Nghiên cứu thành phần megastigmane từ quả cây na biển (annona glabra)

Clorofroc, metyl clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả… Những tạp chất của clorofoc như CH

MỞ ĐẦU

Ngày nay thế giới đang phải đối mặt với hàng loạt các căn bệnh nguy hiểm, đặc biệt là các bệnh lây nhiễm gây nên bởi vi khuẩn, vi rút, nấm và động vật kí sinh Mặc dù các điều kiện sống của con người ngày càng được cải thiện, được quan tâm nhưng các bệnh lây nhiễm vẫn là mối đe dọa thường trực đối với sức khỏe Những vấn đề này là đặc biệt quan trọng ở các nước đang phát triển do môi trường sống và các điều kiện y tế không đảm bảo và sự kháng thuốc của các dòng lây nhiễm đang ngày càng gia tăng.Việc phát triển các thuốc kháng sinh mới đặc hiệu sẽ giúp giảm thiểu sự lây lan của bệnh dịch, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe người dân Chính vì vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con người là một trong những nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong nước và ngoài nước quan tâm

Với sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra các loại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh hiểm nghèo như: penicilin (1941), artemisini (những năm 1970)…để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt tính sinh học quý hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn tạo

cơ sở để tổng hợp ra các loại thuốc mới Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hoạt chất có khả năng trị bệnh rất cao

Trong giới tự nhiên, nhiều loài cây cỏ được sử dụng như những dược

liệu quý Trong số đó cây Na biển (tên khoa học là Annona glabra), hầu hết

cây Các dân tộc ở Trung Mỹ, Nam Mexico, Brazil và Peru sử dụng nước sắc

lá cây để trị bệnh giun sán hoặc giã nát đắp mụn nhọt, áp xe và loét Theo kinh nghiệm dân gian, quả Na biển chín trị được bệnh khí hư (huyết trắng) ở phụ nữ và chứng thiếu máu Hạt giã nát dùng đắp quanh nướu răng để làm giảm nhức răng, có tác dụng hút mủ, giải nhiệt, ban đỏ, nhuận phế, mát gan

và giải khát Ngoài ra nó còn được sử dụng làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lỵ và làm thuốc sát trùng, làm thuốc trị bướu, lá được dùng trị viêm khí quản mãn tính Đây là cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây, tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh

Nhằm mục đích nghiên cứu, phân lập và xác định cấu trúc hợp chất trong thành phần hoá học của cây Na biển tôi lựa chọn đề tài này làm đối

tượng nghiên cứu Mục đích của khóa luận là: “Nghiên cứu thành phần megastigmane từ quả cây Na biển (Annona glabra)” với những nội dung

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Giới thiệu vài nét về thực vật học của họ Na (Annonaceae), chi Na (Annona) và cây Na biển

1.1 Sơ lược về thực vật học của Họ Na (Annonaceae)

Họ Na (danh pháp khoa học: Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng

cầu, là một họ thực vật có hoabao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo Với khoảng 2.300 đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của bộ Mộc lan(Magnoliales) Chi điển hình của họ này là Annona (na, mãng

cầu xiêm) Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi và các loài khác ở châu Á

Ở Việt Nam họ Na (Annonaceae) có khoảng 207 loài thuộc 29 chi phân

bố ở khắp các tỉnh trong cả nước [2] Là một họ lớn nên có ý nghĩa về nhiều

mặt như lấy gỗ, làm thực phẩm, làm cảnh, đặc biệt có giá trị làm thuốc rất lớn Nhiều loài cây trong họ được dùng để chữa các nhóm bệnh khác nhau như cảm cúm, thấp khớp, ngoài da, gan…

1.2 Thực vật học của chi Na (Annona)

Chi Na (Annona) là một chi điển hình của họ Na (Annonaceae) Chi

này có khoảng 125 loài, phân bố chủ yếu ở các khu rừng nhiệt đới thuộc Nam

Mỹ Trong vùng nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương và Châu Phi cũng gặp một số loài.Ở nước ta, các loài Na, Mãng cầu xiêm, Bình bát được trồng rải rác trên khắp các địa phương, nhưng nhiều nhất ở các tỉnh phía Nam

Là loại cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi Lá đơn, mọc cách Phiến lá dai, trong các tế bào biểu bì của lá đều có tinh thể hợp thành khối nhỏ Hoa mọc ở nách

lá, mọc đối diện với lá hoặc ở trên cành già Hoa lưỡng tính; đài 3, xếp van; cánh hoa 3 hoặc 6; nhị nhiều, dạng uvarioid, có mào trung đới hình đĩa rộng,

quả chúng lại dính nhau tạo thành khối nạc; noãn 1, đính gốc Hạt đen, vỏ

nhẵn và bóng Các loài trong chi Na (Annona) thường phân bố chủ yếu ở các

khu vực nhiệt đới, ưa sáng, ưa nóng ẩm Chúng thường rụng lá vào mùa đông,

đặc biệt là khi sinh trưởng ở các tỉnh phía Bắc nước ta Các loài Na(A squamosa), Mãng cầu xiêm (A muricata) có thể trồng trên nhiều loại đất (đất

phù sa, đất thịt, đất cát, đất đồi núi, đất phong hóa từ đá vôi…) với độ pH tương đối rộng nhưng không chịu ngập úng Hoa thường thụ phấn chéo nhờ côn trùng Cây thường ra hoa nhiều, nhưng số quả đậu lại ít hơn

Ở Việt Nam, chi Na (Annona) hiện đã biết có 4 loài, trong đó có 3 loài

chỉ gặp trong trồng trọt Đó là các loài:

1 Bình bát – Annona reticulata L (1753)

2 Mãng cầu xiêm – Annona muricata L (1753)

3 Na – Annona squamosa L (1753)

4 Nê – Annona glabra L (1753) [1]

1.3 Tổng quan về cây Na biển

1.3.1 Thực vật học

Tên khoa học: Annona glabra

Tên tiếng việt : Na biển

Tên khác: Nê, bình bát nước

Họ: Mãng cầu hay họ Na (Annonaceae)

Chi: Annona

Na biển là loại cây gỗ nhỏ, cao 2 - 5m, cành ít phân nhánh, dáng giống mãng cầu xiêm Lá không lông, mọc cách, phiến lá hình bầu dục, hình trái xoan hoặc hình thuôn, cỡ 10-15  5-7 cm; chóp lá nhọn; gốc lá gần tròn; gân bên 8 - 9 đôi

Hoa phần lớn mọc đơn độc Lá đài xanh, hình tam giác; cánh hoa màu vàng, 6 cánh hoa dài 2 - 3cm, những chiếc cánh hoa vòng ngoài thường lớn và

có dạng hình tam giác rộng, cánh hoa vòng trong thường nhỏ, có bớt đỏ ở mặt trong; nhị nhiều; lá noãn nhiều; bầu có lông Quả hình trứng dài 7 - 10cm, màu vàng xanh, vỏ nhẵn, không gai, nạc, thịt trắng Hạt màu nâu nhạt

Hình 1.3.1.a: Cây Na biển (1) và lá cây Na biển (2)

1.3.2 Phân bố, sinh thái

Hình 1.3.1.b: Cành Na biển mang quả (3), hoa của cây Na biển (4)

Cây mọc rải rác ở các khu vực dọc bờ biển từ Quảng Ninh đến Quảng Nam (Cù Lao Chàm) và các tỉnh phía Nam Một số ý kiến cho rằng, cây Na biển có nguồn gốc ở vùng ven biển nhiệt đới Châu Mĩ và Châu Phi, được nhập trồng ở Việt Nam

Cây trồng dựa bờ rạch có nước lợ; có thể mọc cả ở dưới mương dù

lỵ và làm thuốc sát trùng Vỏ cây giã ra cũng có tác dụng tương tự và dịch lá cây dùng để trừ chấy Ở Cu Ba, gỗ bình bát nước nhẹ, được dùng làm phao giữ lưới đánh cá nổi trên mặt nước và làm thuyền đánh cá Ở Trung Quốc, toàn cây dùng làm thuốc trị bướu, lá được dùng trị viêm khí quản mãn tính

Ngoài ra có thể trồng cây này để làm gốc ghép mãng cầu xiêm vừa tạo

ra cây mãng cầu có quả to, cơm dày, vị ngọt thanh, thích hợp với vùng trũng đất phèn

1.4 Những nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học có trong cây Na biển

Thành phần hóa học chủ yếu của cây Na biển là các ditecpenoit (khung

kauran), steroit, acetogenin; đặc biệt là các hợp chất ditecpenoit [7]

Năm 2004, một nhóm nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu sự ảnh hưởng, ức chế tế bào ung thư của 2 hợp chất ditecpenoit được phân lập từ cây

Na biển (Annona glabra) là cunabic axit và ent-kauran-19-al-17-oic axit được

thử nghiệm trên sự ra tăng tế bào ung thư gan ở người (dòng tế bào 7721) Kết quả cho thấy, các hợp chất đã ức chế sự tăng sinh tế bào và hủy

SMMC-hoại tế bào ung thư [8]

Cunabic axit Ent-kauran-19-al-17-oic axit

Hình 1.4.Cấu trúc hóa học của Cunabic axit và Ent-kauran-19-al-17-oic axit

1.5 Một vài nghiên cứu về hợp chất megastigmane

Các hợp chất megastigmane được phân bố rộng rãi trong thự nhiên Chúng được phân lập từ thực vật như: từ cây Cananga odoratavar, từ Chenopodium cỏ dại…Tác dụng sinh học của megastigmane được biết đến với khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt động diệt tế bào Ngoài ra, một

số megastigmane được tìm thấy có khả năng gây độc tế bào, ức chế quá trình

phân bào nhiễm sắc thể bất thường [4]

Gần đây, một số hợp chất megastigmane được phân lập từ cây Vam (Mẫu lưu giữu tại Viên Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam) là HD4A tên khoa học là megastigmanediol và HD4B có tên khoa học là 5-Megastigmane-3,9-diol 3-O--D-glucopyranozo thông qua phân tích quang phổ NMR và phổ khối

5,11-Epoxy-3,9-lượng MS Hai hợp chất này được sử dụng trong ngành y học và dược học [3]

O HO

CH3

CH3

CH3OH

H

1 2

3

4 5

6 7 8

9 10 11

12

13

Hình 1.5.a: Cấu trúc hóa học của hợp chất HD4A

6'

5'

1' 2' 3'

4'

O HO

HO HO

OH

1

7

6 5

4 3 2

10 9 8

11 12

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung

bình, chất phân cực…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.6.1 Chọn dung môi chiết

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết ít khi được quan tâm và cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này cần được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Có một số chất dẻo thường lẫn trong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butyl axetylcitrar Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong các thùng chứa

Metanol và clorofroc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofroc, metyl clorit

và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ

bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả…

Những tạp chất của clorofoc như CH2ClBr, CH2Cl2 có thể phản ứng với vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương

tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có thể gây

ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho rằng sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của clorofroc thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các calotenoit Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.6.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả cao hơn Trước đây,

máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ: Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Dragendroff và Maye

1.7 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.7.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá tình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này, nhờ đặc điểm này người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.7.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha tĩnh và pha động Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

Trong đó: n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b: hằng số C: nồng độ của chất bị hấp phụ

1.7.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thế (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.7.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp, nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng

tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi một chất sẽ

có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng

và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt Tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm tốc độ hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.7.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử đụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2 SO 4 10%

1.8 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta

sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh…

1.8.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi

kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm đặc trưng trong hợp chất

Ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1

1.8.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử

và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao

- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với phổ khối khác như: GC-MS (Sắc ký khí – Phổ khối), LC-MS (Sắc ký lỏng – Phổ khối) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược)

1.8.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu

hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một

chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của

hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (Phổ proton và cacbon)

là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của

từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch

chuyển hoá học (chemical shift) Ngoài ra đặc trưng của phân tử còn được xác

định dựa vào sự tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

1.8.3.1 Phổ 1 H-NMR

Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học () của các proton được

xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của

nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng

của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu

trúc hoá học của hợp chất

1.8.3.2 Phổ 13 C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng

hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ

13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm

1.8.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phổ

DEPT tín hiệu của các cacbon bậc 4 biến mất Tín hiệu của CH và CH3 nằm

về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổ DEPT

900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH

1.8.3.4 Phổ 2 chiều NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ, một trục và phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông phổ

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định

về cấu trúc

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh kết hợp khác Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.1.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Marck 1,05715), RP18 F254S (Merck) Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đếu trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi

2.1.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế

Sắc kí lớp mỏng điếu chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60G F254 (Merck, kí hiệu là 105875), phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch là H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

2.1.3 Sắc kí cột (CC)

Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo Silicagel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50m, Fujisilisa Chemical Ltd.)

2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

2.2.1 Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2 Phổ khối lượng (ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrorneter, Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.4 Độ quay cực [] D

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Máy cô quay chân không

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm

+ Tủ sấy chân không

+ Máy sấy

+ Micropipet

+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

+ Cột sắc ký pha thường và pha đảo các loại đường kính

+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage

+ Thiết bị đo độ quay cực JASCO

2.4 Hoá chất

+ Silicagel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck

+ Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltg) + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) + Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck)

+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck)

+ Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, clorofoc, etyl axetat, hexan, axeton, v.v…

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Mẫu thực vật

Mẫu quả cây Na biển (Annona glabra) thu tại Bình Dương vào tháng 8

năm 2011 và được PGS.TS Ninh Khắc Bản giám định Mẫu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Xử lý mẫu, chiết tách và phân lập các chất

Quả cây Na biển được thái nhỏ, phơi khô, nghiền thành bột (2,0 kg), ngâm chiết với metanol ba lần, sau đó loại dung môi thu được 180 g cặn chiết metanol Cặn này được hoà tan vào 2 lít nước cất và chiết lần lượt bằng clorofoc và etyl axeat Sau khi loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn clorofoc (50 g), etyl axetat (40 g) và nước (90 g)

Cặn clorofoc (50 g) được tẩm vào 120 g silicagel, cô đuổi dung môi cho đến khi thu được bột tơi, khô sau đó tiến hành phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel pha thường (cỡ hạt 230 - 400 mesh, 0,04 - 0,063 mm), rửa giải bằng

hệ dung môi hexan/axeton với độ phân cực tăng dần (từ 20/1 - 0/1, v/v) thu được 5 phân đoạn chính là F1 (10,0 g), F2 (11,5 g), F3 (8,5 g), F4 (8,8 g) và F5 (1,2 g) Phân đoạn F5 (1,2 g) được tinh chế trên cột nhồi silicagel pha

thường với hệ dung môi rửa giải là clorofoc/axeton (5/2) thu được hợp chất 1

(12 mg) Cặn nước được cho qua cột trao đổi ion sử dụng hạt Dianion HP-20 với hệ dung môi rửa giải là MeOH/H2O với độ phân cực giảm của dung môi

từ nước tới metanol thu được các phân đoạn F6 (50% MeOH, 30,5 g) và F7 (MeOH 100%, 20,0 g) Phân đoạn F6 (50% MeOH, 30,5 g) lần lượt tiến hành sắc ký cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là clorofoc/metanol

F6D (8,9 g) tương ứng Phân đoạn F6C tiếp tục được tinh chế trên cột sắc ký silicagel pha đảo (YMC RP-18) sử dụng hệ dung môi rửa giải metanol/nước

(1/5, v/v) thu được hợp chất 2 (15 mg)

Sơ đồ phân lập:

Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập hợp chất 1

100% axeton 20/1

Bột khô (2kg)

F5 (1,2 g)

F3 (8,5 g)

Cặn clorofoc (50 g)

F4 (8,8 g) Cặn nước (90 g)

Sắc ký cột pha thường Clorofoc/axeton tỉ lệ 5/2