Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Cam thảo đất
Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính. Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trưng Nhóm hợp
chất Phản ứng Thuốc
thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid Shinoda Mg/HCl Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn
xuất hydro của chúng.
Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính.
Dung dịch kiềm
NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric
H2SO4 10%
Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5%
Gelatin/1% NaCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid
Bouchardat
Hỗn hợp KI + I2 /HCl
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm.
Vans Mayer
Hỗn hợp HgCl2+
KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu
khác vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau Nguyên tắc dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [61].
Các bước tiến hành như sau:
○ Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
- Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml.
- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
- Dung dịch mẫu cần định lượng.
○ Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20àl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở cỏc nồng độ hoặc dịch chiết cỏc phõn đoạn) + 1,58ml H2O + 100 àl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giõy đến 8 phỳt cho thờm 300àl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 20oC rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
* Định lượng phenolic của mẫu nghiờn cứu bằng cỏch lấy 20àl (0,02ml) để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.2.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) là kĩ thuật sắc kí khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứu.
Phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sách hệ số lưu của hỗn hợp (Rf)và hệ số lưucủa một số chất đã biết [5].
Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí). Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide.... Pha động là một hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
Phương pháp: Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất. Một số hệ dung môi được sử dụng:
- TEAF: 5: 3: 1: 1 (Toluen – ethylacetate – acetone – acid formic).
- Toluen: etylaxetate: acid focmic = 5:4:1.
- Etylaxetat: acid focmic: nước = 8:1:1.
Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% được phun đều trên bản mỏng. Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b. Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi.