Nghiên cứu thành phần megastigmane từ quả cây na biển (annona glabra)

Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Ngày giới phải đối mặt với hàng loạt bệnh nguy hiểm, đặc biệt bệnh lây nhiễm gây nên vi khuẩn, vi rút, nấm động vật kí sinh Mặc dù điều kiện sống người ngày cải thiện, quan tâm bệnh lây nhiễm mối đe dọa thường trực sức khỏe Những vấn đề đặc biệt quan trọng nước phát triển môi trường sống điều kiện y tế không đảm bảo kháng thuốc dòng lây nhiễm ngày gia tăng.Việc phát triển thuốc kháng sinh đặc hiệu giúp giảm thiểu lây lan bệnh dịch, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe người dân Chính vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng y học, nông nghiệp mục đích khác đời sống người nhiệm vụ quan trọng nhà khoa học nước nước quan tâm Với phát nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiên nhiên, nhà khoa học có đóng góp đáng kể việc tạo loại thuốc điều trị bệnh nhiệt đới bệnh hiểm nghèo như: penicilin (1941), artemisini (những năm 1970)…để kéo dài tuổi thọ nâng cao chất lượng sống người Thiên nhiên không nguồn nguyên liệu cung cấp hoạt tính sinh học quý để tạo biệt dược mà tạo sở để tổng hợp loại thuốc Từ tiền chất phân lập từ thiên nhiên, nhà khoa học chuyển hóa chúng thành hoạt chất có khả trị bệnh cao Trong giới tự nhiên, nhiều loài cỏ sử dụng dược liệu quý Trong số Na biển (tên khoa học Annona glabra), hầu hết phận có tác dụng riêng, đặc biệt phận Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Các dân tộc Trung Mỹ, Nam Mexico, Brazil Peru sử dụng nước sắc để trị bệnh giun sán giã nát đắp mụn nhọt, áp xe loét Theo kinh nghiệm dân gian, Na biển chín trị bệnh khí hư (huyết trắng) phụ nữ chứng thiếu máu Hạt giã nát dùng đắp quanh nướu để làm giảm nhức răng, có tác dụng hút mủ, giải nhiệt, ban đỏ, nhuận phế, mát gan giải khát Ngoài sử dụng làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lỵ làm thuốc sát trùng, làm thuốc trị bướu, dùng trị viêm khí quản mãn tính Đây thuốc quý, cần nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh cây, tạo sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh Nhằm mục đích nghiên cứu, phân lập xác định cấu trúc hợp chất thành phần hoá học Na biển lựa chọn đề tài làm đối tượng nghiên cứu Mục đích khóa luận là: “Nghiên cứu thành phần megastigmane từ Na biển (Annona glabra)” với nội dung sau: Nghiên cứu phân lập hợp chất megastigmane từ Na biển phương pháp chiết, sắc ký kết hợp Xác định cấu trúc hóa học hợp chất megastigmane phương pháp phổ kết hợp phổ NMR, MS, IR Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Giới thiệu vài nét thực vật học họ Na (Annonaceae), chi Na (Annona) Na biển 1.1 Sơ lược thực vật học Họ Na (Annonaceae) Họ Na (danh pháp khoa học: Annonaceae) gọi họ Mãng cầu, họ thực vật có hoa bao gồm loại thân gỗ, bụi hay dây leo Với khoảng 2.300 đến 2.500 loài 120 - 130 chi, họ lớn Mộc lan (Magnoliales) Chi điển hình họ Annona (na, mãng cầu xiêm) Họ sinh trưởng chủ yếu vùng nhiệt đới, có loài sinh sống vùng ôn đới Khoảng 900 loài Trung Nam Mỹ, 450 loài châu Phi loài khác châu Á Ở Việt Nam họ Na (Annonaceae) có khoảng 207 loài thuộc 29 chi phân bố khắp tỉnh nước [2] Là họ lớn nên có ý nghĩa nhiều mặt lấy gỗ, làm thực phẩm, làm cảnh, đặc biệt có giá trị làm thuốc lớn Nhiều loài họ dùng để chữa nhóm bệnh khác cảm cúm, thấp khớp, da, gan… 1.2 Thực vật học chi Na (Annona) Chi Na (Annona) chi điển hình họ Na (Annonaceae) Chi có khoảng 125 loài, phân bố chủ yếu khu rừng nhiệt đới thuộc Nam Mỹ Trong vùng nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương Châu Phi gặp số loài.Ở nước ta, loài Na, Mãng cầu xiêm, Bình bát trồng rải rác khắp địa phương, nhiều tỉnh phía Nam Là loại gỗ nhỏ bụi Lá đơn, mọc cách Phiến dai, tế bào biểu bì có tinh thể hợp thành khối nhỏ Hoa mọc nách lá, mọc đối diện với cành già Hoa lưỡng tính; đài 3, xếp van; cánh hoa 6; nhị nhiều, dạng uvarioid, có mào trung đới hình đĩa rộng, bao phấn hướng ngoài; noãn nhiều, rời hoa, thành Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp chúng lại dính tạo thành khối nạc; noãn 1, đính gốc Hạt đen, vỏ nhẵn bóng Các loài chi Na (Annona) thường phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới, ưa sáng, ưa nóng ẩm Chúng thường rụng vào mùa đông, đặc biệt sinh trưởng tỉnh phía Bắc nước ta Các loài Na(A squamosa), Mãng cầu xiêm (A muricata) trồng nhiều loại đất (đất phù sa, đất thịt, đất cát, đất đồi núi, đất phong hóa từ đá vôi…) với độ pH tương đối rộng không chịu ngập úng Hoa thường thụ phấn chéo nhờ côn trùng Cây thường hoa nhiều, số đậu lại Ở Việt Nam, chi Na (Annona) biết có loài, có loài gặp trồng trọt Đó loài: Bình bát – Annona reticulata L (1753) Mãng cầu xiêm – Annona muricata L (1753) Na – Annona squamosa L (1753) Nê – Annona glabra L (1753) [1] 1.3 Tổng quan Na biển 1.3.1 Thực vật học Tên khoa học: Annona glabra Tên tiếng việt : Na biển Tên khác: Nê, bình bát nước Họ: Mãng cầu hay họ Na (Annonaceae) Chi: Annona Na biển loại gỗ nhỏ, cao - 5m, cành phân nhánh, dáng giống mãng cầu xiêm Lá không lông, mọc cách, phiến hình bầu dục, hình trái xoan hình thuôn, cỡ 10-15  5-7 cm; chóp nhọn; gốc gần tròn; gân bên - đôi Hoa phần lớn mọc đơn độc Lá đài xanh, hình tam giác; cánh hoa màu vàng, cánh hoa dài - 3cm, cánh hoa vòng thường lớn Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp có dạng hình tam giác rộng, cánh hoa vòng thường nhỏ, có bớt đỏ mặt trong; nhị nhiều; noãn nhiều; bầu có lông Quả hình trứng dài - 10cm, màu vàng xanh, vỏ nhẵn, không gai, nạc, thịt trắng Hạt màu nâu nhạt Hình 1.3.1.a: Cây Na biển (1) Na biển (2) 1.3.2 Phân bố, sinh thái Hình 1.3.1.b: Cành Na biển mang (3), hoa Na biển (4) Cây mọc rải rác khu vực dọc bờ biển từ Quảng Ninh đến Quảng Nam (Cù Lao Chàm) tỉnh phía Nam Một số ý kiến cho rằng, Na biển có nguồn gốc vùng ven biển nhiệt đới Châu Mĩ Châu Phi, nhập trồng Việt Nam Cây trồng dựa bờ rạch có nước lợ; mọc mương dù nước vừa phèn, vừa mặn Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.3.3 Công dụng Hầu hết phận Na biển có tác dụng riêng như: Quả Na biển chín ăn được, mùa hoa gần quanh năm Các dân tộc Trung Mỹ, Nam Mexico, Brazil Peru sử dụng nước sắc để trị bệnh giun sán giã nát đắp mụn nhọt, áp xe loét Theo kinh nghiệm dân gian, Na biển chín trị bệnh khí hư (huyết trắng) phụ nữ chứng thiếu máu Hạt giã nát dùng đắp quanh nướu để làm giảm nhức răng, có tác dụng hút mủ, giải nhiệt, ban đỏ, nhuận phế, mát gan giải khát Ngoài hạt dùng hạt bình bát làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lỵ làm thuốc sát trùng Vỏ giã có tác dụng tương tự dịch dùng để trừ chấy Ở Cu Ba, gỗ bình bát nước nhẹ, dùng làm phao giữ lưới đánh cá mặt nước làm thuyền đánh cá Ở Trung Quốc, toàn dùng làm thuốc trị bướu, dùng trị viêm khí quản mãn tính Ngoài trồng để làm gốc ghép mãng cầu xiêm vừa tạo mãng cầu có to, cơm dày, vị thanh, thích hợp với vùng trũng đất phèn 1.4 Những nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học có Na biển Thành phần hóa học chủ yếu Na biển ditecpenoit (khung kauran), steroit, acetogenin; đặc biệt hợp chất ditecpenoit [7] Năm 2004, nhóm nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu ảnh hưởng, ức chế tế bào ung thư hợp chất ditecpenoit phân lập từ Na biển (Annona glabra) cunabic axit ent-kauran-19-al-17-oic axit thử nghiệm tăng tế bào ung thư gan người (dòng tế bào SMMC7721) Kết cho thấy, hợp chất ức chế tăng sinh tế bào hủy hoại tế bào ung thư [8] Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Cunabic axit Khóa luận tốt nghiệp Ent-kauran-19-al-17-oic axit Hình 1.4.Cấu trúc hóa học Cunabic axit Ent-kauran-19-al-17-oic axit 1.5 Một vài nghiên cứu hợp chất megastigmane Các hợp chất megastigmane phân bố rộng rãi thự nhiên Chúng phân lập từ thực vật như: từ Cananga odoratavar, từ Chenopodium cỏ dại…Tác dụng sinh học megastigmane biết đến với khả kháng khuẩn, kháng nấm hoạt động diệt tế bào Ngoài ra, số megastigmane tìm thấy có khả gây độc tế bào, ức chế trình phân bào nhiễm sắc thể bất thường [4] Gần đây, số hợp chất megastigmane phân lập từ Vam (Mẫu lưu giữu Viên Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) HD4A tên khoa học 5,11-Epoxy-3,9megastigmanediol HD4B có tên khoa học 5-Megastigmane-3,9-diol 3O--D-glucopyranozo thông qua phân tích quang phổ NMR phổ khối lượng MS Hai hợp chất sử dụng ngành y học dược học [3] 12 CH3 OH 11 HO Phạm Thu Nga O H 10 CH3 13 CH3 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.5.a: Cấu trúc hóa học hợp chất HD4A 12 HO 11 CH3 H3C HO 6' 4' HO HO O 5' 1' 3' O 10 CH3 13 CH3 2' OH Hình 1.5.b: Cấu trúc hóa học hợp chất HD4B 1.6 Các phương pháp chiết mẫu thực vật Sau tiến hành thu hái làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có mẫu khác (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, chất phân cực…) mà ta chọn dung môi hệ dung môi khác 1.6.1 Chọn dung môi chiết Điều kiện dung môi phải hoà tan chất chuyển hoá thứ cấp nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc Thường chất chuyển hoá thứ cấp có độ phân cực khác Tuy nhiên thành phần tan nước quan tâm Dung môi dùng trình chiết quan tâm cần phải lựa chọn cẩn thận Dung môi lẫn tạp chất ảnh hưởng đến hiệu chất lượng trình chiết Vì dung môi cần chưng cất để thu dạng trước sử dụng Có số chất dẻo thường lẫn dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat tri-n-butyl axetylcitrar Những chất lẫn với dung môi trình sản xuất khâu bảo quản nút đậy nhựa thùng chứa Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Metanol clorofroc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất làm sai lệch kết phân lập trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hoạt tính thử nghiệm sinh học làm bẩn dịch chiết Clorofroc, metyl clorit metanol dung môi thường lựa chọn trình chiết sơ phần như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả… Những tạp chất clorofoc CH2ClBr, CH2Cl2 phản ứng với vài hợp chất ancaloit tạo muối bậc sản phẩm khác Tương tự vậy, có mặt lượng nhỏ axit clohidric (HCl) gây phân huỷ, khử nước hay đồng phân hoá với hợp chất khác Clorofoc gây tổn thương cho gan thận nên làm việc với chất cần thao tác cẩn thận khéo léo nơi thoáng mát phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit độc dễ bay clorofoc Metanol etanol 80% dung môi phân cực hidrocacbon clo Các dung môi thuộc nhóm rượu cho thấm tốt lên màng tế bào nên trình chiết với dung môi thu lượng lớn thành phần tế bào Trái lại, khả phân cực clorofroc thấp hơn, rửa giải chất nằm tế bào Các ancol hoà tan phần lớn chất chuyển hoá phân cực với hợp chất phân cực trung bình thấp Vì chiết ancol chất bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn nước có đặc tính tốt cho trình chiết sơ Tuy nhiên có vài sản phẩm tạo thành dùng metanol suốt trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu từ trechonaetes aciniata chuyển thành trechonolide B trình phân huỷ 1hydroxytropacocain xảy erythroxylum novogranatense chiết metanol nóng Phạm Thu Nga K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Người ta thường sử dụng nước để thu dịch chiết thô từ mà thay vào dùng dung dịch nước metanol Dietyl ete dùng cho trình chiết thực vật dễ bay hơi, dễ bốc cháy độc, đồng thời có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với hợp chất khả tạo cholesterol calotenoit Tiếp đến axeton tạo thành axetonit 1,2-cis-diol có mặt môi trường axit Quá trình chiết điều kiện axit bazơ thường dùng với trình phân tách đặc trưng, có xử lý dịch chiết axit – bazơ tạo thành sản phẩm mong muốn Sự hiểu biết đặc tính chất chuyển hoá thứ cấp chiết quan trọng để từ lựa chọn dung môi thích hợp cho trình chiết tránh phân huỷ chất dung môi trình tạo thành chất mong muốn Sau chiết dung môi cất máy cất quay nhiệt độ không 30-400C, với vài hoá chất chịu nhiệt thực nhiệt độ cao 1.6.2 Quá trình chiết Hầu hết trình chiết đơn giản phân loại sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng loại thiết bị bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước - Chiết lôi theo nước Chiết ngâm phương pháp sử dụng rộng rãi trình chiết thực vật không đòi hỏi nhiều công sức thời gian Thiết bị sử dụng bình thuỷ tinh với khoá đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho trình tách rửa dung môi Dung môi nóng lạnh nóng đạt hiệu cao Trước đây, Phạm Thu Nga 10 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 2 Hình4.2.1: Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất phân lập dạng bột vô định hình Phổ 1H-NMR cho tín hiệu bốn nhóm metyl δH 2,21 (3H, s, H-10), 1,18 (3H, s, H-11), 1,41 (3H, s, H-12), 1,42 (3H, s, H-13) Sự chuyển dịch phía vùng trường yếu nhóm metyl vị trí H-10 gợi ý nhóm đính trực tiếp với nhóm cacbonyl (metyl-xeton) Ngoài xuất tín hiệu proton olefin cộng hưởng δH 5,86 (1H, s, H-8); proton anome đơn vị đường vị trí δH 4,46 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) Giá trị số tương tác lớn proton anome cho phép dự đoán phân tử đường có cấu hình β Bên cạnh xuất vùng tín hiệu proton oximetin oximetilen đường khoảng giá trị δH 3,19 - 3,91 ppm Phạm Thu Nga 30 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình4.2.a: Phổ proton hợp chất Trên phổ 13C-NMR phổ DEPT hợp chất xuất tín hiệu 19 nguyên tử cacbon, có tín hiệu cacbon oximetin oximetilen đơn vị đường glucose [C 102,7 (CH, C-1′), 75,1 (CH, C-2′), 78,1 (CH, C-3′), 71,6 (CH, C-4′), 77,9 (CH, C-5) 62,7 (CH2, C-6′)] cho phép dự đoán phần aglycon có cấu trúc khung megastigmane với 13 nguyên tử cacbon Tín hiệu cacbon vị trí cộng hưởng δC 200,9 (C, C-9) xác định có mặt nhóm cacbonyl; tín hiệu cacbon khác δC 211,5 (C, C-7) có chuyển dịch mạnh phía trường thấp gợi ý cacbon nhóm cacbonyl mà cacbon bậc bão hòa nối đôi (C-allenic) Ngoài xuất tín hiệu đặc trưng bốn nhóm metyl C 26,5 (CH3, C10), 32,2 (CH3, C-11), 29,4 (CH3, C-12) 30,8 (CH3, C-13) Phạm Thu Nga 31 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình4.2.b: Phổ cacbon hợp chất Hình 4.2.c: Phổ cacbon DEPT hợp chất Phạm Thu Nga 32 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Từ kiện phổ nêu sơ dự đoán hợp chất megastigmane glycosit có nhóm metyl, nhóm cacbonyl cacbon bão hòa nối đôi So sánh số liệu phổ hợp chất với số liệu tương ứng công bố austroside A [6] thấy phù hợp hoàn toàn vị trí tương ứng (bảng 1) Để xác định xác cấu trúc hóa học hợp chất 2, phổ HSQC HMBC tiến hành phân tích Dựa vào tương tác phổ HSQC, proton gán với cacbon tương ứng (bảng 1) Hình4.2.d: Phổ chiều HSQC hợp chất Tương tác xa HMBC nhận proton olefin H-8 (H 5,86) với cacbon C-6 (C 120,1), C-7 (C 211,5), C-9 (C 200,9) C-10 (C 26,5); proton metyl H-10 (H 2,21) với cacbon C-8 (C 101,1), C-9 (C 200,9) cho phép xác định vị trí nhóm cacbonyl C-9 hai nối đôi 6,7; tương tác hai proton metyl H-11 (H 1,18) H-12 (H 1,41) với cacbon CPhạm Thu Nga 33 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp (C 37,0), C-2 (C 48,1), C-6 (C 120,1) khẳng định nhóm metyl liên kết với C-1; tương tác giữ proton metyl H-13 (H 1,42) với cacbon C-4 (C 46,4), C-5 (C 72,4), C-6 (C 120,1) cho phép xác định nhóm OH aglycol liên kết với C-5 Proton anomer H-1’(H 4,46) xuất tương tác HMBC với cacbon C-3 (C 72,6) cho phép khẳng định vị trí nối đơn vị đường vị trí C-3 (hình 4.2.1) Hình4.2.e: Phổ chiều HMBC hợp chất Như vậy, vào liệu so sánh số liệu phổ hợp chất với autroside B hay gọi norsesquiterpenoid-3-O--Dglucopyranoside [6] thấy hoàn toàn phù hợp Điều cho phép khẳng định hợp chất autroside B với công thức phân tử C 19H30O8 có số khối M = 354 Phạm Thu Nga 34 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp H O C OH HO HO HO O O OH Hình 4.2.2: Một số tương tác HMBC hợp chất Phạm Thu Nga 35 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng1: Số liệu phổ chất chất Chất Chất C *δ a,e C δCa,b 42,3 42,4 δHa,c (J, Hz) HMBC (HC) ¥δ a,e C δCa,b - - 36,9 37,0 1, 3, 4, 6, 11 48,0 48,1 2,51 d (17,0) δHa,c (J, Hz) HMBC (HC) - - 2,12 brd (13,0) 50,6 50,7 200,7 201,2 - - 72,6 72,6 126,9 127,1 5,90 s 2, 5, 6, 13 46,7 46,6 166,9 167,3 - - 72,5 72,4 - - 80,0 80,1 - - 119,8 120,0 - - 132,2 132,5 5,93 d (16,0) 6, 8, 211,1 211,4 - - 132,1 132,4 5,82 dd (16,0, 5,5) 6, 7, 101,3 101,1 5,86 s 6, 7, 9, 10 73,5 73,6 4,23 m 8, 10 202,2 200,9 - - 10 67,1 67,3 3,53 dd (11,0, 5,0) 8, 27,0 26,5 2,21 s 8, 11 23,4 23,4 1,06 s 1, 2, 6, 12 32,5 32,2 1,18 s 1, 2, 6, 12 12 24,5 24,5 1,04 s 1, 2, 6, 11 29,3 29,4 1,41 s 1, 2, 6, 11 13 19,6 19,6 1,94 d (1,0) 4, 5, 30,8 30,8 1,42 s 4, 5, 1′ 102,6 102,7 4,45 d (7,5) 3, 3′ 2′ 75,0 75,1 3,19 m 1′, 3′ 3′ 78,1 78,1 3,41 m 4′ 71,6 71,6 3,41 m 5′ 77,9 77,8 3,41 m 6′ 62,7 62,7 2,16 d (17,0) 1,49 dd (13,0, 4,0) 4,36 m 2,38 brd (13,0) 1,51 dd (13,0, 4,0) 3,91 brd (12,0) 3, 4, 1′ 2, 3, 5, 4′, 5′ 3,73 dd (12,0, 5,0) đo CD3OD, b125MHz, c 500MHz , d CDCl3, a Phạm Thu Nga e 100MHz, *δC cucumegastigmane I [5], ¥δC autroside B [6] 36 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, ba hợp chất cucumegastigmane I (1), autroside B (2) phân lập từ dịch chiết metanol Na biển (Annona glabra) Cấu trúc hóa học chúng xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều Đây lần hai hợp chất phân lập từ Na biển (Annona glabra) Phạm Thu Nga 37 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập Trần Toàn, (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội [2] Võ Văn Chi, (1997), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, Nhà xuất trẻ Tài liệu Tiếng Anh [3] Gan L., Wang B., Liang H., Zhao Y., and Jiang F, (2000), Chemical constituents from Rubus alceaefolius Poir., Journal of Beijing Medical University, Vol 32(3), 226-228 [4] Gan L., Zhao Y., Zhang J., and Jiang F, (1998), Isolation and identification of triterpenoids from Rubus alceaefolius Poir., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, Vol 23(6), 361-362 [5] Hisaihiro K., Masaki B., and Toru O., Two new megastgmanes from the leaves of Cucumis Sativus, Chem Pharm Bull., 55 (1) 133-136 (2007) [6] Junsong W., Yuemao S., Hongping, Wenyi K., Xiaojang H., Planta Med., 71.96-98 (2005) [7] Tian-Jye H., Yang-Chang W., Su-Ching C., Ching-Shan H and Chung-Yi C., Chemical constituents from Annona glabra Journal of the Chinese Chemical Society, 51, 869-876 (2004) [8] Yong-hong ZHANG, Hai-yan PENG, Guo-hao XIA, Ming-yan WANG, Ying HAN, First Clinical College; Basic Medicine College, Nanjing Phạm Thu Nga 38 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029;Jiangsu Institute of Materia Medica, Nanjing 210009, China (2009) LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp hoàn thành phòng Nghiên cứu Cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phan Văn Kiệm, TS Hoàng Lê Tuấn Anh anh chị hướng dẫn Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình hướng dẫn em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Với tất lòng kính trọng lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng người tận tình, chu đáo dạy bảo em suốt năm học trường hoàn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Hóa Học- Trường Đại học sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ, dạy dỗ em trình học tập trường Xin cảm ơn tất bạn bè động viên giúp đỡ em trình học tập làm khóa luận Trong trình làm khóa luận tốt nghiệp cố gắng chắn tránh thiếu sót.Vì em kính mong nhận ý kiến đóng góp, bảo quý thầy cô Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Phạm Thu Nga Phạm Thu Nga 39 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng SKLM CC Clolumm chromatography Sắc kí cột IR In Frared Spectroscopy Phổ hồng ngoại MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng EI – MS Electron Mass Phổ khối lượng va chạm Impact Spectrometry ESI – MS Electron Spray electron Ionization Phổ khối lượng phun mù điện tử Mass Spectranetry FAB Fast Atom Bombing Mass Phổ bắn phá nguyên tử nhanh mức lượng Spectroscopy thấp NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt Spectroscopy 13 C-NMR nhân Cacbon-13-Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt Resonance Spectroscopy H-NMR Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt Spectroscopy DEPT nhân cacbon 13 nhân proton Distortion less Enhacemant By Polarisation Trafer Phạm Thu Nga 40 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2D - NMR Khóa luận tốt nghiệp Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt TWO-Dimensional Magnetic Resonance nhân hai chiều Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivily HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phạm Thu Nga 41 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược thực vật học Họ Na (Annonaceae) 1.2 Thực vật học chi Na (Annona) 1.3 Tổng quan Na biển 1.3.1 Thực vật học 1.3.2 Phân bố, sinh thái 1.3.3 Công dụng 1.4 Những nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học có Na biển 1.5 Một vài nghiên cứu hợp chất megastigmane 1.6 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 1.6.1 Chọn dung môi chiết 1.6.2 Quá trình chiết 10 1.7 Các phương pháp sắc ký phân lập hợp chất hữu 11 1.7.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 11 1.7.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 12 1.7.3 Phân loại phương pháp sắc ký 12 1.8 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc hợp chất hữu 14 1.8.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) 14 1.8.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS) 15 1.8.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mẫu thực vật Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 17 Phạm Thu Nga 42 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 17 2.2.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế 18 2.2.3 Sắc kí cột (CC) 18 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 18 2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 18 2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 18 2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 18 2.3.4 Độ quay cực []D 18 2.4 Dụng cụ thiết bị 19 2.4.1 Dụng cụ thiết bị tách chiết 19 2.4.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 19 2.5 Hoá chất 19 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21 3.1 Mẫu thực vật 21 3.2 Xử lý mẫu, chiết tách phân lập chất 21 3.3 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất: 23 3.3.1 Hợp chất 1: Cucumegastigmane I 23 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 25 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất 1: 25 4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 30 KẾT LUẬN……………………………………………………….36 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………….37 Phạm Thu Nga 43 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU BẢNG VÀ HÌNH VẼ Hình 1.3.1: Cành Na biển mang (a), hoa Na biển (b) Error! Bookmark not defined Hình 1.4.Cấu trúc hóa học Cunabic axit Ent-kauran-19-al-17-oic axit Hình 1.5.a: Cấu trúc hóa học hợp chất HD4A Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập hợp chất 22 Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập hợp chất 23 Hình 4.1.1 : Cấu trúc hóa học hợp chất 25 HÌnh4.1.a: Phổ proton hợp chất 26 Hình 4.1.b: Phổ cacbon hợp chất 27 Hình 4.1.d: Phổ chiều HSQC hợp chất 28 HÌnh4.1.e: Phổ chiều HMBC hợp chất 29 HÌnh 4.1.2: Một số tương tác HMBC hợp chất 29 Hình4.2.1: Cấu trúc hóa học hợp chất 30 Hình4.2.a: Phổ proton hợp chất 31 Hình4.2.b: Phổ cacbon hợp chất 32 Hình 4.2.c: Phổ cacbon DEPT hợp chất 32 Hình4.3.e: Phổ chiều HMBC hợp chất 34 Hình 4.2.2: Một số tương tác HMBC hợp chất 35 Bảng1: Số liệu phổ chất chất 36 Phạm Thu Nga 44 K35C- Hóa Học [...]... tốt nghiệp CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Mẫu thực vật Mẫu quả cây Na biển (Annona glabra) thu tại Bình Dương vào tháng 8 năm 2011 và được PGS.TS Ninh Khắc Bản giám định Mẫu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3.2 Xử lý mẫu, chiết tách và phân lập các chất Quả cây Na biển được thái nhỏ, phơi khô, nghiền thành bột (2,0 kg), ngâm chiết với metanol... Resonance Spectroscopy, NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (Phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H... ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 2.1.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Marck 1,05715), RP18 F254S (Merck) Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đếu trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi xuất hiện màu... micro-hotstage của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.2.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125MHz) được đo trên máy... ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với phổ khối khác như: GC-MS (Sắc ký khí – Phổ khối), LC-MS (Sắc ký lỏng – Phổ khối) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược) Phạm Thu Nga 15 K35C- Hóa Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.8.3 Phổ cộng hưởng từ hạt... Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm tốc độ hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc 1.7.3.2 Sắc ký lớp... silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10% 1.8 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các... từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift) Ngoài ra đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào sự tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling) 1.8.3.1 Phổ 1H-NMR Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học () của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai... Học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Từ những dữ kiện phổ đã nêu trên có thể sơ bộ dự đoán hợp chất 1 là một megastigmane có chứa 3 nhóm OH và hai liên kết đôi trong đó một liên kết đôi bị thế 2 vị trí và một liên kết đôi bị thế ba vị trí So sánh số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất 1 với số liệu đã được công bố của hợp chất cucumegastigmane I [5] cho thấy sự phù hợp hoàn toàn tại tất... chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau: 1.7.3.1 Sắc ký cột (C.C) Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel ... chất thành phần hoá học Na biển lựa chọn đề tài làm đối tượng nghiên cứu Mục đích khóa luận là: Nghiên cứu thành phần megastigmane từ Na biển (Annona glabra) với nội dung sau: Nghiên cứu phân... QUAN Giới thiệu vài nét thực vật học họ Na (Annonaceae), chi Na (Annona) Na biển 1.1 Sơ lược thực vật học Họ Na (Annonaceae) Họ Na (danh pháp khoa học: Annonaceae) gọi họ Mãng cầu, họ thực vật có... (2) phân lập từ dịch chiết metanol Na biển (Annona glabra) Cấu trúc hóa học chúng xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều Đây lần hai hợp chất phân lập từ Na biển (Annona glabra) Phạm