Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của cây cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) (LV00645)

Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ cây Cam thảo đất trên mô hình chuột đái tháo đường type 2 thực nghiệm.. Dùng

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Do sự phát triển của xã hội hiện nay kéo theo nhịp sống công nghiệp hiện đại của con người, sự không phù hợp về thay đổi lối sống, các chế độ ăn uống mất cân đối dinh dưỡng là nguyên nhân dẫn đến nhiều căn bệnh nguy hiểm như: bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus), bệnh béo phì (Obesity), ung thư, tim mạch Trong đó đái tháo đường (ĐTĐ) là căn bệnh phát triển nhanh nhất hiện nay của xã hội

Đái tháo đường là một bệnh rối loạn chuyển hóa gây tăng đường huyết mãn tính do thiếu insulin tương đối hay tuyệt đối của tuyến tụy, nếu không kiểm soát tốt sau một thời gian tiến triển kéo dài có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm Bệnh có tính chất dân tộc, chủng tộc đã và đang trở thành vấn đề mang tính

xã hội, bởi sự bùng phát nhanh chóng, mức độ nguy hại đến sức khỏe, tốn kém cho người bệnh và kinh tế cộng đồng

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO): năm 1994, thế giới có 98.9 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, cuối năm 2002 có khoảng 177 triệu người, con số này

đã tăng lên 300 triệu người vào năm 2025 Riêng châu Á, số liệu công bố tại hội nghị đái tháo đường quốc tế tổ chức vào tháng 12 năm 1997 tại Singapo: Năm

1995 châu Á có khoảng 62 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, cuối năm 2002 con số này là 89 triệu người Theo đánh giá của Hiệp hội ĐTĐ quốc tế (IDF) năm 2005

số người mắc bệnh đái tháo đường tại châu Á tăng lên 1.7 lần.WHO đã cảnh báo

có thể xuất hiện đại dịch ĐTĐ ở châu Á vào thế kỷ 21 [4], [2]

Việt Nam, năm 1990 tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Hà Nội là 1.2%, Huế là 0.96%

và thành phố Hồ Chí Minh là 2.5%, năm 2000 Viện Nội tiết Trung ương điều tra tại khu vực nội thành Hà Nội tỷ lệ ĐTĐ là 4% dân số và 7% ở tuổi > 35 tuổi Cuộc điều tra do Viện Nội tiết tiến hành năm 2001 tại 4 thành phố Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng và thành phố Hồ Chí Minh đã cho thấy tỷ lệ ĐTĐ trong độ tuổi 30- 64 tuổi là 4.9% [4], [2]

Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn đề lớn cho sức khỏe vì bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trong quá trình trị

liệu lâu dài, đặc biệt là ĐTĐ type 2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ ĐTĐ có thể mang nhiều biến chứng nguy hiểm như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cụt Vì vậy đại đa số người bệnh đều có nhu cầu chữa bệnh một cách an toàn Mỗi năm nước Mỹ đã phải chi hàng tỉ đô la cho điều trị ĐTĐ bằng các thuốc do tổ chức an toàn thực phẩm và dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin Song hầu hết các thuốc này đều có nguồn gốc tổng hợp, thường có tác dụng phụ và đắt tiền Trước tình hình đó ủy ban chuyên gia của (WHO) đã khuyến nghị nên sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ và ít độc tính [4], [2], [23], [39]

Từ thực tế đó, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu thuốc điều trị đái

tháo đường và thành phần hóa học cơ bản của cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis

L ) trên chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ bằng streptozotocin (STZ), chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh dược của cây cam thảo đất (Scoparia dulcis L ) ”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu đặc tính hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ cây Cam thảo đất trên mô hình chuột đái tháo đường type 2 thực nghiệm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

1 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong cây Cam thảo

đất ( Scoparia dulcis L.)

2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau

3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết cây

Cam thảo đất ( Scoparia dulcis L.) trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2

4 Đóng góp mới của đề tài

Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết và tác dụng chống rối loạn trao

đổi lipid của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây cam thảo đất (Scoparia dulcis L.)

trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây Cam thảo đất ( Scoparia dulcis L.)

1.1.1 Thực vật học

Cam thảo đất có tên khoa học: Scoparia dulcis L., thuộc Họ Hoa mõm chó

(Scrophulariaceae) Thân cỏ nhỏ, mọc thẳng đứng, cao 30-80 cm Thân tròn, màu xanh, có 4-6 sọc lồi, nhẵn, mang theo cuống lá còn lại Lá đơn, mọc vòng 3 lá không bằng nhau hay mọc đối (những lá ở dưới), hình mác, đầu hơi nhọn, dài 2,5-4 cm, không có lá kèm Bìa lá có răng ở 2/3 phía trên, răng cưa tù, không đều, sâu 1-2 mm Phiến lá kéo dài men dọc theo 2 bên cuống lá, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt Không có lá kèm Gân lá hình lông chim lồi ở mặt dưới; 4-5 cặp gân phụ hơi lồi ở mặt dưới Cuống lá dài 5-7 mm Cụm hoa mọc riêng rẻ hay thành đôi ở nách lá Hoa gần đều, lưỡng tính, mẫu 4 đôi khi gặp mẫu 5, màu trắng Cuống hoa mảnh, dài 4-6 mm, màu xanh Lá đài 4, rời, đôi khi gặp 5 lá đài, màu xanh, hình bầu dục, dài khoảng 2,5 mm, có 3 gân nổi ở mặt ngoài, mép có lông, tồn tại và đồng trưởng với quả Cánh hoa 4, dính nhau ở dưới (đôi khi gặp 5) thành ống rất ngắn, màu trắng phớt tím; trên chia thành 4 phiến hình bầu dục, gần như đều nhau, dài khoảng 2 mm, uốn cong ngược ra bên ngoài khi hoa nở, nhiều lông màu trắng, dạng sợi, dài gần bằng nhị đính ở miệng ống tràng Tiền khai: 1 cánh hoa ở ngoài cùng, 1 cánh ở trong cùng, 2 cánh hoa còn lại xen kẽ nhau Nhị

4, rời, đính trên miệng ống tràng, xen kẽ cánh hoa; chỉ nhị hình sợi màu trắng, đỉnh hơi tím, dài khoảng 1,5 mm Bao phấn hình mũi tên, 2ô, đính giữa, hướng trong, khai dọc Hạt phấn hình bầu dục, có rãnh 2 lá noãn ở vị trí trước-sau, dính liền thành bầu trên 2 ô, mỗi ô đựng nhiều noãn, đính noãn trung trụ 1 vòi nhụy dài khoảng 1,5 mm đính ở đỉnh bầu Đầu nhụy màu xanh, dành điểm có 2 thùy,

có chất dính Quả nang hủy vách, hình cầu, trong chứa nhiều hạt nhỏ màu đen Hoa thức và Hoa đồ:

Đặc điểm giải phẫu: Rễ bần gồm 2-3 lớp tế bào, bị bong, nứt nhiều Tế bào

mô mềm vỏ hình tròn hay bầu dục, xếp tạo những khuyết rất lớn Nội bì khung Caspary rõ Trụ bì 1-2 lớp , một vài tế bào bị hóa mô cứng Libe 2 tế bào bị ép dẹp, vách uốn lượn Gỗ 2 chiếm tâm Mô mềm gỗ vách rất dày Mạch gỗ kích thước lớn, phân bố đều và nhiều hơn ở thân Tia tủy 1-2 dãy tế bào Thân: Vi phẫu gần như vuông Các mô gồm: biểu bì là 1 lớp tế bào xếp đều đặn, cutin có răng cưa, mang lỗ khí và rải rác lông tiết chân đa bào hay đơn bào, đầu đa bào Ở thân già, 2-3 lớp bần xuất hiện ngay dưới lớp biểu bì Mô dày góc tập trung ở 4 góc thân, ở cạnh rất ít, thỉnh thoảng gặp sợi trong mô dày Ở thân già, mô dày ở 4 góc bị hóa mô cứng Mô mềm vỏ là mô mềm khuyết, 3-6 lớp tế bào hình tròn hay bầu dục, kích thước không đều Nội bì khung Caspary rõ Trụ bì 1-2 lớp tế bào, hóa mô cứng riêng lẻ hay thành đám nhỏ Libe 2-gỗ 2 thành vòng liên tục Gỗ 1 phân bố đều Mô mềm gỗ vách rất dày Tia tủy 1-2 dãy tế bào, vách mỏng hơn

mô mềm gỗ Mô mềm tủy hình tròn, kích thước không đều Lá: Gân giữa: Lồi rõ

ở mặt dưới, mặt trên phẳng Biểu bì trên và biểu bì dưới tế bào xếp không đều, mang lông tiết chân đa bào và đơn bào, đầu đa bào Biểu bì dưới mang lỗ khí Lớp cutin có răng cưa Dưới biểu bì là 1-2 lớp mô dày góc Mô mềm tế bào hình cầu, kích thước không đều, xếp chừa những khuyết nhỏ Các bó libe-gỗ xếp thành hình vòng cung Phiến lá: biểu bì trên tế bào lớn hơn biểu bì dưới, kích thước

không đều, nhiều tế bào nhô lên thành đỉnh nhọn tù Lông tiết chân ngắn, đầu đa bào và lỗ khí ở cả 2 biểu bì Lớp cutin có răng cưa cạn Mô mềm giậu gồm 1 lớp

tế bào kích thước không đều Mô mềm khuyết tế bào vách mỏng, kích thước không đều

1.1.2 Phân loại, nguồn gốc và phân bố cây Cam thảo đất

Phân bố, sinh học và sinh thái: Gốc ở nhiệt đới Châu Mỹ, được thuần hóa trong tất cả các vùng nhiệt đới của thế giới Ở nước ta, cây mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam Thường gặp trên đất hoang, dọc bờ đường, trên các dải cát của các sông và trong các ruộng khô, ở vùng thấp

1.1.3 Thành phần hóa học

Cây chứa một alcaloid và một chất đắng; còn có nhiều acid silicic và một hoạt chất gọi là amellin Phần cây trên mặt đất chứa một chất dầu sền sệt, mà trong thành phần có dulciol, scopariol, (+) manitol, glucose Rễ chứa (+) manitol, tanin, alcaloid, một hợp chất triterpen Vỏ rễ chứa hexcoxinol, --sitosterol và (+)

manitol

1.1.4 Một số tác dụng Sinh - Dược và công dụng của cây Cam thảo đất

Thường dùng trị: cảm cúm, sốt, nóng nhiều, ho khan, ho có đàm Lỵ trực

trùng Tê phù, phù thủng, giảm niệu Dùng ngoài, ép lấy dịch từ cây tươi trị mụn nhọt, lở ngứa, eczema.Hoạt chất amellin trong cam thảo đất có thể làm giảm đường máu và các triệu chứng của bệnh đái tháo đường type2, khiến cho quá trình giảm nồng độ đường máu và nước tiểu diễn ra dần dần Nó còn làm tăng mức dự trữ kiềm bị hạ thấp ở người bệnh nhân và giảm hàm lượng các chất tạo ceton trong máu

1.2 Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật

* Các chất thứ sinh thực vật (plant secondary metabolites)

Ở thực vật, ngoài protein, saccarid, lipid, vitamin, còn có những chất khác

có vai trò quan trọng trong đổi chất của cây được gọi là các chất thực vật thứ sinh (plant secondary metabolites) Căn cứ vào tính chất hóa học, các hợp chất thực vật thứ sinh được chia thành một số nhóm chính như: nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid Nhiều công trình nghiên cứu gần đây đã cho thấy các hợp chất polyphenol (thuộc nhóm hợp chất phenolic) ngày càng ứng dụng rộng rãi trong điều trị một số bệnh nan y như: ung thư, béo phì, tiểu đường …

a Các hợp chất phenolic từ thực vật

Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (benzene) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzene Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [41]:

 Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng

benzene và một vài nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…)

 Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử

của chúng ngoài vòng thơm benzene (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic

 Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các hợp

chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin

Hợp chất phenolic được hình thành một cách dễ dàng trong tất cả các cơ quan thực vật từ những sản phẩm đường phân và chu trình pentose phosphate qua acid sikimic hay theo con đường acetate manolate qua acetyl – SCoA Trong số các chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng nhất vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và mang nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị

b Flavonoid

Flavonoid là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus - nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số sắc tố khác như xanh, đỏ, tím,…hoặc không màu cũng xếp vào nhóm flavonoid vì chúng có chung đặc điểm cấu tạo

• Cấu tạo hóa học và phân loại

Về cấu tạo hóa học, khung cacbon của flavonoid là C6 - C3 - C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A và B nối với nhau qua dị vòng C, trong đó

A kết hợp với C tạo khung chroman

9

10 8

4

1'

5' 6'

4'

3' 2'

B

Flavan (2-phenyl chroman ) Tùy theo mức độ oxy hóa vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2 với C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: Flavon và flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol, leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid và neoflavonoid

• Hoạt tính sinh học của flavonoid

* Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)

Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây truyền gây ra bởi các gốc tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào đặc điểm của từng flavonoid cụ thể

Gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường của cơ thể hay do tác động bên ngoài là nguyên nhân gây phá hủy ADN, protein, lipid làm phát sinh nhiều bệnh tật nguy hiểm và sự lão hóa cho cơ thể Flavonoid có bản chất polyphenol nên dễ dàng biến đổi dưới tác động của các enzyme có trong tế bào động, thực vật Đặc biệt flavonoid có nhóm hyđroxyl ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hóa bởi xúc tác của enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo semiquynol hoặc quynol [27] Đây là các gốc tự do bền vững chúng có thể nhận điện tử và trở thành dạng hidroquynol Bởi vậy các chất này có khả năng phản ứng với các gốc

tự do hoạt động và loại chúng ra khỏi cơ thể Quá trình được tóm tắt qua sơ đồ sau:

O2 + Flavonoid (khử) Flavonoid (oxy hoá)

(Hiđroquynol) (semiquynol hoặc quynol)

Ngoài ra flavonoid còn có tác dụng bảo vệ các hệ thống sinh học nhờ khả năng tạo phức với các kim loại chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2 … hoạt hóa enzyme chống oxy hóa và ức chế sự oxy hóa

* Tác dụng kháng khuẩn

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới đã chứng tỏ tác dụng chống viêm nhiễm (anti-inflamatory) chống vi khuẩn (anti-bacterial) và virut (antiviral) [5], [12]

* Tác dụng làm bền thành mạch máu

Các dẫn xuất đường của flavonoid có hoạt tính của vitamin P như rutin, hesperidin… có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu của hồng cầu qua thành mao mạch Hoạt tính này được ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [21]

* Tác dụng giảm béo phì và lipid máu

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo phì được điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng

(Lagerstroemia specciosa L.) thì có trọng lượng giảm đáng kể (~ 10% ) [62] Thí nghiệm tương tự với flavonoid từ lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) đối

với chuột cống trắng uống cholesterol cũng cho thấy có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol, triglycerid, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [35] Naringin (C17H32O4) và hesperidin (C28H34O15) là những flavonoid có hàm lượng cao trên

họ cam chanh (Rutaceae) đã được nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất và thử tác

Polyphenoloxydase Peroxydase

Polyphenoloxyase Peroxydase

dụng trên mô hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [36], [40]

* Tác dụng hạ glucose huyết

O

O

OH OH

OH OH

CH3O

O

O OH

O

H3OC

O

O O OH OH

O O

O

OH

OH

OH

Một số flavonoid được tách chiết từ nguyên liệu thực vật đã được chứng minh là có tác dụng điều hòa glucose huyết như: Quercetin có trong Đỗ trọng

(Eucommia ulmoides Oliver.) [54], Hesperidin và Naringin có trong các cây thuộc họ Rutaceae [39], Genistein và Daidzein có trong Đậu nành (Glycine max L.) [18], Myricetin có trong cây Vông vang (Abelmoschus moschatus) [18]

c Tannin thực vật

Tannin là các hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao có chứa các nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác như có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt Tannin thường là các hợp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hóa khi đun nóng hay khi để ngoài ánh sáng

Tác dụng sinh học của tannin là chất bảo vệ cây trồng trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và côn trùng ăn lá [42], [50] Trong y học, tannin được

sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa đi ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chữa trĩ, viêm miệng, viêm xoang, điều trị cao huyết áp và đột quỵ [1]

O O

OH

OH

OH OH

O O

OH

OH

OH OH

d Hợp chất coumarin

Coumarin là dẫn chất của α- purone có cấu trúc C6- C3 dị vòng chứa oxy Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm [31] Tính chất hóa học đặc trưng là dễ dàng kết hợp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước

Hiện nay chúng ta biết đến 1500 hợp chất coumarin khác nhau khi nghiên cứu 800 loài thực vật Ta cũng dễ dàng tìm thấy coumarin trong tất cả các bộ phận khác nhau của cây như: áo hạt, quả, hoa, rễ, lá, thân…Coumarin cũng có vai trò là một nhóm chất phòng thủ hóa học hữu hiệu chống lại vi khuẩn và tác nhân

có hại của môi trường Tuy nhiên cho tới nay con đường tổng hợp coumarin vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ [40]

Coumarin Coumarin sử dụng trong đời sống hàng ngày như làm nước hoa, hương liệu, làm chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong y học dẫn xuất của coumarin có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, ngăn cản đột quỵ [40] Một số coumarin khác có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán và giảm đau

e Alkaloid thực vật

Alkaloid là hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật Đa số các alkaloid thành phần chứa oxy ở thể rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin) Alkaloid thường không có màu, không mùi và vị đắng Một số alkaloid có màu vàng như berberin, palmitin Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước [40]

N

N N

N

C H3

C H3C

O H

O H

Loài người có lịch sử hơn 2000 năm nghiên cứu và sử dụng alkaloid Cho tới nay có hơn 12000 alkaloid khác nhau được phân lập Chúng không phổ biến trong tự nhiên mà chỉ tập trung ở một số loài thực vật có hoa (khoảng 20% loài thực vật có hoa có khả năng sinh alkaloid) Với cây trồng alkaloid là chất hóa học bảo vệ cây trồng trước côn trùng và sâu bọ ăn lá [40] Trong y học nhiều thuốc chữa bệnh có thành phần alkaloid như thuốc gây kích thích hoặc ức chế hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hòa huyết áp, chữa rối loạn nhịp tim… Một số nghiên cứu gần đây cho thấy các alkaloid chiết từ thực vật cũng có tác dụng hạ

glucose huyết như: Berberin (Tinosporacordifolia, Coptis sinensis), Casuarine O-α- glucoside (Syzygium malaccense)

6-f Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất, được hình thành từ quá trình polyme hoá các tiểu đơn vị isopren 5-carbon (C5H8), có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua

con đường trao đổi chất acetate/mevalonate hoặc con đường glyceraldehyde phosphate/pyruvate Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd Vì vậy, một số tác giả sử dụng thuật ngữ “terpenes” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và terpenoid Terpen là thành phần chính của các loại tinh dầu, được dùng trong công nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Những terpen bậc cao thường là các chất có hoạt tính sinh học

3-1.3 Bệnh béo phì (Obesity)

1.3.1 Khái niệm và phân loại béo phì

Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (Obesity) là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe

Để nhận định tình trạng béo gầy WHO thường dùng chỉ số khối cơ thể (BMI- Body Mass Index) Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức như sau:

Trong đó: W: Khối lượng (kg )

1.3.2 Thực trạng béo phì trên thế giới và Việt Nam

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay số người béo phì đã lên tới 1,7

tỉ người [2], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn gặp cả ở các quốc gia đang phát triển Mỹ là nước có số dân mắc bệnh cao nhất thế giới, khoảng 60 triệu người (chiếm 30% dân số), tăng gấp 3 lần so với điều tra năm

1991 Ở châu Âu, Anh là quốc gia đứng đầu bảng với 23% dân số Tại châu Á tỉ

lệ thừa cân béo phì ở một số nước như sau: Thái Lan 3,5%, Philipin 4,27%, Malaysia 3,01%, Nhật 3%, Trung Quốc 2%, Hồng Kông 3%

Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn cho người châu Á, số người thừa cân béo phì cũng tăng theo thời gian Năm 1991 theo điều tra của Lê Huy Liệu và cộng sự thì tỉ lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung tại Hà Nội là 1,1% Đến năm 2000 con số này đã là 2,62% tăng gần 2,5 lần trong vòng 10 năm (điều tra của Lê Văn Hải) [2]

Năm 2007, Viện dinh dưỡng Quốc gia điều tra trên đối tượng người trưởng thành 25 - 64 tuổi cho thấy tỉ lệ thừa cân béo phì là 16,8% và còn có xu hướng tăng lên Theo Viện trưởng TS Nguyễn Công Khẩn thì tỉ lệ này ở thành thị lớn hơn nông thôn, ở nữ giới cao hơn nam giới Trẻ em Việt Nam cũng có 16,3% mắc thừa cân béo phì Hà Nội có 4,9% trẻ 4 - 6 tuổi mắc bệnh, Thành phố Hồ Chí Minh 6% trẻ dưới 5 tuổi và 22,7% học sinh tiểu học cũng rơi vào tình trạng này [51] Trước tình hình đó Bộ y tế đã kí quyết định thành lập “Trung tâm phục hồi dinh dưỡng và kiểm soát béo phì” trực thuộc Viện dinh dưỡng, chính thức tuyên chiến với bệnh béo phì

1.3.3.Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì

Chứng thừa cân và bệnh béo phì gây nhiều tác hại cho cuộc sống con người như mất thoải mái trong sinh hoạt, giảm hiệu suất lao động, khối lượng cơ thể nặng nề kém lanh lợi

Người béo phì có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với người thường do nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu như:

 Bệnh tim mạch: Do mỡ tạng làm tim khó co bóp và mỡ máu làm xơ cứng mạch vành và các mạch máu khác gây nhồi máu cơ tim tăng huyết áp

 Rối loạn lipid máu: Tình trạng này rất hay gặp ở người béo bụng và có biểu hiện đặc trưng là tăng triglycerid và lipid có hại (LDL-c), giảm lipid có lợi (HDL-c)

 Tiểu đường: Béo phì toàn thân có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2

 Đột quỵ: Những người có BMI > 30 dễ bị tử vong do bệnh liên quan đến mạch máu não

 Ngoài ra béo phì còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác: xấu đi tình trạng rối loạn tiền mãn kinh ở phụ nữ, suy giảm chức năng hô hấp, rối loạn hoạt động cơ xương, ung thư, sỏi mật và các vấn đề bệnh lý tâm thần khác [1], [38]

1.3.4 Nguyên nhân và giải pháp phòng, điều trị béo phì

Nguyên nhân chính dẫn đến thừa cân béo phì là do khẩu phần và thói quen dinh dưỡng không hợp lý, hoạt động thể lực kém dẫn đến năng lượng hấp thụ vào cơ thể vượt quá mức cần thiết và tích lũy dưới dạng mỡ Ngoài ra một số bệnh lý nội tiết như: Hội chứng Cushing (do hormone cortisosteroid trong cơ thể tăng quá cao), bệnh suy tuyến giáp trạng, bệnh trứng đa nang hoặc có chứa gen béo phì di truyền

Để phòng bệnh béo phì có hiệu quả, mỗi cá nhân cần nâng cao nhận thức

về dinh dưỡng và hoạt động thể lực Trên phạm vi xã hội, việc phòng bệnh cần tập trung vào nhóm có nguy cơ cao mắc bệnh này

Điều trị thừa cân béo phì dựa trên nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn uống, luyện tập và dùng thuốc Trong đó thuốc và phẫu thuật chỉ dùng trong trường hợp bắt buộc Thuốc chống béo phì được chia làm hai nhóm lớn

 Nhóm có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

 Nhóm tác dụng lên hệ tiêu hóa

Thuốc điều trị béo phì phổ biến hiện nay là Metformin thuộc nhóm hai với tác dụng chủ yếu là ức chế phân giải glycogen thành glucose ở gan, làm tăng tính nhạy cảm của insulin ngoại vi, tác động hạ glucose trong khoảng 2 - 4 mmol/l, giảm HbA1C đến 2% Vì thế, Metformin được dùng cho cả bệnh nhân béo phì và tiểu đường Tuy nhiên thuốc cũng có một số tác dụng phụ với đường tiêu hóa,

chống chỉ định với người suy tim nặng, bệnh gan, bệnh thận và những người từng

có tiền sử nhiễm toan lactic

1.3.5 Rối loạn trao đổi lipid máu

Huyết thanh người bình thường có 5 - 7g/l lipid toàn phần bao gồm acid béo tự do, triglycerid, cholesterol toàn phần với hai dạng cholesterol tự do và cholesterol este, các photpholipid Vì không tan trong nước nên lipid được vận chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với các protein đặc hiệu Các acid béo tự do được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, các lipid khác được lưu hành trong máu dưới dạng phức hợp lipoprotein như: các hạt chymomicron, VLDL, HDL, IDL, LDL Các lipoprotein này có kích thước, thành phần, tỉ trọng và chức năng khác nhau trong quá trình chuyển hóa lipid [13], [29], [52], [65]

Để đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các chỉ số:

 Cholesterol toàn phần (2,9 – 5,2 mmol/l)

nề nhất là dẫn đến tử vong hoặc tàn phế gọi là rối loạn chuyển hóa [4] Ngày nay người ta đã xem là có rối loạn lipid máu ngay từ khi tỉ lệ thành phần của lipid máu có sự thay đổi Khái niệm này chỉ rõ rối loạn lipid máu có thể xảy ra từ rất sớm, ngay cả khi chưa có tăng các giá trị tuyệt đối nồng độ của các thành phần trong máu [4] Rối loạn này có thể tiên phát do di truyền hoặc thứ phát sau các bệnh khác như: béo phì, đái tháo đường, nghiện rượu, suy giáp trạng Fredrickson căn cứ vào kĩ thuật điện di và siêu ly tâm với các thành phần huyết thanh đã phân loại chứng tăng lipid máu thành 5 type dựa trên những thay đổi thành phần lipoprotein Cách phân loại này đã được WHO chính thức sử dụng vào năm 1970 [25] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh người mắc bệnh béo phì có nguy cơ cao

mắc các bệnh rối loạn lipid máu dẫn đến xơ vữa động mạch (liên quan chủ yếu đến các lipoprotein) hoặc hiện tượng “nhiễm độc mỡ tế bào” [21], [25]

1.4 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus)

1.4.1 Khái niệm và phân loại

Danh từ đái tháo đường (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (Diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [65] Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy thuốc Hy Lạp đã mô tả bệnh này với các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân nhanh [4] PGS TS Tạ Văn Bình định nghĩa đái tháo đường là một hội chứng

có đặc tính biểu hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2 [4]

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WHO

Kết luận

Đường huyết lúc đói (mmol/l)

Đường huyết 2 giờ sau khi làm nghiệm pháp tăng đường huyết (mmol/l)

Đường huyết tại thời điểm bất kì (mmol/l)

kèm triệu chứng uống nhiều, đái nhiều và gầy sút

Rối loạn dung nạp

 ĐTĐ type 2: Chiếm 80% - 90% bệnh nhân, có tính quy tụ gia đình và hay gặp ở những người trên 30 tuổi Hai yếu tố chính đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào β tuyến tụy và tình trạng kháng insulin [4], [38] Hai yếu tố này luôn có tác động qua lại với nhau và không thể kết luận yếu tố nào xuất hiện trước Kháng insulin có thể do bất thường ở hậu thụ thể insulin, bất thường về số lượng receptor insulin hoặc ái lực gắn hormon của insulin và cũng có thể do acid béo tự do tăng cao gián tiếp làm ảnh hưởng quá trình truyền tin nội bào của insulin ở tế bào đích Bởi vậy, bệnh béo bệu là một trong những nguyên nhân môi trường được đề cập đến nhiều nhất vì chính béo bệu làm gia tăng tình trạng kháng insulin [18]

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn bình thường, nhưng

có hiện tượng kháng insulin vì insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần do có hiện tượng tăng glucose huyết sau ăn

- Giai đoạn 3: Kháng insulin không đổi nhưng bài tiết insulin suy giảm gây tăng glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài

 Ngoài ra còn có ĐTĐ thai nghén và một số type ĐTĐ đặc biệt khác như thiếu hụt chức năng tế bào β, thiếu hụt di truyền về tác động của insulin, bệnh tụy ngoại tiết,

1.4.2 Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam

Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác bệnh ĐTĐ đang phát triển với tốc độ nhanh chóng cùng sự phát triển của nền kinh tế xã hội Năm 1994, toàn thế giới có 98,9 triệu người mắc ĐTĐ Năm 1995 đã tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân số thế giới, cuối năm 2002 có khoảng 177 triệu người [2] Dự đoán đến năm 2010 có khoảng 222 triệu và năm 2025 có khảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân số thế giới [2] Đặc biệt ngày nay tỉ lệ người mắc bệnh ở châu Á đã vượt xa châu Âu - nơi vẫn được xem là ổ bệnh [1] Tại Tây Thái Bình Dương có

12 quốc gia có tỉ lệ ĐTĐ type 2 trên 8%, cá biệt có quốc đảo có tỉ lệ bệnh vượt 40%

Việt Nam hiện nay ĐTĐ đang gia tăng rất nhanh Năm 1990, Hà Nội có tỉ

lệ mắc bệnh là 1,2%, Huế 0,96%, Thành phố Hồ Chí Minh là 2,52% Theo điều tra quốc gia năm 2002 cho thấy tỉ lệ người mắc bệnh ĐTĐ lứa tuổi từ 30 - 64 trong toàn quốc là 2,7% (khu vực đô thị và khu công nghiệp tỉ lệ tới 4,4%) Đặc biệt bệnh này trong nhóm người có yếu tố nguy cơ là rất cao (10,3%) Hiện nay,

có khoảng hai triệu người mắc bệnh ĐTĐ nhưng có tới 65% số đó không biết mình đã mắc bệnh Theo PGS TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type 2 ở lứa tuổi thanh thiếu niên ngày một tăng nhanh, đây là một vấn đề rất đáng lưu tâm [2]

- Biến chứng thận như: microalbumin niệu (11,6%), macroalbumin (3%), suy thận từ độ 1 đến độ 4 (3,5%) …

- Biến chứng thần kinh ngoại vi: giảm hoặc mất phản xạ gân xương hoặc cảm giác rung …

- Tổn thương bàn chân: tùy từng mức độ như phỏng rộp, biến dạng, loét, hoại thư, cắt cụt, …

- Biến chứng mạch máu lớn: mạch vành có tới (38%), đột quỵ (1,2%), tăng huyết áp (27,6%)

1.4.4 Phòng và điều trị bệnh ĐTĐ

Trừ những nguyên nhân di truyền thì ăn uống sinh hoạt hợp lý điều độ và khám sức khỏe định kỳ là phương thức chung để phòng bệnh nói chung và bệnh ĐTĐ nói riêng Tùy theo loại ĐTĐ mà việc điều trị bằng thuốc là khác nhau:

+ Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin như Sulfonflurea, Nateglinid (Starlix) …

+ Thuốc làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể với insulin như: Biguanid, nhóm thiazolidinedion…

+ Các thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn: thuốc ức chế enzyme α- glucosidase…

1.4.5 Chuyển hóa glucose và sự điều hòa glucose huyết

Glucose trong cơ thể có nguồn gốc chủ yếu từ thức ăn thông qua quá trình tiêu hóa Vào các thời điểm xa bữa ăn hoặc khi glucid thức ăn không đủ, cơ thể sẽ huy động nguồn glucose thứ hai nhờ sự thoái hóa glycogen ở gan, cơ Ngoài ra glucose còn có được nhờ quá trình tân tạo glucose nhờ hệ thống enzyme đặc hiệu riêng biệt (xảy ra ở gan, thận, ruột) từ pyruvat, lactat hay các sản phẩm trung gian của chu trình Krebs

Glucose sau khi được hấp thu hoặc tạo thành trong cơ thể sẽ tan trong máu

và được vận chuyển vào trong tế bào nhờ các protein vận chuyển Cuối cùng glucose sẽ thoái hóa để tạo năng lượng hay các sản phẩm trung gian thông qua quá trình đường phân, chu trình pentose phosphat hay con đường tạo uronic và ascorbic Glucose dư thừa khi nhu cầu năng lượng của cơ thể thấp lại được chuyển thành dạng glucid dự trữ là glycogen ở gan [29]

Để duy trì nồng độ glucose ổn định trong máu cơ thể phải huy động nhiều

cơ chế, có sự xúc tác của nhiều loại enzyme khác nhau nhằm cân bằng giữa lượng glucose đi vào máu và lượng glucose được thu nạp bởi các tổ chức Trong

đó quan trọng nhất là việc điều hòa quá trình tân tạo glucose và quá trình thoái hóa glucose có sự tham gia của nhiều protein vận chuyển glucose qua màng tế bào [19]

Glucose trong cơ thể được điều hòa ổn định bởi các hormon mà chủ yếu là các hormon tuyến tụy nội tiết Insulin là hormon tiết bởi các tế bào β của đảo tụy Langerhans có tác dụng làm giảm glucose máu do làm tăng dự trữ glycogen ở gan, cơ, ức chế quá trình tân tạo đường mới Glucagon là hormon tiết bởi tế bào α đảo tụy, có tác dụng ngược với insulin, nghĩa là làm tăng sự phân giải glycogen

và tăng tân tạo đường mới do đó giảm glucose huyết

1.5 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỉ

21 Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ

người béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát của Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do béo phì Béo phì liên quan tới ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin Nồng độ acid béo tự do cứ tăng 100µM thì mức đề kháng insulin tăng khoảng 5-10% [4] Thiếu insulin dẫn đến sự tăng trọng lượng cơ thể, tăng đường máu, cuối cùng dẫn đến bệnh ĐTĐ type 2

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa béo phì và bệnh ĐTĐ type 2 bao gồm: chỉ số khối cơ thể, thời gian béo phì, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể Một thống kê đã chỉ ra rằng những người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30 kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị béo phì dưới 5 năm và nếu trọng lượng cơ thể tăng một kilogam thì rủi

ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5% [38] Đây chính là cơ sở để Reed và cộng sự đưa ra phương pháp gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [60], [63] Tại Việt Nam, Trần Thị Chi Mai đã áp dụng phương pháp này và đạt hiệu quả 90% chuột xuất hiện ĐTĐ với nồng độ glucose máu ≥10 mmol/l [24]

Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người béo phì có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hóa glucose ở cơ [39]

ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyển hóa glucid, sự rối loạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do đó kéo theo hoặc làm cho quá trình rối loạn chuyển hóa lipid ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc trưng chung của rối loạn chuyển hóa lipid trong ĐTĐ là sự tăng triglycerid, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ type 1 rối loạn tăng triglycerid sẽ mất đi khi kiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-c của type 2 cũng có thể tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-c với

kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch [21]

1.6 Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm bằng STZ

Streptozotocin (STZ:2 – deoxy – 2 - (3 – metyl – 3 - nitrosoureido) – D - glucopyranose) là chất có hoạt tính chống ung thư được chiết xuất từ nấm Streptomyces achromogens Khả năng gây ĐTĐ của STZ đã được phát hiện vào

năm 1963 Kể từ đó STZ được sử dụng rộng rãi trong mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong các nghiên cứu về thuốc [20], [47], [60]

Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành người ta có thể gây ĐTĐ type1 hay type 2

ĐTĐ type 1: Với chuột cống trưởng thành, tiêm liều duy nhất từ 40 – 60

mg/kg thể trọng hoặc cao hơn Với chuột nhắt trưởng thành, tiêm liều 100 – 150mg/kg thể trọng

ĐTĐ type 2: Với chuột cống, tiêm STZ liều 100mg/kg vào ngày đầu tiên

sau khi sinh Với chuột nhắt có thể nuôi với chế độ dinh dưỡng giàu lượng mỡ sau đó tiêm STZ với liều 50 - 100mg/kg

STZ được nhận biết và xâm nhập vào tế bào β qua kênh vận chuyển glucose LLUT2 Hoạt động của nó trong tế bào làm tổn thương và alkyl hóa ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tử tế bào Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí O6 của guanine

STZ tạo ra nitric oxide (NO) làm tổn thương ADN của tế bào β Mặt khác, hoạt động của NO làm ức chế chu trình Krebs, giảm tiêu thụ oxy trong ty thể từ

C H2

C

N N O

O

CH3

HO

Streptozotocin

đó làm giảm mạnh sự sản xuất ATP và tổn hại đến các nucleotit của tế bào Đồng thời phân tử này còn ức chế hoạt tính enzyme aconitase Mặt khác, sự tăng cường loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ sung cơ chất cho xanthine oxidase và tăng cường sản xuất acid uric Sau đó, xanthine oxidase xúc tác phản ứng tạo thành anion superoxyde (O2-) Cuối cùng anion superoxyde sinh ra hydrogen peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl (OH-) Các dạng oxy phản ứng này cũng tập trung phá hủy ADN và gây ra những thay đổi bất lợi cho tế bào NO và các dạng oxy hoạt động còn có thể tạo thành peroxynitrate (ONOO) có độc tính cao Tổn thương ADN gây ra bởi STZ làm tăng cường quá trình trùng hợp ADP (Poly ADP - ribosylation) dẫn đến làm mất NAD+, xa hơn nó phá hủy ATP dự trữ và sau đó ức chế sự tổng hợp và tiết insulin của tế bào β, [47]

Aconitase MIT ATP

Hình… Cơ chế gây độc của STZ lên tế bào β của tụy đảo chuột

MIT- ty thể, XOD – xanthine oxidase

Chương 2 Hình 1.1 Cơ chế gây độc của STZ lên tế bào β của tụy đảo chuột

(MIT – Ty thể, XOD – xanthine oxidase) [47]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L) Được thu tại huyện Mê Linh - tỉnh

Vĩnh Phúc, do Bộ môn Thực vật học - Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 phân loại

Thời gian thu mẫu: tháng 10/2010 Rửa sạch và tiến hành sấy khô ở 500C sau đó nghiền thành bột mịn

Hình 2.1 Hình thái cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L)

2.1.2 Mẫu động vật

Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss 4 tuần tuổi (14-17g) do

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 22- 25°C với chu kỳ sáng 12h và tối 12h, được cho ăn và uống nước theo chế độ ăn thường và ăn béo

Hình 2.2 Tủ sấy thức ăn cho chuột TN o và chuột nuôi (béo phì, chuẩn) TN o

- Máy cô quay chân không RE 400 Yamato, Japan

- Cân kĩ thuật GM612, Đức

- Máy quang phổ UV – VIS 1000

- Máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa OLYMPUS AU 640, Nhật

- Máy li tâm eppendorf, li tâm lạnh

- Máy đo đường huyết tự động OneTouch Ultra và que thử, Mỹ

- Micropipet và các dụng cụ đo đếm khác

Hóa chất:

- STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse

- Silica gel 60 (0.04 – 0.063mm), Merck

- Các loại dung môi hữu cơ với độ tinh khiết cao như ethanol, chloroform, ethylacetate, aceton của Trung Quốc và Sigma (Mỹ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu

Từ 3kg bột khô cây Cam thảo đất được ngâm chiết với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng 22oC trong vòng 45 ngày (quá trình được lặp lại 3 lần) Gộp các dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất lại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không thu được cao tổng số ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n - hexan, chloroform, ethylacetate cất dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Cam thảo đất

Flavonoid Shinoda Mg/HCl Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ

sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn

xuất hydro của chúng

Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính Dung dịch

kiềm

NaOH 10%

Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam

Acid sulfuric

H2SO410%

Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự

có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt

Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm

Vans Mayer

Hỗn hợp HgCl2+

Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng

đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

Polyphenol Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu

khác vàng

FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu

lục, xanh, đen

2.2.2.2 Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau

Nguyên tắc dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu)

với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [61]

Các bước tiến hành như sau:

○ Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất

- Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml

- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml

- Dung dịch mẫu cần định lượng

○ Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic

Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3,

5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100,

150, 250 và 500 mg/l acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58ml H2O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300µl Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 20oC rồi xác định ở bước sóng 765nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

* Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20µl (0,02ml) để

định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic

2.2.2.3 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) là kĩ thuật sắc kí khá nhanh gọn và tiện lợi Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứu Phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sách hệ số lưu của hỗn hợp (Rf)và hệ số lưucủa một số chất đã biết [5]

Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau

với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí) Pha tĩnh có thể

là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide Pha động là một hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích

Phương pháp: Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến hành

chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất Một số hệ dung môi được sử dụng:

- TEAF: 5: 3: 1: 1 (Toluen – ethylacetate – acetone – acid formic)

- Toluen: etylaxetate: acid focmic = 5:4:1

- Etylaxetat: acid focmic: nước = 8:1:1

Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% được phun đều trên bản mỏng Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây Cam thảo đất

(Scoparia dulcis L) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột

béo phì thực nghiệm

2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD 50

Xác định LD50 của dịch chiết cây Cam thảo đất bằng đường uống theo phương pháp Lorke [49] Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối

đa cho phép) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết cây Cam thảo đất

2.2.3.2 Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:

- Nhóm 1 – Nhóm đối chứng: Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng

thức ăn bình thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp)

- Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: Các con chuột được chăm sóc bằng chế độ

thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dưỡng được tính toán với thành phần như bảng 2.2

Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê

Bảng 2.2 Thành phần thức ăn giàu lipid [60], [63]

Vitamin & acid amin 2

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn

dịch chiết cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L) trên mô hình chuột đái tháo

đường mô phỏng type 2

Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết cây Cam thảo đất lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [63]