Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của cây cam thảo đất (Scoparia dulcis L.)

MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Do phát triển xã hội kéo theo nhịp sống công nghiệp đại người, không phù hợp thay đổi lối sống, chế độ ăn uống cân đối dinh dưỡng nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh nguy hiểm như: bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus), bệnh béo phì (Obesity), ung thư, tim mạch Trong đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh phát triển nhanh xã hội Đái tháo đường bệnh rối loạn chuyển hóa gây tăng đường huyết mãn tính thiếu insulin tương đối hay tuyệt đối tuyến tụy, không kiểm soát tốt sau thời gian tiến triển kéo dài gây nhiều biến chứng nguy hiểm Bệnh có tính chất dân tộc, chủng tộc trở thành vấn đề mang tính xã hội, bùng phát nhanh chóng, mức độ nguy hại đến sức khỏe, tốn cho người bệnh kinh tế cộng đồng Theo Tổ chức Y tế giới (WHO): năm 1994, giới có 98.9 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, cuối năm 2002 có khoảng 177 triệu người, số tăng lên 300 triệu người vào năm 2025 Riêng châu Á, số liệu công bố hội nghị đái tháo đường quốc tế tổ chức vào tháng 12 năm 1997 Singapo: Năm 1995 châu Á có khoảng 62 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, cuối năm 2002 số 89 triệu người Theo đánh giá Hiệp hội ĐTĐ quốc tế (IDF) năm 2005 số người mắc bệnh đái tháo đường châu Á tăng lên 1.7 lần.WHO cảnh báo xuất đại dịch ĐTĐ châu Á vào kỷ 21 [4], [2] Việt Nam, năm 1990 tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ Hà Nội 1.2%, Huế 0.96% thành phố Hồ Chí Minh 2.5%, năm 2000 Viện Nội tiết Trung ương điều tra khu vực nội thành Hà Nội tỷ lệ ĐTĐ 4% dân số 7% tuổi > 35 tuổi Cuộc điều tra Viện Nội tiết tiến hành năm 2001 thành phố Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ ĐTĐ độ tuổi 30- 64 tuổi 4.9% [4], [2] Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành vấn đề lớn cho sức khỏe bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trình trị liệu lâu dài, đặc biệt ĐTĐ type bệnh phổ biến bệnh ĐTĐ ĐTĐ mang nhiều biến chứng nguy hiểm như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cụt Vì đại đa số người bệnh có nhu cầu chữa bệnh cách an tồn Mỗi năm nước Mỹ hàng tỉ đô la cho điều trị ĐTĐ thuốc tổ chức an toàn thực phẩm dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin Song hầu hết thuốc có nguồn gốc tổng hợp, thường có tác dụng phụ đắt tiền Trước tình hình ủy ban chun gia (WHO) khuyến nghị nên sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ độc tính [4], [2], [23], [39] Từ thực tế đó, nhằm góp phần tìm kiếm nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường thành phần hóa học Cam thảo đất (Scoparia dulcis L ) chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ streptozotocin (STZ), định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh dược cam thảo đất (Scoparia dulcis L ) ” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết số phân đoạn dịch chiết từ Cam thảo đất mơ hình chuột đái tháo đường type thực nghiệm Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát sơ thành phần hợp chất tự nhiên có Cam thảo đất ( Scoparia dulcis L.) Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết Cam thảo đất ( Scoparia dulcis L.) mơ hình chuột ĐTĐ mơ type Đóng góp đề tài Đánh giá khả hạ glucose huyết tác dụng chống rối loạn trao đổi lipid phân đoạn dịch chiết từ cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) mơ hình chuột ĐTĐ mô type Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Cam thảo đất ( Scoparia dulcis L.) 1.1.1 Thực vật học Cam thảo đất có tên khoa học: Scoparia dulcis L., thuộc Họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) Thân cỏ nhỏ, mọc thẳng đứng, cao 30-80 cm Thân tròn, màu xanh, có 4-6 sọc lồi, nhẵn, mang theo cuống lại Lá đơn, mọc vòng không hay mọc đối (những dưới), hình mác, đầu nhọn, dài 2,5-4 cm, khơng có kèm Bìa có 2/3 phía trên, cưa tù, không đều, sâu 1-2 mm Phiến kéo dài men dọc theo bên cuống lá, mặt sẫm, mặt nhạt Khơng có kèm Gân hình lơng chim lồi mặt dưới; 4-5 cặp gân phụ lồi mặt Cuống dài 5-7 mm Cụm hoa mọc riêng rẻ hay thành đơi nách Hoa gần đều, lưỡng tính, mẫu gặp mẫu 5, màu trắng Cuống hoa mảnh, dài 4-6 mm, màu xanh Lá đài 4, rời, đơi gặp đài, màu xanh, hình bầu dục, dài khoảng 2,5 mm, có gân mặt ngồi, mép có lơng, tồn đồng trưởng với Cánh hoa 4, dính (đơi gặp 5) thành ống ngắn, màu trắng phớt tím; chia thành phiến hình bầu dục, gần nhau, dài khoảng mm, uốn cong ngược bên ngồi hoa nở, nhiều lơng màu trắng, dạng sợi, dài gần nhị đính miệng ống tràng Tiền khai: cánh hoa cùng, cánh cùng, cánh hoa lại xen kẽ Nhị 4, rời, đính miệng ống tràng, xen kẽ cánh hoa; nhị hình sợi màu trắng, đỉnh tím, dài khoảng 1,5 mm Bao phấn hình mũi tên, 2ơ, đính giữa, hướng trong, khai dọc Hạt phấn hình bầu dục, có rãnh nỗn vị trí trước-sau, dính liền thành bầu ơ, đựng nhiều nỗn, đính nỗn trung trụ vòi nhụy dài khoảng 1,5 mm đính đỉnh bầu Đầu nhụy màu xanh, dành điểm có thùy, có chất dính Quả nang hủy vách, hình cầu, chứa nhiều hạt nhỏ màu đen Hoa thức Hoa đồ: Đặc điểm giải phẫu: Rễ bần gồm 2-3 lớp tế bào, bị bong, nứt nhiều Tế bào mô mềm vỏ hình tròn hay bầu dục, xếp tạo khuyết lớn Nội bì khung Caspary rõ Trụ bì 1-2 lớp , vài tế bào bị hóa mơ cứng Libe tế bào bị ép dẹp, vách uốn lượn Gỗ chiếm tâm Mô mềm gỗ vách dày Mạch gỗ kích thước lớn, phân bố nhiều thân Tia tủy 1-2 dãy tế bào Thân: Vi phẫu gần vng Các mơ gồm: biểu bì lớp tế bào xếp đặn, cutin có cưa, mang lỗ khí rải rác lơng tiết chân đa bào hay đơn bào, đầu đa bào Ở thân già, 2-3 lớp bần xuất lớp biểu bì Mơ dày góc tập trung góc thân, cạnh ít, gặp sợi mơ dày Ở thân già, mơ dày góc bị hóa mơ cứng Mơ mềm vỏ mơ mềm khuyết, 3-6 lớp tế bào hình tròn hay bầu dục, kích thước khơng Nội bì khung Caspary rõ Trụ bì 1-2 lớp tế bào, hóa mơ cứng riêng lẻ hay thành đám nhỏ Libe 2-gỗ thành vòng liên tục Gỗ phân bố Mô mềm gỗ vách dày Tia tủy 1-2 dãy tế bào, vách mỏng mơ mềm gỗ Mơ mềm tủy hình tròn, kích thước không Lá: Gân giữa: Lồi rõ mặt dưới, mặt phẳng Biểu bì biểu bì tế bào xếp không đều, mang lông tiết chân đa bào đơn bào, đầu đa bào Biểu bì mang lỗ khí Lớp cutin có cưa Dưới biểu bì 1-2 lớp mơ dày góc Mơ mềm tế bào hình cầu, kích thước khơng đều, xếp chừa khuyết nhỏ Các bó libe-gỗ xếp thành hình vòng cung Phiến lá: biểu bì tế bào lớn biểu bì dưới, kích thước khơng đều, nhiều tế bào nhơ lên thành đỉnh nhọn tù Lông tiết chân ngắn, đầu đa bào lỗ khí biểu bì Lớp cutin có cưa cạn Mơ mềm giậu gồm lớp tế bào kích thước khơng Mơ mềm khuyết tế bào vách mỏng, kích thước khơng 1.1.2 Phân loại, nguồn gốc phân bố Cam thảo đất Phân bố, sinh học sinh thái: Gốc nhiệt đới Châu Mỹ, hóa tất vùng nhiệt đới giới Ở nước ta, mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam Thường gặp đất hoang, dọc bờ đường, dải cát sông ruộng khô, vùng thấp 1.1.3 Thành phần hóa học Cây chứa alcaloid chất đắng; có nhiều acid silicic hoạt chất gọi amellin Phần mặt đất chứa chất dầu sền sệt, mà thành phần có dulciol, scopariol, (+) manitol, glucose Rễ chứa (+) manitol, tanin, alcaloid, hợp chất triterpen Vỏ rễ chứa hexcoxinol,  sitosterol (+) manitol 1.1.4 Một số tác dụng Sinh - Dược công dụng Cam thảo đất Thường dùng trị: cảm cúm, sốt, nóng nhiều, ho khan, ho có đàm Lỵ trực trùng Tê phù, phù thủng, giảm niệu Dùng ngoài, ép lấy dịch từ tươi trị mụn nhọt, lở ngứa, eczema Hoạt chất amellin cam thảo đất làm giảm đường máu triệu chứng bệnh đái tháo đường type2, khiến cho trình giảm nồng độ đường máu nước tiểu diễn Nó làm tăng mức dự trữ kiềm bị hạ thấp người bệnh nhân giảm hàm lượng chất tạo ceton máu 1.2 Giới thiệu số hợp chất tự nhiên thực vật * Các chất thứ sinh thực vật (plant secondary metabolites) Ở thực vật, protein, saccarid, lipid, vitamin, có chất khác có vai trò quan trọng đổi chất gọi chất thực vật thứ sinh (plant secondary metabolites) Căn vào tính chất hóa học, hợp chất thực vật thứ sinh chia thành số nhóm như: nhóm phenolic, nhóm terpen nhóm alkaloid Nhiều cơng trình nghiên cứu gần cho thấy hợp chất polyphenol (thuộc nhóm hợp chất phenolic) ngày ứng dụng rộng rãi điều trị số bệnh nan y như: ung thư, béo phì, tiểu đường … a Các hợp chất phenolic từ thực vật Hợp chất phenolic nhóm chất khác phổ biến thực vật Đặc điểm chung chúng phân tử có vòng thơm (benzene) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzene Dựa vào thành phần cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành nhóm nhỏ [41]:  Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử có vòng benzene vài nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng gọi monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…)  Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử chúng ngồi vòng thơm benzene (C6) chúng có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm có axid cyamic, axid ceramic  Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp liên kết trùng hợp đơn phân Ngoài gốc phenol có nhóm phụ dị vòng mạch nhánh đa vòng Nhóm có flavonoid, tannin coumarin Hợp chất phenolic hình thành cách dễ dàng tất quan thực vật từ sản phẩm đường phân chu trình pentose phosphate qua acid sikimic hay theo đường acetate manolate qua acetyl – SCoA Trong số chất polyphenol tự nhiên, flavonoid nhóm chất quan trọng chúng phổ biến hầu hết loài thực vật mang nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị b Flavonoid Flavonoid sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus - nghĩa màu vàng) Tuy nhiên số sắc tố khác xanh, đỏ, tím,…hoặc khơng màu xếp vào nhóm flavonoid chúng có chung đặc điểm cấu tạo • Cấu tạo hóa học phân loại Về cấu tạo hóa học, khung cacbon flavonoid C6 - C3 - C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A B nối với qua dị vòng C, A kết hợp với C tạo khung chroman 2' 10 B 1' 6' C A 3' O 4' 5' Flavan (2-phenyl chroman ) Tùy theo mức độ oxy hóa vòng pyran, có mặt hay khơng có mặt nối đơi C2 với C3 nhóm cacbonyl C4 mà phân biệt flavonoid thành nhóm phụ sau: Flavon flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol, leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid neoflavonoid • Hoạt tính sinh học flavonoid * Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant) Flavonoid có khả kìm hãm q trình oxy hóa dây truyền gây gốc tự hoạt động Tuy nhiên hoạt tính mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm flavonoid cụ thể Gốc tự sinh trình sinh lý bình thường thể hay tác động bên nguyên nhân gây phá hủy ADN, protein, lipid làm phát sinh nhiều bệnh tật nguy hiểm lão hóa cho thể Flavonoid có chất polyphenol nên dễ dàng biến đổi tác động enzyme có tế bào động, thực vật Đặc biệt flavonoid có nhóm hyđroxyl vị trí ortho dễ dàng bị oxy hóa xúc tác enzyme polyphenoloxydase peroxydase tạo semiquynol quynol [27] Đây gốc tự bền vững chúng nhận điện tử trở thành dạng hidroquynol Bởi chất có khả phản ứng với gốc tự hoạt động loại chúng khỏi thể Q trình tóm tắt qua sơ đồ sau: O2 + Flavonoid (khử) Polyphenoloxydase Flavonoid (oxy hoá) Peroxydase (Hiđroquynol) Polyphenoloxyase Peroxydas e (semiquynol quynol) Ngồi flavonoid có tác dụng bảo vệ hệ thống sinh học nhờ khả +2 +2 tạo phức với kim loại chuyển tiếp Fe , Cu … hoạt hóa enzyme chống oxy hóa ức chế oxy hóa * Tác dụng kháng khuẩn Nhiều cơng trình nghiên cứu nước giới chứng tỏ tác dụng chống viêm nhiễm (anti-inflamatory) chống vi khuẩn (anti-bacterial) virut (antiviral) [5], [12] * Tác dụng làm bền thành mạch máu Các dẫn xuất đường flavonoid có hoạt tính vitamin P rutin, hesperidin… có tác dụng làm tăng sức bền tính đàn hồi thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu hồng cầu qua thành mao mạch Hoạt tính ứng dụng chữa trị rối loạn chức tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [21] * Tác dụng giảm béo phì lipid máu Theo kết nghiên cứu nhà khoa học Nhật cho thấy chuột béo phì điều trị dịch chiết giàu flavonoid từ Bằng lăng (Lagerstroemia specciosa L.) có trọng lượng giảm đáng kể (~ 10% ) [62] Thí nghiệm tương tự với flavonoid từ Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) chuột cống trắng uống cholesterol cho thấy có tác dụng làm giảm số cholesterol, triglycerid, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [35] Naringin (C17H32O4) hesperidin (C28H34O15) flavonoid có hàm lượng cao họ cam chanh (Rutaceae) nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất thử tác dụng mơ hình chuột béo phì cho kết tốt việc làm hạ số lipid máu [36], [40] * Tác dụng hạ glucose huyết O OH OH OH OH HO H3OC O HO HO O OH O Quercetin O O O HO CH3 OH OH O O HO OH OH OH HO OH OH Hesperidin Epicatechin Một số flavonoid tách chiết từ nguyên liệu thực vật chứng minh có tác dụng điều hòa glucose huyết như: Quercetin có Đỗ trọng (Eucommia ulmoides Oliver.) [54], Hesperidin Naringin có thuộc họ Rutaceae [39], Genistein Daidzein có Đậu nành (Glycine max L.) [18], Myricetin có Vơng vang (Abelmoschus moschatus) [18] c Tannin thực vật Tannin hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao có chứa nhóm hydroxyl nhóm chức khác có khả tạo phức với protein phân tử lớn khác điều kiện môi trường đặc biệt Tannin thường hợp chất vơ định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt gần khơng màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hóa đun nóng hay để ánh sáng Tác dụng sinh học tannin chất bảo vệ trồng trước công vi sinh vật gây bệnh côn trùng ăn [42], [50] Trong y học, tannin sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chữa trĩ, viêm miệng, viêm xoang, điều trị cao huyết áp đột quỵ [1] 10 Trước tiêm mmol/l Sau tiêm 25 Glucose huyết lúc đói 21.3 20 15 10 6.5 6.56 6.82 6.93 7.74 7.86 8.2 - Chuột thường tiêm đệm - Chuột thường tiêm STZ (100mg/1kg) - Chuột béo phì tiêm đệm - Chuột béo phì tiêm STZ (100mg/1kg) Hình.3.5 Nồng độ glucose huyết lúc đói lơ chuột thí nghiệm trước sau tiêm 72 Hiện nay, có nhiều mơ hình ĐTĐ mơ type 2, mơ hình ĐTĐ di truyền, chuột thường ĐTĐ, mơ hình chuột béo phì ĐTĐ ưa chuộng nhiều đặc điểm bệnh lý giống với ĐTĐ type người [47], [62], [64] Tuy nhiên, khả gây đái tháo đường type chuột tuỳ thuộc nhiều yếu tố dòng chuột lựa chọn thời gian chế độ nuôi béo, liều tiêm STZ Nhiều cơng trình khác cơng bố hiệu mơ hình [18], [21], [54], [47], [49], [53], [56], [57], [60], [64] Qua tham khảo thử nghiệm chúng tơi thấy rằng: Đối với dòng chuột chủng Swiss, để gây ĐTĐ với hiệu suất cao cần có thời gian nuôi béo dài thông thường từ 4- tuần, kết hợp với tiêm STZ liều thấp Căn vào liều STZ gây ĐTĐ type chuột cống Reed cộng (thường 50mg/kg thể trọng), thấy chuột nhắt trắng cần tiêm liều cao thông thường từ 90 – 120mg/kg thể trọng Kế thừa nghiên cứu trước [17], [18], [23]…, định chọn tiêm liều 110mg/kg thể trọng Với liều tiêm vậy, đạt hiệu suất gây đái tháo đường 85% chuột có đường huyết ≥ 18mmol/l Lơ chuột thường tiêm STZ với liều trên, nồng độ glucose huyết lúc đói có tăng nhẹ sau tiêm nhanh chóng trở mức bình thường (nồng độ glucose lúc đói trước sau 72 tiêm tương ứng 6.82 6.93 mmol/l) Đối với lơ chuột béo phì tiêm STZ nồng độ glucose sau 72 tiêm tăng cách rõ rệt (từ 8.2 mmol/l trước tiêm lên 21.3 mmol/l sau tiêm 72 giờ) Chúng nhận thấy phần lớn chuột béo có khả bị đái tháo đường càng, điều phù hợp với nghiên cứu Reed - chế độ nuôi béo ảnh hưởng rõ rệt đến khả gây ĐTĐ Từ cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ tượng béo phì, nhiễm độc lipid máu, nhiễm độc hóa chất (mà STZ) tượng kháng insulin [60] Việc ni béo phì đơn hay tiêm STZ liều thấp đơn có khả dẫn đến tượng kháng insulin ĐTĐ type Từ kết trên, suy luận là: người béo phì, nhạy cảm với chất độc từ môi trường (STZ đại diện tiêu biểu thí nghiệm), dễ phát triển bệnh ĐTĐ type Đây tác dụng cộng gộp nhiễm độc lipid máu hóa chất độc từ mơi trường bên Kết thử nghiệm gây ĐTĐ với liều 110mg/kg thể trọng góp phần làm phong phú hồn thiện mơ hình ĐTĐ chúng tơi Từ đưa quy trình gây ĐTĐ sử dụng cho nghiên cứu sau 3.5.2 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Cam thảo đât đến nồng độ glucose huyết lúc đói chuột ĐTĐ Với mơ hình thí nghiệm phần phương pháp nghiên cứu, thu kết thể bảng 3.9 hình 3.6 sau: Bảng 3.9 Kết nồng độ glucose huyết lúc đói lô chuột sau 21 ngày điều trị Nồng độ glucose huyết lúc đói (mmol/l) Số lơ PT ĐT ĐC Ko.ĐT Met chloroform n- hexan Cao Nước ethylacetat Trước ngày 10 ngày 15 ngày 21 ngày điều trị điều trị điều trị điều trị điều trị 6.36 6.19* 6.16* 6.35* 6.22* ±0.6 ±0.59 ±0.41 ±0.68 ±0.53 ↓2.7 ↓3.21 ↓0.19 ↓2.2 21.29 20.51* 20.39* 20.61* 20.53* ±4.19 ±1.57 ±1.71 ±0.93 ±1.5 ↓3.66 ↓4.23 ↓3.18 ↓3.56 22.58 17.25** 15.83** 13.03** 10.18** ±4.52 ±1.06 ±0.9 ±0.96 ±2.63 ↓23.61 ↓29.89 ↓42.28 ↓54.91 23.16 18.45** 16.32** 14.08** 7.99*** ±3.58 ±2.02 ±1.49 ±1.67 ±2.38 ↓20.33 ↓29.53 ↓39.21 ↓65.48 22.16 18.88** 16.37** 13.57** 7.78*** ±2.13 ±1.62 ±1.5 ±1.19 ±2.37 ↓14.78 ↓26.11 ↓38.78 ↓64.9 22.37 18.26** 16.34** 12.71*** 11.09** ±1.89 ±1.1 ±1.76 ±1.36 ±1.64 ↓18.35 ↓26.95 ↓43.16 ↓50.42 23.14 18.69** 16.24** 12.74** 10.43** ±3.21 ±1.59 ±2.06 ±1.89 ±2.25 ↓19.25 ↓29.8 ↓44.96 ↓54.94 22.06 15.73** 13.04** 14.39** 7.8*** ±5.17 ±1.93 ±1.83 ±0.68 ±1.7 ↓28.7 ↓40.87 ↓34.78 ↓64.64 Ghi chú: Số liệu thể bảng giá trị trung bình chuột/lô; giá trị p là: *:(p>0.05); **:(p