Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí Đao (Benincasa hispida Cogn.)

1 Lời cảm ơn Trong trình tìm hiểu, nghiên cứu hồn thành luận văn tốt ngiệp, tơi nhận lời bảo, hướng dẫn tận tình cô giáo: Tiến sĩ Trần Thị Phương Liên Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Trung tâm chuyển giao cơng nghệ, Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình làm việc Cùng với hỗ trợ định từ gia đình, bạn bè đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu đó! Xn Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Mạnh Cường DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮ DÙNG TRONG LUẬN VĂN ĐTD Đái tháo đường HDL –c High density lipoprotein cholesterol (Cholesterol tỉ trọng cao) VLDL –c Very low dentisy lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp LDL –c liên kết cholesterol) Low dentisy lipoprotein cholesterol (Lipoprotein liên kết cholesterol) STZ Streptozotocin TC Total cholesterol (Cholesterol toàn phần) TG Triglyxeride MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn trao đổi chất với biểu chung chứng tăng đường huyết Căn bệnh trở thành mối nguy hại toàn cầu trung bình 10 giây có người tử vong ĐTĐ Hiện tồn giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Dự báo đến năm 2030, số tăng lên 366 triệu người Thống kê Hội Người giáo dục bệnh ĐTĐ Việt Nam cho thấy, năm 2002, tỷ lệ người mắc ĐTĐ chiếm 2,7% dân số số lên 7,2%, khu vực đô thị, thành phố lớn tập trung nhiều người mắc ĐTĐ khơng có tính chất bệnh mạn tính, ĐTĐ kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm bệnh thận dẫn đến suy thận, bệnh mắt dẫn đến mù lòa, tổn thương hệ thần kinh đặc biệt biến chứng mạch máu (xơ vữa động mạch) dẫn đến tử vong bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não…[17], [45], [23], [7], [16] Y học ngày có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu insulin, sulfonylurea, biguanid, Tuy nhiên, hầu hết loại thuốc có tác dụng phụ chi phí điều trị đắt đỏ [10], [30], [2], [22] Những kinh nghiệm cổ truyền công bố khoa học đại cho thấy bí đao ăn thuốc hữu hiệu phòng chống bệnh liên quan đến oxy hố, có thừa cân béo phì bệnh tim mạch khác Với lí trên, nhằm góp phần tìm kiếm nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường từ thành phần hóa học Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ streptozotocin (STZ), định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc tính hố sinh dược số phân đoạn dịch chiết từ Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)” Mục đích nghiên cứu Đánh giá hoạt tính sinh dược học số phân đoạn dịch chiết từ Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1 Khảo sát sơ thành phần hợp chất tự nhiên có Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) 3.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau 3.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) mơ hình chuột ĐTĐ mô type Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Đóng góp đề tài Đánh giá khả hạ glucose huyết số phân đoạn dịch chiết lên mơ hình chuột ĐTĐ mơ type thơng qua số glucose huyết, số lipit máu chuột sau 21 ngày điều trị NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu số hợp chất tự nhiên thực vật 1.1.1 Flavonoid thực vật Trong số polyphenol tự nhiên, flavonoid nhóm chất quan trọng chúng phổ biến hầu hết lồi thực vật có nhiều hoạt tính sinh - dược học có giá trị [9] 1.1.1.1 Cấu tạo hố học phân loại 1.1.1.2 Hoạt tính sinh học flavonoid * Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant) * Tác dụng kháng khuẩn * Tác dụng làm bền thành mạch máu * Tác dụng giảm béo phì lipid máu 1.1.2 Hợp chất phenolic 1.1.2.1 Phân loại Dựa vào thành phần cấu trúc, người ta chia hợp chất phenolic thành nhóm: - Nhóm hợp chất phenolic đơn giản - Nhóm hợp chất phenolic phức tạp - Nhóm hợp chất phenolic đa vòng 1.1.2.2 Vai trò hợp chất phenolic thực vật Hợp chất phenolic hình thành từ sản phẩm trình đường phân đường pentose qua acid cynamic hay theo đường acetate malonate qua Acetyl- CoA Nhóm hợp chất có số chức đời sống thực vật [8], [60] 1.1.3 Tannin thực vật 1.1.3.1 Cấu trúc hoá học phân loại Tannin cấu tạo dựa acid gallic acid tanic Tannin có nhóm chính: tannin thuỷ phân tannin ngưng tụ - Tannin thuỷ phân - Tannin ngưng tụ 1.1.3.2 dụng sinh học 1.1.4 Alkaloid 1.1.4.1 hái quát Alkaloid Alkaloid có tính kiềm yếu, mạch cacbon chứa nitơ định Chúng liên kết với kim loại nặng tạo phức phản ứng với số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa màu nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng ánh vàng) hay Dragendroff (màu da cam, nâu đỏ) 1.1.4.2 Tác dụng sinh học Alkaloid hình thành từ sản phẩm trình trao đổi chất trao đổi protein Ở cây, alkaloid coi chất dự trữ cho tổng hợp protein, chất bảo vệ cây, tham gia vào chuyển hoá hydro mức độ khác [8], [30] 1.1.5 Hợp chất coumarin 1.1.6 Terpen thực vật 1.2 Bệnh béo phì (Obesity) Tổ chức y tế giới (WHO) định nghĩa béo phì (Obesity) tình trạng tích lũy mỡ q mức khơng bình thường vùng hay toàn thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe Tổ chức dùng số khối thể BMI (Body Mass Index) để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt mỡ người Bảng 1.1 Phân loại BMI người trưởng thành châu Âu châu Á [2] 1.2.1 Thực trạng béo phì giới Việt Nam Theo tổ chức y tế giới (WHO) số người béo phì lên tới 1,7 tỉ người [3], không gặp nhiều quốc gia phát triển mà gặp quốc gia phát triển Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn cho người châu Á, số người thừa cân béo phì tăng theo thời gian Năm 1991 theo điều tra Lê Huy Liệu cộng tỉ lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung Hà Nội 1,1% Đến năm 2000 số 2,62% tăng gần 2,5 lần vòng 10 năm (điều tra Lê Văn Hải) [3] 1.2.3 Tác hại nguy bệnh béo phì Người béo phì có nguy bệnh tật cao so với người thường nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu như: * Bệnh tim mạch * Rối loạn lipid máu * Tiểu đường * Đột qụy * Ngoài béo phì làm gia tăng nguy nhiều bệnh khác 1.2.4 Nguyên nhân giải pháp phòng, điều trị béo phì Ngun nhân dẫn đến thừa cân béo phì phần thói quen dinh dưỡng không hợp lý, hoạt động thể lực dẫn đến lượng hấp thụ vào thể vượt mức cần thiết tích lũy dạng mỡ Thuốc chống béo phì chia làm hai nhóm lớn * Nhóm có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương * Nhóm tác dụng lên hệ tiêu hóa Thuốc điều trị béo phì phổ biến Metformin thuộc nhóm hai với tác dụng chủ yếu ức chế phân giải glycogen thành glucose gan, làm tăng tính nhạy cảm insulin ngoại vi, tác động hạ glucose khoảng - mmol/l, giảm HbA1C đến 2% 1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid máu Để đánh giá lượng mỡ máu người ta làm xét nghiệm với số: * Cholesterol toàn phần (2,9 – 5,2 mmol/l); * Triglycerid (0,8 – 2,3 mmol/l); * HDL-c (0,90 – 1,50 mmol/l); * LDL-c (0,5 – 3,4 mmol/l) 1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus) 1.3.1 Khái niệm phân loại Danh từ đái tháo đường (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (Diabetes: nước chảy ống syphon) tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [65] Khoảng 1550 năm trước công nguyên thầy thuốc Hy Lạp mô tả bệnh với triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường sút cân nhanh [4] PGS TS Tạ Văn Bình định nghĩa đái tháo đường hội chứng có đặc tính biểu tăng đường máu, hậu việc hồn tồn insulin có liên quan đến suy yếu tiết hoạt động insulin Bệnh ĐTĐ xác định dựa vào tiêu chí bảng 1.2 [4] Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đốn ĐTĐ theo WHO Dựa vào hiểu biết nguyên nhân phát sinh bệnh, ủy ban chuyên gia chuẩn đoán phân loại ĐTĐ WHO chia ĐTĐ thành loại sau: ĐTĐ type 1; ĐTĐ type 1.3.2 Thực trạng đái tháo đường giới Việt Nam Cùng với bệnh không lây nhiễm khác, bệnh ĐTĐ phát triển với tốc độ nhanh chóng phát triển kinh tế xã hội Năm 1994, toàn giới có 98,9 triệu người mắc ĐTĐ Năm 1995 tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân số giới, cuối năm 2002 có khoảng 177 triệu người [2] Dự đốn đến năm 2010 có khoảng 222 triệu năm 2025 có khảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân số giới [2] Việt Nam ĐTĐ gia tăng nhanh Hiện nay, có khoảng hai triệu người mắc bệnh ĐTĐ có tới 65% số khơng biết mắc bệnh Theo PGS TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type lứa tuổi thiếu niên ngày tăng nhanh, vấn đề đáng lưu tâm [2] 1.3.3 Tác hại biến chứng ĐTĐ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe khả làm việc người lao động, nguy biến chứng bệnh nhân thường cao [4] Biến chứng mắt Biến chứng thận Biến chứng thần kinh ngoại vi Tổn thương bàn chân Biến chứng mạch máu lớn 1.3.4 Phòng điều trị bệnh ĐTĐ Trừ nguyên nhân di truyền ăn uống sinh hoạt hợp lý điều độ khám sức khỏe định kỳ phương thức chung để phòng bệnh nói chung bệnh ĐTĐ nói riêng 1.3.5 Chuyển hóa glucose điều hòa glucose huyết 1.4 Mối quan hệ béo phì đái tháo đường Béo phì ĐTĐ hai bệnh khơng truyền nhiễm nguy hiểm kỉ 21 Hai bệnh có mối liên quan chặt chẽ với thể chỗ tỉ lệ người béo phì ln tăng tương đương với số bệnh nhân bị Tại Việt Nam, theo kết nghiên cứu Trần Đức Thọ cộng năm 1996 người có BMI > 25 có nguy mắc ĐTD týp cao gấp 3,74 lần so với người bình thường Nghiên cứu Thái Hồng Quang, tỷ lệ ĐTD người có béo phì độ cao lần béo phì độ 30 lần so với người bình thường 1.5 Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm STZ 1.6 Vài nét chung Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) 1.6.1 Giới thiệu Bí đao hay bí phấn bí trắng, danh pháp khoa học: Benincasa hispida Cogn; họ bầu bí (Cucurbitaceae) tiêm vậy, chúng tơi đạt hiệu suất gây ĐTĐ 87% chuột có đường huyết ≥ 18mmol/l Lô chuột thường tiêm STZ với liều trên, nồng độ glucose huyết lúc đói có tăng nhẹ sau tiêm (nồng độ glucose lúc đói trước sau 72 tiêm tương ứng 6.56 8.04 mmol/l) Điều chuột ăn chuẩn tự điều chỉnh nồng độ glucose máu nhờ tăng lượng Insulin tiết để điều hòa lượng glucose máu Đối với lơ chuột béo phì tiêm STZ nồng độ glucose sau 72 tiêm tăng cách rõ rệt (từ 7.51mmol/l trước tiêm lên 21.22 mmol/l sau tiêm 72 giờ) 3.5.2 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Bí đao đến nồng độ glucose huyết lúc đói chuột ĐTĐ Với mơ hình thí nghiệm phần phương pháp nghiên cứu, thu kết thể bảng 3.9 hình 3.6 sau: Bảng 3.9 Kết nồng độ glucose huyết lúc đói lơ chuột sau 21 ngày điều trị Các lô chuột điều trị Chuột ăn chuẩn Chuột ĐTĐ không điều trị Chuột ĐTĐ + Met Nồng độ glucose huyết lúc đói (mmol/l) Trước ngày 10 ngày 15 ngày 21 ngày điều trị điều trị điều trị điều trị điều trị 6.5 6.7* 6.4* 6.8* 6.7* ±0.4 ±0.2 ±0.3 ±0.5 ±0.1 (↑2.2%) (↓1.4%) (↑4.8%) (↑2.5%) 21.8 23.3* 22.5* 24.1* 22.9* ±4.1 ±1.4 ±1.3 ±1 ±1.4 (↑6.6%) (↑3.3%) (↑10.5%) (↑4.8%) 20.5 15.6** 15.1** 11.8*** 9.1*** ±3.7 ±1.4 ±1.6 ±1.5 ±1.6 (↓24.2%) (↓26.5%) (↓42.5%) (↓55.9%) Chuột ĐTĐ 25.7 17.9** 16.8** 14.3** 10.1** + Cao nước ±2.6 ±3.9 ±3.0 ±3.1 ±1.6 Chuột ĐTĐ + CHCl3 Chuột ĐTĐ + EtOAc Chuột ĐTĐ + nHexan Chuột ĐTĐ + EtOH (↓30.6%) (↓34.8%) (↓44.5%) (↓60.7%) 21.6 15.5** 16.1** 13.4** 7.7** ±4.7 ±1.9 ±2.0 ±1.3 ±0.35 (↓28.4%) (↓25.3%) (↓42.4%) (↓64.5%) 22.3 15.5** 14.1** 10.9** 8.4** ±3.9 ±1.9 ±2.5 ±1.3 ±1.6 (↓30.6%) (↓36.7%) (↓51.2%) (↓62.3%) 21.3 14.8** 14.5** 11.6** 10.3*** ±4.4 ±1.9 ±1.6 ±0.9 ±0.6 (↓30.8%) (↓31.7%) (↓45.5%) (↓52.1%) 22.4 16.5** 15** 11.9** 9.3** ±4.7 ±1.3 ±1.8 ±1.8 ±0.8 (↓25.7%) (↓32.8%) (↓46.8%) (↓58.1%) (Ghi chú: Số liệu thể bảng giá trị trung bình chuột/lơ; giá trị p là: *:(p>0.05); **:(p17.15mmol/l) phần lớn chuột béo có khả bị ĐTĐ cao Một số phân đoạn dịch chiết từ Bí đao có khả hạ đường huyết mơ hình chuột ĐTĐ: Hàm lượng glucose huyết lô chuột uống lô chuột uống cao n-Hexan giảm 52.1%; lô chuột uống phân đoạn cao cồn tổng số giảm 58.1%; cao phân đoạn nước giảm 60.7%; lô chuột uống cao phân đoạn ethylacetate nồng độ glucose huyết giảm tới 62.3% giảm mạnh lô chuột uống cao chloroform giảm 64.5% so với lơ bình thường Với liều uống 2000mg/kg thể trọng chuột ĐTĐ cao phân đoạn CHCl3 cao phân đoạn EtOAc, sau 21 ngày điều trị số Cholesterol toàn phần giảm tương ứng 14.18% 16.67%, số triglixerit giảm tương ứng 26.31% 28.8%; số LDL-c giảm mạnh nhất: giảm 339.19% điều trị phân đoạn cao chloroform giảm 42.4% điều trị phân đoạn cao EtOAc Mặt khác số HDL – c lại có xu hướng tăng mạnh: tăng 151% điều trị phân đoạn cao chloroform tăng 154% điều trị phân đoạn cao EtOAc (p