Kính thưa thầy cô và các bạn. Sau đây, em xin được báo cáo đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình: “Tổng hợp một số Nhydroxy ButanamidPentanamid mang khung 1(triazol4yl) methyl indolin 2on hướng tác dụng kháng ung thư. Nội dung bài báo cáo của em gồm 4 phần: + Một: Tổng quan + Hai: Nội dung và phương pháp nghiên cứu + Ba: Thực nghiệp, kết quả và bàn luận + Và cuối cùng là: một số kết luận và kiến nghị Phần thứ nhất là tổng quan. Như chúng ta đã biết, NST có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa biểu hiện gen. Cấu trúc cơ bản của một NST là những nucleosom, là một đoạn ADN gốm 146 cặp nucleotid quấn quanh một lõi protein hình đĩa là 4 cặp histon, trong đó đầu N của H3 H4 là nơi xảy ra nhiều biến đổi trong phiên mã như acetyldeacetyl. Hai quá trình này được xúc tác bởi 2 enzym histon acetyl transferase HAT và histon deacetylase HDAC Trong nội dung đề tài, em đi sâu nghiên cứu về HDAC – một mục tiêu phân tử hấp dẫn của những thuốc chống ung thư mới hiện nay.
Trang 1THUYẾT TRÌNH ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
- DƯƠNG TIẾN ANH -
- Kính thưa thầy cô và các bạn Sau đây, em xin được báo cáo đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình: “Tổng hợp một số N-hydroxy Butanamid/Pentanamid mang khung 1-(triazol-4yl) methyl indolin -2-on hướng tác dụng kháng ung thư
- Nội dung bài báo cáo của em gồm 4 phần:
+ Một: Tổng quan
+ Hai: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
+ Ba: Thực nghiệp, kết quả và bàn luận
+ Và cuối cùng là: một số kết luận và kiến nghị
- Phần thứ nhất là tổng quan Như chúng ta đã biết, NST có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa biểu hiện gen Cấu trúc cơ bản của một NST là những nucleosom, là một đoạn ADN gốm 146 cặp nucleotid quấn quanh một lõi protein hình đĩa là 4 cặp histon, trong đó đầu N của H3 H4 là nơi xảy ra nhiều biến đổi trong phiên mã như
acetyl/deacetyl Hai quá trình này được xúc tác bởi 2 enzym histon acetyl transferase HAT và histon deacetylase HDAC
Trong nội dung đề tài, em đi sâu nghiên cứu về HDAC – một mục tiêu phân tử hấp dẫn của những thuốc chống ung thư mới hiện nay
- Về cấu trúc của enzym HDAC: Bao gồm 2 phần
+ ion kẽm – là coenzym của HDAC, nằm ở dưới đáy của kênh và là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với đuôi của histon qua liên kết phối trí
+ kênh enzym là túi hình ống hẹp cấu tạo từ các acid amin thân dầu, nơi chứa cơ chất và tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất
Trang 2Từ cấu trúc của HDAC như vậy, người ta mới thiết kế các thuốc ức chế HDAC thường theo 3 phần
+ Nhóm nhận diện bề mặt
+ Vùng cầu nối
+ Và nhóm kết thúc gắn kẽm
- Cụ thể, vai trò của từng phần
+ Nhóm nhận diện bề mặt có vai trò tham gia nhận diện với bề mặt amino acid của
enzym
+ Vùng cầu nối có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, tạo tương tác với các thành phần nằm trên kênh và giúp cơ chất được giữ cố định trong kênh
+ Nhóm kết thúc gắn kẽm tham gia tạo tương tác với ion kẽm tại trung tâm hoạt động của HDAC
- Về phân loại các chất ức chế HDAC: các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic, các peptid vòng, các aminobenzamid, các epoxyceton và các phân tử lai Trong đó, các acid hydroxamic với chất dẫn đường SAHA
- là một trong những hướng được nhiều nhà khoa học quan tâm vì cấu trúc đơn giản và ức chế ở nồng độ thấp (cỡ nM)
- Dẫn chứng là 2 thuốc gần đây được FDA cấp phép lưu hành trong điều trị ung thư là belinostat (2014) và panobinostat (2015) – đều chứa hợp phần acid hydroxamic nên chúng em quyết định giữ lại phần cấu trúc này làm nhóm kết thúc gắn kẽm
- Về các hướng nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic ở Vietnam và trên thế giới: + Năm 2008, Chen và các cộng sự đã thay thế nhóm amid của SAHA bằng khung triazol, được dãy các dẫn chất có tác dụng tốt và chọn lọc hơn SAHA Ví dụ như chất có cấu trúc trên đây cho hoạt tính mạnh hơn SAHA 4 lần
Trang 3+ Năm 2011, NCS Đào Thị Kim Oanh đã sử dụng khung benzothiazol làm nhóm khóa hoạt động thu được nhiều chất có hoạt tính tốt, thậm chí tốt hơn hẳn SAHA Khi độ dài cầu nối là 6C, cho kết quả thử độc tính tế bào với IC50 trung bình là 0,81 µg/ml
+ Và gần đây nhất, trong nghiên cứu của mình, Zhang Z và cộng sự đã tổng hợp được chất có nhóm nhận diện bề mặt có chứa khung dimethyl isoxazol có hoạt tính tương đối tốt, ví dụ chất có cấu trúc trên hình có tác dụng ức chế mạnh HDAC-1 với IC50 chỉ là 0,15 µM
=> Nhóm khóa hoạt động là vòng lớn, mang dị tố, có lợi cho hoạt tính
- Cũng trong nghiên cứu của Chen, ông đã đưa ra một số đặc điểm của vòng 1,2,3-triazol
là tương đối trơ về mặt hóa học, không bị thủy phân, hầu như không bị khử hay oxy hóa,
có moment lưỡng cực lớn (~ 5D), dễ dàng kết hợp với mục tiêu sinh học thông qua liên kết hydro và tương tác lưỡng cực-lưỡng cực
=> Nó có thể coi như là một nhóm liên kết (CU) được đưa vào cấu trúc nhằm tăng khả năng tương tác giữa nhóm khóa hoạt động với các amino acid bề mặt gần lối vào túi thân dầu của HDAC, đồng thời cải thiện dược động học và tăng tính chọn lọc với đích cụ thể, hạn chế độc tính của thuốc hơn so với khi sử dụng nhóm amid hay ceton
- Minh chứng cho điều này là các hoạt tính sinh học của các dẫn chất chứa vòng triazol như: tính kháng VK Lao, VK tả, kháng nọc rắn, ung thư bạch cầu, kháng virus HIV, ung thư vú, ức chế KST sốt rét và ung thư sắc tố da
- Cụ thể về hoạt tính chống ung thư Trong nghiên cứu của Reedijk
+ Dựa trên cấu trúc của cisplatin – một thuốc hóa trị liệu chống ung thư (FDA phê duyệt năm 1978) cho ung thư tinh hoàn và buồng trứng
+ Reedijk đã thêm cấu trúc triazol và kết quả cho thấy 2 dẫn chất tổng hợp được có độc tính tế bào mạnh hơn cisplatin đến 18 lần
Trang 4Do đó, trong nghiên cứu của mình, chúng em quyết định thêm hợp phần triazol vào trong cấu trúc dẫn chất tổng hợp với mong muốn tăng hoạt tính của các dẫn chất tổng hợp được
- Các dẫn chất mới được thiết kế như trên hình vẽ với các lý do
+ Isatin và các dẫn chất mang khung isatin có nhiều tác dụng sinh học thú vị, và 1 trong
số đó là tác dụng chống ung thư
+ Ưu điểm của vòng triazol cũng như nhóm kết thúc gắn kẽm là các acid hydroxamic được minh chứng bằng các nghiên cứu được trình bày ở trên
- Trước khi đi vào tổng hợp, các dẫn chất được tiến hành nghiên cứu docking với kết quả
như trên bảng Ta có thể thấy, các dẫn chất VIa-d, X đều có ái lực liên kết với enzym
HDAC-2 lớn hơn hoặc bằng với chất dẫn đường SAHA Điều này giúp ta đánh giá sơ bộ các dẫn chất đều có hoạt tính lớn hơn SAHA
- Dựa trên cơ sở đó, khóa luận được thực hiện với 2 mục tiêu:
+ Tổng hợp 5 dẫn chất có cấu trúc như đã thiết kế trên đây
+ Thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được
- Dựa trên các mục tiêu nghiên cứu trên, chúng em xây dựng nội dung và phương pháp nghiên cứu với 2 nội dung:
Nội dung 1 Hóa học
Nội dung 2 Thử tác dụng sinh học
Phần hóa học gồm có 3 bước: Tổng hợp hóa học, thử độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc
Thử tác dụng sinh học với 2 phép thử là: Thử tác dụng ức chế HDAC-2; và thử độc tính
tế bào ung thư
- Trước hết là về mặt hóa học
Trang 5- Các chất VIa-d trong đề tài được tổng hợp theo quy trình gồm 4 phản ứng với các tác
nhân, điều khiện như trên sơ đồ
- Để so sánh, chứng minh ảnh hưởng của chiều dài cầu nối, chất X được tổng hợp với quy trình tương tự chất VId với chiều dài cầu nối hơn một nhóm methylen
- Quy trình tổng hợp các chất đều sử dụng chất trung gian II và VIII được tổng hợp qua
phản ứng SN2 giữa Natri azid và methyl bromo ester
Sản phẩm thu được có dạng lỏng, màu vàng, hiệu suất cao, đều trên 80%
- Nguyên liệu ban đầu là isatin và các dẫn chất 5-Fluoro, 5-Bromo, 5-Methoxy của isatin được đem alkyl hoá với Propagyl bromid trong dung môi DMF với xúc tác kali carbonat
ở 50 độ C trong khoảng 3-4 h
Kết quả các sản phẩm IVa-d đều có dạng bột màu vàng đến nâu hiệu suất xấp xỉ 90%
- Nguyên liệu trung gian IVa-d tham gia phản ứng Click với chất II và chất VIII với xúc tác CuI trong Acetonitril tạo thành hợp chất V mang vòng triazol
- Về phản ứng Click mà cụ thể ở đây là phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác đồng (I) CuAAC
+ Cả alkyn và azid đều là những hợp chất giàu năng lượng, nhưng khả năng phản ứng giữa chúng rất kém Trong tự nhiên chúng phản ứng rất chậm, cần nhiệt độ cao và cho sản phẩm không chọn lọc
+ Trong nghiên cứu độc lập của 2 nhà khoa học Sharpless và Meldal đều khẳng định với xúc tác Cu(I), phản ứng xảy ra nhanh, hoàn toàn và chọn lọc, cho sản phẩm là vòng 1,2,3-triazol
- Đó là lý do tại sao nghiên cứu sử dụng xúc tác CuI cho phản ứng này
- Các sản phẩm của phản ứng Click thu được đều là dạng bột màu cam đến nâu, hiệu suất trên 80%
Trang 6Kết quả sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy thấy các sản phẩm thu được đều tinh khiết, đủ điều kiện để làm phản ứng tiếp theo
- Phản ứng cuối cùng, phản ứng tạo acid hydroxamic, trong phản ứng này, phải sử dụng tác nhân là NH2OH base, dạng này không bền, nên phải dùng nguyên liệu ban đầu là
NH2OH.HCl với sự có mặt của NaOH
Tuy nhiên, NaOH dư tạo môi trường kiềm mạnh sẽ làm các sản phẩm ester dễ bị thuỷ phân, vì vậy cần tiến hành phản ứng trong điều kiện nhiệt độ thấp (-5 độ C)
Theo dõi phản ứng bằng SKLM và thử phản ứng với dd Fe(III) đến khoảng 30 phút thấy ester phản ứng hết
- Sản phẩm đều ở dạng bột kết tinh màu vàng hoặc nâu Các sản phẩm thu được được đem tinh chế bằng cách kết tinh lại trong hỗn hợp methanol-nước Hiệu suất cả quá trình khoảng 50-55%
- Sản phẩm thu được sau khi tổng hợp được đem kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp
mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy
- Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel với các hệ dung môi 1/DCM
2/ DCM:MeOH = 10:1
3/DCM:MeOH:AcOH = 100:40:1
Kết quả cho thấy các chất đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ
Các dẫn chất VIa-d, X đều có nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ
hẹp 1-2 độ C)
- Dãy chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng cách ghi phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, các loại phổ cổng hưởng từ hạt nhân
Trang 7- Đây là dữ liệu phổ IR của các chất VIa-d, X, có vân hấp thụ đặc trưng của các liên kết
như O-H và N-H trong nhóm chức acid hydroxamic, nhóm carbonyl
- Ví dụ, phân tích phổ hồng ngoại của VIc thấy rõ peak của O-H, N-H, C-H, C=O, và liên
kết đôi trong vòng benzen và alken
Trong đó, dải hấp thụ của nhóm OH và NH cho thấy sản phẩm acid hydroxamic đã được tổng hợp
- Tuy nhiên, phổ IR không thể cung cấp đầy đủ dữ liệu để khẳng định chắc chắn cấu trúc, nên các chất được tiếp tục đem đo phổ khối lượng
Đây là dữ liệu phổ MS các 5 dẫn chất Các dữ liệu thu được phù hợp với các chất thiết
kế
- Đây là minh hoạ phổ MS của VIb, thấy có pic của ion phân tử đã loại bỏ đi 1 hydro linh
động với cường độ mạnh
- Để xác định cấu trúc, các chất được đem đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân
- Trên đây là kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của các dẫn chất số lượng proton, độ dịch chuyển, độ bội tín hiệu phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến
- Minh họa phổ NMR proton của VIa thấy rõ pic của proton của NOH oxim, NH và OH
của nhóm hydroxamic, proton trên vòng triazol, các pic của proton trong vòng indolin và
CH2 mạch nhánh
Trên phổ đồ của dẫn chất khác có thể không thấy xuất hiện pic của NH và OH có thể do hydro linh động đã có xảy ra trao đổi hỗ biến với môi trường
- Tiếp theo là dữ liệu phổ 13C-NMR
- Kết quả cho thấy số đỉnh phù hợp với số C trong từng chất
- Ví dụ, phổ đồ của VIa có
+ 2 pic của 2 nhóm carbonyl
Trang 8+ 2 carbon của vòng triazol,
+ 7 pic còn lại của nhân indol
+ Và 4 pic của CH2 vùng cầu nối
- Trên cơ sở đó, các acid hydroxamic này tiếp tục được tiến hành thử hoạt tính sinh học Các phép thử được thực hiện ở ĐHQG Chung Buk, Hàn Quốc
- Các dẫn chất VIa-d, X được đem định lượng nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl
hoá của HDAC-2 (IC50) bằng phương pháp huỳnh quang
Kết quả thu được cho thấy các dẫn chất tổng hợp đều có hoạt tính ức chế HDAC-2 trong
đó nổi bật nhất là dẫn chất VId có hoạt tính cao hơn so với SAHA Các dẫn chất còn lại
thấp hơn SAHA từ 3-8 lần
Cùng vị trí nhóm thế ở vị trí số 5 trên vòng indolin, các dẫn chất có hoạt tính ức chế HDAC-2 giảm dần thep thứ tự lần lượt là -OCH3 > -Br > -H > -F Tức là nhóm thế hút điện tử làm giảm hoạt tính ức chế HDAC-2, nhóm đẩy điện tử sẽ cải thiện hoạt tính
Chúng tôi đưa ra giả thiết rằng, có thể do các dẫn chất VIb-c gắn nhóm thế hút điện tử sẽ
có mật độ điện tử trên nhóm khóa hoạt động giảm Từ đó, tương tác Van der Waals với
các acid amin trong kênh enzym giảm, dẫn đến tác dụng ức chế HDAC của chất VIb và
VIc đều
- So sánh hai chất khác nhau về chiều dài cầu nối là VId (3C) và X (4C), ta có thể nhận
thấy cầu nối 3C tối ưu hơn so với 4C Giả thiết có thể đưa ra rằng 3C là chiều dài phù hợp hơn để đưa nhóm kết thúc có thể gắn với Zn2+ và giúp nhóm khoá hoạt động ở vị trí phù
hợp tạo liên kết với các acid amin bề mặt Do vậy, hoạt tính ức chế HDAC-2 của VId cao hơn X
- Tác dụng ức chế HDAC quyết định tác dụng kháng tế bào ung thư, tuy nhiên để gây ra độc tính với tế bào, các chất còn phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào để tiếp cận với HDAC
Trang 9Do đó các chất tổng hợp được tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học dựa trên kết quả thử hoạt
tính kháng tế bào ung thư in vitro
- Từ bảng kết quả thử hoạt tính có thể cho thấy 5 dẫn chất có hoạt tính thấp hoặc không thể
hiện trên 3 dòng tế bào thử nghiệm Riêng chất VIa có tác dụng ức chế trên dòng tế bào ung thư SW620 và AsPC-1, dẫn chất VIb có tác dụng ức chế trên dòng tế bào ung thư SW620, dẫn chất X có tác dụng ức chế trên dòng tế bào PC-3 Đặc biệt, các dẫn chất VIc
và VId có độc tính tế bào tốt hơn hoặc tương đương với SAHA Điều này được minh họa
bằng biểu đồ dưới đây
- Trên biểu đồ, cột càng cao nghĩa là giá trị IC50 càng cao thì hoạt tính càng yếu Cụ thể trên từng dòng tế bào
- Trên dòng tế bào SW620, cả hai dẫn chất VIc và VId đều mạnh hơn so với SAHA, dẫn
chất VId còn mạnh hơn tới 2 lần
- Trên dòng tế bào PC-3, dẫn chất VId vẫn mạnh hơn so với SAHA 2 lần, dẫn chất VIc thì
kém hơn so với SAHA
- Còn ở dòng tế bào AsPC-1, cả hai dẫn chất đều ưu thế hơn SAHA về độc tính tế bào, dẫn
chất VIc gấp 1,5 lần so với SAHA còn VId thậm chí mạnh hơn SAHA gần 3 lần
- Sau khi hoàn thành các bước thực nghiệm, em xin rút ra một số kết luận như sau:
Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc:
+ Đã tổng được 5 dẫn chất như dự kiến, trong đó cả 5 dẫn chất VIa-d, X chưa từng được
công bố trong bất kì tài liệu nào
+ Đã khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được nhờ phân tích các dữ liệu phổ
IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR
- Về hoạt tính sinh học:
+ Tác dụng ức chế HDAC:
Trang 10Cả 5 dẫn chất đều có tác dụng ức chế HDAC-2
+ Tác dụng kháng tế bào ung thư:
Cả 5 dẫn chất đều có hoạt tính ức chế với ít nhất 1 trong 3 dòng tế bào ung thư (SW620,
PC-3 và AsPC-1) đặc biệt là dẫn chất VIc và VId
Tác dụng gây độc tế bào tốt nhất là chất VId trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm
- Em xin đề xuất kiến nghị
+ Tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn chất VIa-d trên các enzym HDAC khác hoặc những dòng tế bào ung thư khác
=> Để sàng lọc được các dẫn chất có tác dụng mạnh, làm cơ sở cho việc thử tác dụng in
vivo
+ Đánh giá tác dụng ức chế của các dẫn chất trên HDAC tổng
+ Thử nghiệm tác dụng của các dẫn chất tổng hợp được trên các đích khác như virus HIV
+ Thay đổi hướng nghiên cứu bằng cách thay vòng 1,2,3-triazol bằng các nhóm đẳng cấu điện tử hoặc thay đổi các nhóm thế trên khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin