Đang tải... (xem toàn văn)
Kính thưa thầy cô và các bạn. Sau đây, em xin được báo cáo đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình: “Tổng hợp một số Nhydroxy ButanamidPentanamid mang khung 1(triazol4yl) methyl indolin 2on hướng tác dụng kháng ung thư. Nội dung bài báo cáo của em gồm 4 phần: + Một: Tổng quan + Hai: Nội dung và phương pháp nghiên cứu + Ba: Thực nghiệp, kết quả và bàn luận + Và cuối cùng là: một số kết luận và kiến nghị Phần thứ nhất là tổng quan. Như chúng ta đã biết, NST có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa biểu hiện gen. Cấu trúc cơ bản của một NST là những nucleosom, là một đoạn ADN gốm 146 cặp nucleotid quấn quanh một lõi protein hình đĩa là 4 cặp histon, trong đó đầu N của H3 H4 là nơi xảy ra nhiều biến đổi trong phiên mã như acetyldeacetyl. Hai quá trình này được xúc tác bởi 2 enzym histon acetyl transferase HAT và histon deacetylase HDAC Trong nội dung đề tài, em đi sâu nghiên cứu về HDAC – một mục tiêu phân tử hấp dẫn của những thuốc chống ung thư mới hiện nay.
THUYẾT TRÌNH ĐỀ TÀI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP - DƯƠNG TIẾN ANH - Kính thưa thầy bạn Sau đây, em xin báo cáo đề tài khóa luận tốt nghiệp mình: “Tổng hợp số N-hydroxy Butanamid/Pentanamid mang khung 1-(triazol4yl) methyl indolin -2-on hướng tác dụng kháng ung thư - Nội dung báo cáo em gồm phần: + Một: Tổng quan + Hai: Nội dung phương pháp nghiên cứu + Ba: Thực nghiệp, kết bàn luận + Và cuối là: số kết luận kiến nghị - Phần thứ tổng quan Như biết, NST có vai trò quan trọng q trình điều hòa biểu gen Cấu trúc NST nucleosom, đoạn ADN gốm 146 cặp nucleotid quấn quanh lõi protein hình đĩa cặp histon, đầu N H3 H4 nơi xảy nhiều biến đổi phiên mã acetyl/deacetyl Hai trình xúc tác enzym histon acetyl transferase HAT histon deacetylase HDAC Trong nội dung đề tài, em sâu nghiên cứu HDAC – mục tiêu phân tử hấp dẫn thuốc chống ung thư - Về cấu trúc enzym HDAC: Bao gồm phần + ion kẽm – coenzym HDAC, nằm đáy kênh thành phần tham gia liên kết mạnh với đuôi histon qua liên kết phối trí + kênh enzym túi hình ống hẹp cấu tạo từ acid amin thân dầu, nơi chứa chất tham gia liên kết Van der Waals với chất Từ cấu trúc HDAC vậy, người ta thiết kế thuốc ức chế HDAC thường theo phần + Nhóm nhận diện bề mặt + Vùng cầu nối + Và nhóm kết thúc gắn kẽm - Cụ thể, vai trò phần + Nhóm nhận diện bề mặt có vai trò tham gia nhận diện với bề mặt amino acid enzym + Vùng cầu nối có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, tạo tương tác với thành phần nằm kênh giúp chất giữ cố định kênh + Nhóm kết thúc gắn kẽm tham gia tạo tương tác với ion kẽm trung tâm hoạt động HDAC - Về phân loại chất ức chế HDAC: chất ức chế HDAC chia thành nhóm: acid hydroxamic, acid carboxylic, peptid vòng, aminobenzamid, epoxyceton phân tử lai Trong đó, acid hydroxamic với chất dẫn đường SAHA - hướng nhiều nhà khoa học quan tâm cấu trúc đơn giản ức chế nồng độ thấp (cỡ nM) - Dẫn chứng thuốc gần FDA cấp phép lưu hành điều trị ung thư belinostat (2014) panobinostat (2015) – chứa hợp phần acid hydroxamic nên chúng em định giữ lại phần cấu trúc làm nhóm kết thúc gắn kẽm - Về hướng nghiên cứu tổng hợp acid hydroxamic Vietnam giới: + Năm 2008, Chen cộng thay nhóm amid SAHA khung triazol, dãy dẫn chất có tác dụng tốt chọn lọc SAHA Ví dụ chất có cấu trúc cho hoạt tính mạnh SAHA lần + Năm 2011, NCS Đào Thị Kim Oanh sử dụng khung benzothiazol làm nhóm khóa hoạt động thu nhiều chất có hoạt tính tốt, chí tốt hẳn SAHA Khi độ dài cầu nối 6C, cho kết thử độc tính tế bào với IC50 trung bình 0,81 µg/ml + Và gần nhất, nghiên cứu mình, Zhang Z cộng tổng hợp chất có nhóm nhận diện bề mặt có chứa khung dimethyl isoxazol có hoạt tính tương đối tốt, ví dụ chất có cấu trúc hình có tác dụng ức chế mạnh HDAC-1 với IC50 0,15 µM => Nhóm khóa hoạt động vòng lớn, mang dị tố, có lợi cho hoạt tính - Cũng nghiên cứu Chen, ông đưa số đặc điểm vòng 1,2,3-triazol tương đối trơ mặt hóa học, không bị thủy phân, không bị khử hay oxy hóa, có moment lưỡng cực lớn (~ 5D), dễ dàng kết hợp với mục tiêu sinh học thông qua liên kết hydro tương tác lưỡng cực-lưỡng cực => Nó coi nhóm liên kết (CU) đưa vào cấu trúc nhằm tăng khả tương tác nhóm khóa hoạt động với amino acid bề mặt gần lối vào túi thân dầu HDAC, đồng thời cải thiện dược động học tăng tính chọn lọc với đích cụ thể, hạn chế độc tính thuốc so với sử dụng nhóm amid hay ceton - Minh chứng cho điều hoạt tính sinh học dẫn chất chứa vòng triazol như: tính kháng VK Lao, VK tả, kháng nọc rắn, ung thư bạch cầu, kháng virus HIV, ung thư vú, ức chế KST sốt rét ung thư sắc tố da - Cụ thể hoạt tính chống ung thư Trong nghiên cứu Reedijk + Dựa cấu trúc cisplatin – thuốc hóa trị liệu chống ung thư (FDA phê duyệt năm 1978) cho ung thư tinh hoàn buồng trứng + Reedijk thêm cấu trúc triazol kết cho thấy dẫn chất tổng hợp có độc tính tế bào mạnh cisplatin đến 18 lần Do đó, nghiên cứu mình, chúng em định thêm hợp phần triazol vào cấu trúc dẫn chất tổng hợp với mong muốn tăng hoạt tính dẫn chất tổng hợp - Các dẫn chất thiết kế hình vẽ với lý + Isatin dẫn chất mang khung isatin có nhiều tác dụng sinh học thú vị, số tác dụng chống ung thư + Ưu điểm vòng triazol nhóm kết thúc gắn kẽm acid hydroxamic minh chứng nghiên cứu trình bày - Trước vào tổng hợp, dẫn chất tiến hành nghiên cứu docking với kết bảng Ta thấy, dẫn chất VIa-d, X có lực liên kết với enzym HDAC-2 lớn với chất dẫn đường SAHA Điều giúp ta đánh giá sơ dẫn chất có hoạt tính lớn SAHA - Dựa sở đó, khóa luận thực với mục tiêu: + Tổng hợp dẫn chất có cấu trúc thiết kế + Thử hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp - Dựa mục tiêu nghiên cứu trên, chúng em xây dựng nội dung phương pháp nghiên cứu với nội dung: Nội dung Hóa học Nội dung Thử tác dụng sinh học Phần hóa học gồm có bước: Tổng hợp hóa học, thử độ tinh khiết khẳng định cấu trúc Thử tác dụng sinh học với phép thử là: Thử tác dụng ức chế HDAC-2; thử độc tính tế bào ung thư - Trước hết mặt hóa học - Các chất VIa-d đề tài tổng hợp theo quy trình gồm phản ứng với tác nhân, điều khiện sơ đồ - Để so sánh, chứng minh ảnh hưởng chiều dài cầu nối, chất X tổng hợp với quy trình tương tự chất VId với chiều dài cầu nối nhóm methylen - Quy trình tổng hợp chất sử dụng chất trung gian II VIII tổng hợp qua phản ứng SN2 Natri azid methyl bromo ester Sản phẩm thu có dạng lỏng, màu vàng, hiệu suất cao, 80% - Nguyên liệu ban đầu isatin dẫn chất 5-Fluoro, 5-Bromo, 5-Methoxy isatin đem alkyl hoá với Propagyl bromid dung môi DMF với xúc tác kali carbonat 50 độ C khoảng 3-4 h Kết sản phẩm IVa-d có dạng bột màu vàng đến nâu hiệu suất xấp xỉ 90% - Nguyên liệu trung gian IVa-d tham gia phản ứng Click với chất II chất VIII với xúc tác CuI Acetonitril tạo thành hợp chất V mang vòng triazol - Về phản ứng Click mà cụ thể phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác đồng (I) CuAAC + Cả alkyn azid hợp chất giàu lượng, khả phản ứng chúng Trong tự nhiên chúng phản ứng chậm, cần nhiệt độ cao cho sản phẩm không chọn lọc + Trong nghiên cứu độc lập nhà khoa học Sharpless Meldal khẳng định với xúc tác Cu(I), phản ứng xảy nhanh, hoàn toàn chọn lọc, cho sản phẩm vòng 1,2,3-triazol - Đó lý nghiên cứu sử dụng xúc tác CuI cho phản ứng - Các sản phẩm phản ứng Click thu dạng bột màu cam đến nâu, hiệu suất 80% Kết sắc ký lớp mỏng đo nhiệt độ nóng chảy thấy sản phẩm thu tinh khiết, đủ điều kiện để làm phản ứng - Phản ứng cuối cùng, phản ứng tạo acid hydroxamic, phản ứng này, phải sử dụng tác nhân NH2OH base, dạng không bền, nên phải dùng nguyên liệu ban đầu NH2OH.HCl với có mặt NaOH Tuy nhiên, NaOH dư tạo môi trường kiềm mạnh làm sản phẩm ester dễ bị thuỷ phân, cần tiến hành phản ứng điều kiện nhiệt độ thấp (-5 độ C) Theo dõi phản ứng SKLM thử phản ứng với dd Fe(III) đến khoảng 30 phút thấy ester phản ứng hết - Sản phẩm dạng bột kết tinh màu vàng nâu Các sản phẩm thu được đem tinh chế cách kết tinh lại hỗn hợp methanol-nước Hiệu suất trình khoảng 50-55% - Sản phẩm thu sau tổng hợp đem kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng đo nhiệt độ nóng chảy - Sắc ký lớp mỏng tiến hành nhôm tráng sẵn silicagel với hệ dung môi 1/DCM 2/ DCM:MeOH = 10:1 3/DCM:MeOH:AcOH = 100:40:1 Kết cho thấy chất có vết gọn, rõ, khơng có vết phụ Các dẫn chất VIa-d, X có nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp 1-2 độ C) - Dãy chất tổng hợp được xác định cấu trúc cách ghi phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, loại phổ cổng hưởng từ hạt nhân - Đây liệu phổ IR chất VIa-d, X, có vân hấp thụ đặc trưng liên kết O-H N-H nhóm chức acid hydroxamic, nhóm carbonyl - Ví dụ, phân tích phổ hồng ngoại VIc thấy rõ peak O-H, N-H, C-H, C=O, liên kết đơi vòng benzen alken Trong đó, dải hấp thụ nhóm OH NH cho thấy sản phẩm acid hydroxamic tổng hợp - Tuy nhiên, phổ IR cung cấp đầy đủ liệu để khẳng định chắn cấu trúc, nên chất tiếp tục đem đo phổ khối lượng Đây liệu phổ MS dẫn chất Các liệu thu phù hợp với chất thiết kế - Đây minh hoạ phổ MS VIb, thấy có pic ion phân tử loại bỏ hydro linh động với cường độ mạnh - Để xác định cấu trúc, chất đem đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Trên kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton dẫn chất số lượng proton, độ dịch chuyển, độ bội tín hiệu phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến - Minh họa phổ NMR proton VIa thấy rõ pic proton NOH oxim, NH OH nhóm hydroxamic, proton vòng triazol, pic proton vòng indolin CH2 mạch nhánh Trên phổ đồ dẫn chất khác khơng thấy xuất pic NH OH hydro linh động có xảy trao đổi hỗ biến với mơi trường - Tiếp theo liệu phổ 13C-NMR - Kết cho thấy số đỉnh phù hợp với số C chất - Ví dụ, phổ đồ VIa có + pic nhóm carbonyl + carbon vòng triazol, + pic lại nhân indol + Và pic CH2 vùng cầu nối - Trên sở đó, acid hydroxamic tiếp tục tiến hành thử hoạt tính sinh học Các phép thử thực ĐHQG Chung Buk, Hàn Quốc - Các dẫn chất VIa-d, X đem định lượng nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hoá HDAC-2 (IC50) phương pháp huỳnh quang Kết thu cho thấy dẫn chất tổng hợp có hoạt tính ức chế HDAC-2 bật dẫn chất VId có hoạt tính cao so với SAHA Các dẫn chất lại thấp SAHA từ 3-8 lần Cùng vị trí nhóm vị trí số vòng indolin, dẫn chất có hoạt tính ức chế HDAC-2 giảm dần thep thứ tự -OCH3 > -Br > -H > -F Tức nhóm hút điện tử làm giảm hoạt tính ức chế HDAC-2, nhóm đẩy điện tử cải thiện hoạt tính Chúng tơi đưa giả thiết rằng, dẫn chất VIb-c gắn nhóm hút điện tử có mật độ điện tử nhóm khóa hoạt động giảm Từ đó, tương tác Van der Waals với acid amin kênh enzym giảm, dẫn đến tác dụng ức chế HDAC chất VIb VIc - So sánh hai chất khác chiều dài cầu nối VId (3C) X (4C), ta nhận thấy cầu nối 3C tối ưu so với 4C Giả thiết đưa 3C chiều dài phù hợp để đưa nhóm kết thúc gắn với Zn2+ giúp nhóm khố hoạt động vị trí phù hợp tạo liên kết với acid amin bề mặt Do vậy, hoạt tính ức chế HDAC-2 VId cao X - Tác dụng ức chế HDAC định tác dụng kháng tế bào ung thư, nhiên để gây độc tính với tế bào, chất phải có khả thấm qua màng sinh học vào tế bào để tiếp cận với HDAC Do chất tổng hợp tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học dựa kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro - Từ bảng kết thử hoạt tính cho thấy dẫn chất có hoạt tính thấp khơng thể dòng tế bào thử nghiệm Riêng chất VIa có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư SW620 AsPC-1, dẫn chất VIb có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư SW620, dẫn chất X có tác dụng ức chế dòng tế bào PC-3 Đặc biệt, dẫn chất VIc VId có độc tính tế bào tốt tương đương với SAHA Điều minh họa biểu đồ - Trên biểu đồ, cột cao nghĩa giá trị IC50 cao hoạt tính yếu Cụ thể dòng tế bào - Trên dòng tế bào SW620, hai dẫn chất VIc VId mạnh so với SAHA, dẫn chất VId mạnh tới lần - Trên dòng tế bào PC-3, dẫn chất VId mạnh so với SAHA lần, dẫn chất VIc so với SAHA - Còn dòng tế bào AsPC-1, hai dẫn chất ưu SAHA độc tính tế bào, dẫn chất VIc gấp 1,5 lần so với SAHA VId chí mạnh SAHA gần lần - Sau hoàn thành bước thực nghiệm, em xin rút số kết luận sau: Về tổng hợp khẳng định cấu trúc: + Đã tổng dẫn chất dự kiến, dẫn chất VIa-d, X chưa cơng bố tài liệu + Đã khẳng định cấu trúc dẫn chất tổng hợp nhờ phân tích liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR - Về hoạt tính sinh học: + Tác dụng ức chế HDAC: Cả dẫn chất có tác dụng ức chế HDAC-2 + Tác dụng kháng tế bào ung thư: Cả dẫn chất có hoạt tính ức chế với dòng tế bào ung thư (SW620, PC-3 AsPC-1) đặc biệt dẫn chất VIc VId Tác dụng gây độc tế bào tốt chất VId dòng tế bào thử nghiệm - Em xin đề xuất kiến nghị + Tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro dẫn chất VIa-d enzym HDAC khác dòng tế bào ung thư khác => Để sàng lọc dẫn chất có tác dụng mạnh, làm sở cho việc thử tác dụng in vivo + Đánh giá tác dụng ức chế dẫn chất HDAC tổng + Thử nghiệm tác dụng dẫn chất tổng hợp đích khác virus HIV + Thay đổi hướng nghiên cứu cách thay vòng 1,2,3-triazol nhóm đẳng cấu điện tử thay đổi nhóm khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin ... dụng tốt chọn lọc SAHA Ví dụ chất có cấu trúc cho hoạt tính mạnh SAHA lần + Năm 2011, NCS Đào Thị Kim Oanh sử dụng khung benzothiazol làm nhóm khóa hoạt động thu nhiều chất có hoạt tính tốt, ... chứa khung dimethyl isoxazol có hoạt tính tương đối tốt, ví dụ chất có cấu trúc hình có tác dụng ức chế mạnh HDAC-1 với IC50 0,15 µM => Nhóm khóa hoạt động vòng lớn, mang dị tố, có lợi cho hoạt... (CU) đưa vào cấu trúc nhằm tăng khả tương tác nhóm khóa hoạt động với amino acid bề mặt gần lối vào túi thân dầu HDAC, đồng thời cải thiện dược động học tăng tính chọn lọc với đích cụ thể, hạn