiếp xúc với ánh sáng mạnh sau phát triển màu 15 Phân tích kết  Kiểu gen mẫu xét nghiệm xác định từ Teststrip tương ứng, qua việc đối chiếu Teststrip với thang đo  Đặt Teststrip vào vị trí định sẵn cạnh thang đo chỉnh dựa theo vạch màu đỏ vạch màu xanh bên dưới, sau có định Teststrip với băng dính  Kết chấp nhận xuất đủ vạch: vạch Control cùng, vạch Control A vạch Control B  Qui trình β-globin Stripassay sử dụng đồng thời đầu dò kiểu dại đầu dò đột biến nhằm xác định đồng hợp/dị hợp tử đột biến Qui trình phát đồng thời 22 đột biến tương đương với 22 vạch màu tương đương với 22 đầu dò đột biến Ngoài ra, 13 đầu dò kiểu dại xác định tính đồng hợp/dị hợp tử 22 đột biến  Mẫu dị hợp tử xuất đồng thời vạch đột biến vạch kiểu dại  Mẫu đồng hợp tử đột biến xuất vạch đột không xuất vạch kiểu dại 16 Hoàn thiện hồ sơ xét nghiệm  Hoàn thiện thông tin hồ sơ xét nghiệm thông tin sổ xét nghiệm ADN 17 Nguyên nhân sai lầm Trong trình chuẩn bị sản phẩm PCR cho trình lai gặp số vấn đề sau: bảo quản mẫu chưa qui cách; sai sót dán mã xử lý mẫu dẫn đến nhầm mẫu, sót mẫu; lây nhiễm trình PCR Trong trình lai phải tuyệt đối tuân thủ qui trình thực Nhằm tránh vấn đề lai không đặc hiệu, chất màu bị phân hủy, vạch tín hiệu yếu 11 Tiêu chuẩn đánh giá kiểm tra chất lượng Trong lần xét nghiệm kết chấp nhận khi: vạch nội kiểm tất mẫu xét nghiệm; vạch kiểu dại (wild type) xuất mẫu xét nghiệm vạch đột biến (mutant); vạch xuất phải đậm rõ nét PHỤ LỤC Một số hình ảnh kết đột biến kit globin Strip Assay Trên kit -Globin Strip Assay có gồm A để xác định đột biến đoạn B để xác định đột biến điểm gen -globin Ở có phần, phần đột biến (mutant) gắn đầu dò đột biến gen -globin phần bình thường (wildtype) gắn đầu dò đoạn bình thường (tương ứng với vị trí đột biến trên) gen -globin Hình ảnh kết xác định đột A B biến kit -globin Strip Assay mẫu ADN cho thấy A, đoạn đột biến xuất vạch đột biến vị trí (tương ứng đột biến SEA) đoạn bình thường không xuất vạch Ở B, đoạn đột biến đoạn bình thường không xuất vạch nào, điều có nghĩa mẫu ADN đoạn gen 1 gen 2 Kết luận: đột biến SEA đồng hợp tử ( SEA/ SEA) Mẫu ADN dịch ối sản phụ Vũ Nguyên H, 1987, mã số 14039524 Hình 6.1 Hình ảnh đột biến SEA/ SEA kit -Globin StripAssay A B Mẫu ADN dịch ối sản phụ Hoàng Thị N, 1987, mã số 15018343 Hình 6.2 Hình ảnh đột biến αCsα/αCsα kit -Globin StripAssay Hình ảnh kết kit -globin Strip Assay mẫu ADN cho thấy A, đoạn đột biến không xuất vạch nào, đoạn bình thường có xuất vạch (số 10, 11), điều có nghĩa đột biến đoạn gen -globin Ở B, đoạn đột biến có xuất vạch vị trí 19 (đột biến Constant Spring), đoạn wildtype không xuất vạch vị trí 30 (tương ứng với đột biến Constant Spring), điều có nghĩa đột biến alen, alen bình thường Kết luận: đột biến Constant Spring đồng hợp tử (αCsα/αCsα) A B Kết xét nghiệm ADN bệnh nhân Nguyễn Hà V, mã 14015271 Hình 6.3 Hình ảnh đột biến - -SEA/ αPakseα test -Globin StripAssay Nhận xét: Hình ảnh kết kit -globin Strip Assay mẫu máu bệnh nhân cho thấy A, đoạn mutant xuất vạch đột biến vị trí (tương ứng đột biến SEA) đoạn wildtype xuất đủ vạch, điều có nghĩa có alen bị đột biến SEA alen đủ gen 1 gen 2 Hình ảnh B, đoạn mutant có xuất vạch vị trí 21 (đột biến Pakse), đoạn wildtype không xuất vạch vị trí 30 (tương ứng với đột biến Pakse, điều có nghĩa alen có đột biến Pakse alen đoạn gen 2 Cd142 Kết luận: đột biến dị hợp tử kép SEA Pakse ( SEA/ αPakseα) Kết xét nghiệm ADN bệnh nhân Trần Đức Q, mã 16010465 Hình 6.4 Hình ảnh đột biến Cd 8/9/IVS 1-1 test -Globin StripAssay Trên kit -Globin StripAssay có gồm phần, phần mutant gắn đầu dò đột biến điểm gen -globin phần wildtype gắn đầu dò đoạn bình thường chứa gen tương ứng với đột biến Nhận xét: Hình ảnh kết kit -globin Strip Assay mẫu máu bệnh nhân cho thấy đoạn mutant có xuất vạch vị trí số (đột biến Cd8/9) vị trí số 12 (đột biến IVS1-1) Đoạn wildtype, có xuất đủ vạch Điều có nghĩa có alen có đột biến Cd8/9 alen có đột biến (đột biến IVS1-1) Kết luận: dị hợp tử kép Cd8/9 IVS1-1(C8/9/IVS1-1) Kết xét nghiệm ADN bệnh nhân Hà Thị Lan H, mã 16002017 Hình 6.5 Hình ảnh đột biến 8/ test -Globin StripAssay Nhận xét: Hình ảnh kết kit -globin Strip Assay mẫu máu bệnh nhân cho thấy đoạn mutant có xuất vạch vị trí số (đột biến -28) đoạn wildtype, không xuất vạch vị trí số 23 Điều có nghĩa đột biến alen, alen bình thường Kết luận: đột biến -28 đồng hợp tử (-28/-28) PHỤ LỤC Một số hình ảnh kết chụp cộng hưởng từ gan tim bệnh nhân thalassemia TE 1.3 TE 3.4 TE 5.7 (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ gan bệnh nhân Bùi Văn L mã BN 13000986) Minh họa hình ảnh tải sắt gan nặng (LIC = 20,1mg/g gan khô) TE 1.3 TE 3.4 TE 5.7 (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ gan bệnh nhân Hoàng Thị Lan A mã BN 10004176) Minh họa hình ảnh tải sắt gan mức độ trung bình (LIC = 12,6 mg/g gan khô) TE 1.3 TE 3.4 TE 5.7 (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ gan bệnh nhân Điêu Thị Ph mã BN 14030714) Minh họa hình ảnh tải sắt gan mức độ nhẹ (LIC = 5,9 mg/g gan khô) TE 10.4 TE 13.8 TE 17.3 (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ tim bệnh nhân Bùi Văn L mã BN 10008956) Minh họa hình ảnh tải sắt tim mức độ nặng (T2* tim = 5,6ms) TE 10.4 TE 13.8 TE 17.3 (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ tim bệnh nhân Phạm Hồng S mã BN 12013045) Minh họa hình ảnh tải sắt tim mức độ nhẹ (T2* tim = 17,9ms) ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN VÀ THEO DÕI ĐIỀU TRỊ THẢI SẮT Ở BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG. .. theo dõi điều trị thải sắt bệnh nhân thalassemia Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng giai đoạn 2013 - 2016" với hai mục tiêu: Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin kỹ thuật Strip Assay Viện. .. α -thalassemia Đột biến gây bệnh  -thalassemia bao gồm đột biến đoạn đột biến điểm Đột biến đoạn có dạng đột biến đoạn lớn làm gen α 12 đột biến đoạn nhỏ làm gen α Hiện phát 300 đột biến, đột biến