Nghiên cứu thành phần megastigmane từ quả cây na biển (annona glabra)

Một vài nghiên cứu về hợp chất megastigmane Các hợp chất megastigmane được phân bố rộng rãi trong thự nhiên.Chúng được phân lập từ thực vật như: từ cây Cananga odoratavar, từChenopodium

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

Ngày nay thế giới đang phải đối mặt với hàng loạt các căn bệnh nguyhiểm, đặc biệt là các bệnh lây nhiễm gây nên bởi vi khuẩn, vi rút, nấm vàđộng vật kí sinh Mặc dù các điều kiện sống của con người ngày càng đượccải thiện, được quan tâm nhưng các bệnh lây nhiễm vẫn là mối đe dọa thườngtrực đối với sức khỏe Những vấn đề này là đặc biệt quan trọng ở các nướcđang phát triển do môi trường sống và các điều kiện y tế không đảm bảo và sựkháng thuốc của các dòng lây nhiễm đang ngày càng gia tăng.Việc phát triểncác thuốc kháng sinh mới đặc hiệu sẽ giúp giảm thiểu sự lây lan của bệnhdịch, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe người dân Chính vì vậy, việcnghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao để ứng dụngtrong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con người làmột trong những nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa họctrong nước và ngoài nước quan tâm

Với sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiênnhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra cácloại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh hiểm nghèo như: penicilin(1941), artemisini (những năm 1970)…để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chấtlượng cuộc sống của con người Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệucung cấp các hoạt tính sinh học quý hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn tạo

cơ sở để tổng hợp ra các loại thuốc mới Từ những tiền chất được phân lập từthiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hoạt chất cókhả năng trị bệnh rất cao

Trong giới tự nhiên, nhiều loài cây cỏ được sử dụng như những dược

liệu quý Trong số đó cây Na biển (tên khoa học là Annona glabra), hầu hết

các bộ phận của cây đều có những tác dụng riêng, đặc biệt là bộ phận quả của

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

cây Các dân tộc ở Trung Mỹ, Nam Mexico, Brazil và Peru sử dụng nước sắc

lá cây để trị bệnh giun sán hoặc giã nát đắp mụn nhọt, áp xe và loét Theokinh nghiệm dân gian, quả Na biển chín trị được bệnh khí hư (huyết trắng) ởphụ nữ và chứng thiếu máu Hạt giã nát dùng đắp quanh nướu răng để làmgiảm nhức răng, có tác dụng hút mủ, giải nhiệt, ban đỏ, nhuận phế, mát gan

làm thuốc sát trùng, làm thuốc trị bướu, lá được dùng trị viêm khí quản mãntính Đây là cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữabệnh của cây, tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh

Nhằm mục đích nghiên cứu, phân lập và xác định cấu trúc hợp chấttrong thành phần hoá học của cây Na biển tôi lựa chọn đề tài này làm đối

tượng nghiên cứu Mục đích của khóa luận là: “Nghiên cứu thành phần megastigmane từ quả cây Na biển (Annona glabra)” với những nội dung

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Giới thiệu vài nét về thực vật học của họ Na (Annonaceae), chi Na (Annona) và cây Na biển

1.1 Sơ lược về thực vật học của Họ Na (Annonaceae)

Họ Na (danh pháp khoa học: Annonaceae) còn được gọi là họ Mãngcầu, là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dâyleo Với khoảng 2.300 đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhấtcủa bộ Mộc lan (Magnoliales ) Chi điển hình của họ này là Annona (na, mãng

cầu xiêm) Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loàisinh sống ở vùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ởchâu Phi và các loài khác ở châu Á

Ở Việt Nam họ Na (Annonaceae) có khoảng 207 loài thuộc 29 chi phân

bố ở khắp các tỉnh trong cả nước [2] Là một họ lớn nên có ý nghĩa về nhiều

mặt như lấy gỗ, làm thực phẩm, làm cảnh, đặc biệt có giá trị làm thuốc rấtlớn Nhiều loài cây trong họ được dùng để chữa các nhóm bệnh khác nhaunhư cảm cúm, thấp khớp, ngoài da, gan…

1.2 Thực vật học của chi Na (Annona)

Chi Na (Annona) là một chi điển hình của họ Na ( Annonaceae) Chinày có khoảng 125 loài, phân bố chủ yếu ở các khu rừng nhiệt đới thuộc Nam

Mỹ Trong vùng nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương và Châu Phi cũng gặpmột số loài.Ở nước ta, các loài Na, Mãng cầu xiêm, Bình bát được trồng rảirác trên khắp các địa phương, nhưng nhiều nhất ở các tỉnh phía Nam

Là loại cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi Lá đơn, mọc cách Phiến lá dai, trongcác tế bào biểu bì của lá đều có tinh thể hợp thành khối nhỏ Hoa mọc ở nách

lá, mọc đối diện với lá hoặc ở trên cành già Hoa lưỡng tính; đài 3, xếp van;cánh hoa 3 hoặc 6; nhị nhiều, dạng uvarioid, có mào trung đới hình đĩa rộng,bao phấn hướng ra ngoài; lá noãn nhiều, rời nhau trong hoa, nhưng khi thành

quả chúng lại dính nhau tạo thành khối nạc; noãn 1, đính gốc Hạt đen, vỏ

nhẵn và bóng Các loài trong chi Na (Annona) thường phân bố chủ yếu ở các

khu vực nhiệt đới, ưa sáng, ưa nóng ẩm Chúng thường rụng lá vào mùa đông,

đặc biệt là khi sinh trưởng ở các tỉnh phía Bắc nước ta Các loài Na(A squamosa), Mãng cầu xiêm (A muricata) có thể trồng trên nhiều loại đất (đất

phù sa, đất thịt, đất cát, đất đồi núi, đất phong hóa từ đá vôi…) với độ pHtương đối rộng nhưng không chịu ngập úng Hoa thường thụ phấn chéo nhờcôn trùng Cây thường ra hoa nhiều, nhưng số quả đậu lại ít hơn

Ở Việt Nam, chi Na (Annona) hiện đã biết có 4 loài, trong đó có 3 loài

chỉ gặp trong trồng trọt Đó là các loài:

1 Bình bát – Annona reticulata L (1753)

2 Mãng cầu xiêm – Annona muricata L (1753)

3 Na – Annona squamosa L (1753)

4 Nê – Annona glabra L (1753) [1]

1.3 Tổng quan về cây Na biển

1.3.1 Thực vật học

Tên khoa học: Annona glabra

Tên tiếng việt : Na biển

Tên khác: Nê, bình bát nước

Họ: Mãng cầu hay họ Na (Annonaceae)

Chi: Annona

Na biển là loại cây gỗ nhỏ, cao 2 - 5m, cành ít phân nhánh, dáng giốngmãng cầu xiêm Lá không lông, mọc cách, phiến lá hình bầu dục, hình tráixoan hoặc hình thuôn, cỡ 10-15 5-7 cm; chóp lá nhọn; gốc lá gần tròn;gân bên 8 - 9 đôi

Hoa phần lớn mọc đơn độc Lá đài xanh, hình tam giác; cánh hoa màuvàng, 6 cánh hoa dài 2 - 3cm, những chiếc cánh hoa vòng ngoài thường lớn và

có dạng hình tam giác rộng, cánh hoa vòng trong thường nhỏ, có bớt đỏ ở mặttrong; nhị nhiều; lá noãn nhiều; bầu có lông Quả hình trứng dài 7 - 10cm,màu vàng xanh, vỏ nhẵn, không gai, nạc, thịt trắng Hạt màu nâu nhạt.

Hình 1.3.1.a: Cây Na biển (1) và lá cây Na biển (2)

Hình 1.3.1.b: Cành Na biển mang quả (3), hoa của cây Na biển (4)

Cây mọc rải rác ở các khu vực dọc bờ biển từ Quảng Ninh đến QuảngNam (Cù Lao Chàm) và các tỉnh phía Nam Một số ý kiến cho rằng, cây Nabiển có nguồn gốc ở vùng ven biển nhiệt đới Châu Mĩ và Châu Phi, đượcnhập trồng ở Việt Nam

Cây trồng dựa bờ rạch có nước lợ; có thể mọc cả ở dưới mương dùnước vừa phèn, vừa mặn

1.3.2 Phân bố, sinh thái

lỵ và làm thuốc sát trùng Vỏ cây giã ra cũng có tác dụng tương tự và dịch lácây dùng để trừ chấy Ở Cu Ba, gỗ bình bát nước nhẹ, được dùng làm phaogiữ lưới đánh cá nổi trên mặt nước và làm thuyền đánh cá Ở Trung Quốc,toàn cây dùng làm thuốc trị bướu, lá được dùng trị viêm khí quản mãn tính.

Ngoài ra có thể trồng cây này để làm gốc ghép mãng cầu xiêm vừa tạo

ra cây mãng cầu có quả to, cơm dày, vị ngọt thanh, thích hợp với vùng trũngđất phèn

1.4 Những nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học có trong cây Na biển

Thành phần hóa học chủ yếu của cây Na biển là các ditecpenoit (khung

kauran), steroit, acetogenin; đặc biệt là các hợp chất ditecpenoit [7].

Năm 2004, một nhóm nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu sự ảnhhưởng, ức chế tế bào ung thư của 2 hợp chất ditecpenoit được phân lập từ cây

Na biển (Annona glabra) là cunabic axit và ent-kauran-19-al-17-oic axit được

thử nghiệm trên sự ra tăng tế bào ung thư gan ở người (dòng tế bào 7721) Kết quả cho thấy, các hợp chất đã ức chế sự tăng sinh tế bào và hủy

SMMC-hoại tế bào ung thư [8].

Cunabic axit Ent-kauran-19-al-17-oic axit

Hình 1.4.Cấu trúc hóa học của Cunabic axit và Ent-kauran-19-al-17-oic axit

1.5 Một vài nghiên cứu về hợp chất megastigmane

Các hợp chất megastigmane được phân bố rộng rãi trong thự nhiên.Chúng được phân lập từ thực vật như: từ cây Cananga odoratavar, từChenopodium cỏ dại…Tác dụng sinh học của megastigmane được biết đếnvới khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt động diệt tế bào Ngoài ra, một

số megastigmane được tìm thấy có khả năng gây độc tế bào, ức chế quá trình

phân bào nhiễm sắc thể bất thường [4].

Gần đây, một số hợp chất megastigmane được phân lập từ cây Vam (Mẫulưu giữu tại Viên Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam) là HD4A tên khoa học là megastigmanediol và HD4B có tên khoa học là 5-Megastigmane-3,9-diol 3-

khối lượng MS Hai hợp chất này được sử dụng trong ngành y học và dược

học [3].

12

CH31

CH3

OH 9 10

CH3

Hình 1.5.a: Cấu trúc hóa học của hợp chất HD4A

4' 5' O HO

O

11

CH3

1 6 5 4

7 8

13

CH 3

HO

9 10

CH 3

Hình 1.5.b: Cấu trúc hóa học của hợp chất HD4B

1.6 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trungbình, chất phân cực…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.6.1 Chọn dung môi chiết

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứcấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng vớichất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khácnhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dungmôi dùng trong quá trình chiết ít khi được quan tâm và cần phải được lựachọn rất cẩn thận

Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả vàchất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này cần được chưngcất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Có một số chất dẻo thường lẫntrong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butylaxetylcitrar Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất

hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong cácthùng chứa.

Metanol và clorofroc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phânlập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thửnghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofroc, metyl clorit

và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ

bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả…

vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương

tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có thể gây

ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác.Clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất nàycần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòngđộc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn cáchidrocacbon thế clo Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho rằng sẽ thấmtốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đượclượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực củaclorofroc thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancolhoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phâncực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bịhoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tínhtốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm được tạo thành khi dùng metanoltrong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetesaciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiếttrong metanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây màthay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol.

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thànhperoxit dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợpchất không có khả năng tạo cholesterol như các calotenoit Tiếp đến là axetoncũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trìnhphân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazơ có thểtạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấptrong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợpcho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trìnhtạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không

hơn

1.6.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãinhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức vàthời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dungmôi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả cao hơn Trước đây,

máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phươngpháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉthực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa nhữngchất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cáchkhác nhau

Ví dụ: Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợpchất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:Dragendroff và Maye

1.7 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợpchất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.7.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chấthấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha

tĩnh.Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chấtcủa chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khácnhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọctheo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quátình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh

sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu

hơn với pha này, nhờ đặc điểm này người ta có thể tách các chất qua quá trìnhsắc ký.

1.7.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữapha tĩnh và pha động Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụthuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặcvới chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳngnhiệt Langmuir:

n = Error!

n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b: hằng sốC: nồng độ của chất bị hấp phụ

1.7.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thế (các chất ở trạngthái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhómlớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia rathành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.7.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồmcác loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặckim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quantrọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Độ hạtcủa chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càngcao và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì

tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp, nếu lực trọng trường không đủlớn thì gây ra hiện tượng

tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với

áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quantrọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa đường đi củachất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi một chất sẽ

có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từngchất ra khỏi hỗn hợp Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng

và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), cònnếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sựkhác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộcvào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng cácphương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩmchất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thìđưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột vớilượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếpvào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chấthấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cộtđến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt Tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dungmôi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần lên cột đếnkhi đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu cóbọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cộtkhông được nứt, gãy, dò.

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm tốc độ hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòngchảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.7.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử đụng để kiểm tra và địnhhướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵnsilicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điềuchế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được trángsẵn silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khichạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồigiải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thểphát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc

1.8 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phươngpháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta

sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phốihợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác địnhchính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào cácphương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phươngpháp sắc ký so sánh…

1.8.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động củacác liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi

kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựavào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm đặc trưng trong hợp chất.

Ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là

1.8.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion củaphân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho cácpic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phânmảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay có rấtnhiều loại phổ khối lượng như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,phổ biến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi làphổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấphơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử

và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bịphá vỡ

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phánguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đóphổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao

- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc

ký kết hợp với phổ khối khác như: GC-MS (Sắc ký khí – Phổ khối), LC-MS(Sắc ký lỏng – Phổ khối) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệukhi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngànhdược)

1.8.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữuhiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR mộtchiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc củahợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (Phổ proton và

dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễnbằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift) Ngoài ra đặc trưng của phân tửcòn được xác định dựa vào sự tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau(spin coupling)

được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ laihoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào nhữngđặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác địnhđược cấu trúc hoá học của hợp chất

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộnghưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của

1.8.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phổ

về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổ DEPT

900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH

1.8.3.4 Phổ 2 chiều NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương táccủa các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuậtchủ yếu thường được sử dụng như sau:

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tươngtác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ,một trục và phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HSQCnằm trên đỉnh các ô vuông phổ

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổbiểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trênphổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định

về cấu trúc

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sửdụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phươngpháp phân tích, so sánh kết hợp khác Đặc biệt đối với các phân tử nhiềumạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chínhxác được chiều dài các mạch Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việcxác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sửdụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MShoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.1.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Marck 1,05715), RP18 F254S (Merck) Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở

được phun đếu trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khixuất hiện màu

2.1.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế

Sắc kí lớp mỏng điếu chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵnsilicagel 60G F254 (Merck, kí hiệu là 105875), phát hiện chất bằng đèn tửngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc

mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silicagel có chất, giải hấpphụ bằng dung môi thích hợp

2.1.3 Sắc kí cột (CC)

Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường vàpha đảo Silicagel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm (240-430

2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization MassSpectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện HóaHọc, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Máy cô quay chân không

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm

+ Tủ sấy chân không

+ Máy sấy

+ Micropipet

+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

+ Cột sắc ký pha thường và pha đảo các loại đường kính

+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage

+ Thiết bị đo độ quay cực JASCO

+ Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, clorofoc, etyl axetat, hexan, axeton, v.v…