Định lượng glucose trong huyết thanh, amylase huyết và tìm glucose trong nước tiểu

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH BÀI: ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG HUYẾT THANH, AMYLASE HUYẾT VÀ TÌM GLUCOSE TRONG NƯỚC TIỂU Ngày thực tập: 13/2/2017 Nhóm7: Ngơ Tấn Tài – Tổ 38 Nguyễn Huỳnh Phúc – Tổ 38 Khối – Lớp G I ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG HUYẾT THANH: Nguyên tắc Nồng độ glucose huyết xác định phản ứng oxy hóa với enzyme glucose oxidase (GOD) Phản ứng tạo hydroperoxid (H2O2) Chất ly giải phenol 4-aminophenazon xúc tác enzyme peroxidase (POD) tạo quinoneimin có màu đỏ tím Cường độ màu quinoneimin tỉ lệ thuận với lượng glucose ban đầu có mẫu Phương trình phản ứng: II Thuốc thử Thuốc thử R Đệm phosphat (pH 7.5) 0,1 mol/L 4-aminophenazon 0,25 mmol/L Phenol 0,75 mmol/L Glucose oxidase > 15 KU/L Peroxidase > 1,5 KU/L Mutarotase > 2,0 KU/L Chất ổn định > 2,0 KU/L Dung dịch chuẩn 100mg/dl hay 5,55 mmol/L III Tiến hành Huyết Dd Glucose chuẩn Thuốc thử R Ống chuẩn Ống đo - 10 μl 10 μl - 1.000 μl 1.000 μl Trộn , ủkhoảng 10 phút ởnhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ ánh sáng ống đo, ống chuẩn so với ống trắng bước sóng 500 nm IV Kết Glucouse huyết thanh(mg/dl) = (mg/dl) V Biện luận - Trong thể bình thường, chuyển hóa glucid ln điều hòa theo nhu cầu thể thể quan trọng rõ rệt điều hòa đường huyết - Bình thường đường huyết 0,7 – 1,2 g/L hay 70 – 120 mg% hay 4,22 – 6,67 mmol/L - Theo kết ,Glucose huyết đo 75,68 mg/dl hay 75,68 mg% Đường huyết nằm khoảng bình thường - Đường huyết ổn định nhờ cân hai nguồn: + Bổ sung, cung cấp glucose vào máu Nguồn glucid ngoại sinh từ thức ăn, nguồn nội sinh phân giải glycogen tân tạo glucose khoảng bữa ăn + Sử dụng glucose tổ chức, quan trọng mô , mô mỡ, mô thần kinh tổng hợp glycogen dự trữ tất tổ chức ( nhiều gan cơ) + Glucose liên tục lọc qua quản cầu thận tái hấp thu hoàn toàn qua ống thận Khi lượng glucose máu vượt ngưỡng thận ( khoảng 180mg%) glucose thải qua nước tiểu ( đường niệu) - Cơ chế diều hòa đường huyết +Gan đóng vai trò quan trọng điều hòa đường huyết nhờ chức glycogen gan Ngồi gan, tham gia vào trình đường huyết + Có nhiều yếu tố ảnh hupwngr dến đường huyết, yếu tố tác động trước hết đến glycogen gan chuyển hóa glucid mơ khác Hệ thống nội tiết điều hòa xác nhanh chóng qua hệ thần kinh trung ương, gồm hai hệ thống đối lập nhau: + Làm giảm đường huyết: chủ yếu insulin, lao động nặng + Làm tăng đường huyết: chủ yếu gluccagon, adrenalin hormon tuyến khác (tuyến giáp trạng, vỏ thượng thận, yên trước) Biểu tăng đường huyết thiếu insulin hay thừa hormon tăng đường huyết (cường tuyến tương ứng, giảm đường huyết thừa insulin hay thiểu tuyến tương ứng) Các rối loạn chuyển hóa glucid thể qua lâm sàng xét nghiệm Các biện pháp động học nhằm thăm dò khả đáp ứng hệ thống điều chỉnh đường huyết ta gây tăng giảm đường huyết (nghiệm pháp tăng đường huyết, nghiệm pháp tiêm adrenalin) nhằm đánh giá chức chuyển hóa chuyển biết quan ( nghiệm pháp galactose niệu) a) Adrenalin glucagon Khi đường huyết giảm glucagon tế bào α tụy tiết tác động lên gan kích thích gan phân giải glycogen hình thành glucose vào máu Sự co kích thích thần kinh (đáp ứng “chiến đấu hay bỏ chạy”) khiến tủy thượng thận giải phóng adrenalin, adrenalin kích thích gan phân giải glycogen thành glucose vào máu kích thích tăng phân giải glucogen cung cấp lượng cho hoạt động Xét tác dụng adrenalin Adrenalin gắn vào thụ thể (gọi thụ thể β hướng adrenalin-β-adrenergic) màng tế bào đích, chẳng hạn tế bào gan Diều kích thích adenylat cyclase xúc tác tạo AMPv từ ATP AMPv hoạt hóa proteinkinase thành dạng hoạt động (protein kinase A) Sau hàng loạt phản ứng (xem sơ đồ) b) Insulin Do tế bào β đảo Langerhans tuyến tụy Tác dụng làm tăng tính thấm màng tế bào Glucose, làm tăng sử dụng glucose tất mơ thể cách kích thích sinh sinh tổng hợp enzym chìa khóa đường phân, tăng tổng hợp glycogen tăng hoạt glycogen synthase, làm giảm phân lyglycogen gan, Do làm giảm đường huyết c) Thyroxin Hormon tuyển giáp tăng hấp thụ glucose ruột, tăng phân ly glycogen gan, làm tăng đường huyết d) Glucocorticoid Hormon vỏ thượng thận làm tăng đường huyết cách tăng tân tạo glucose, tăng hấp thụ glucose ruột, ức chế tiêu dùng glucose mơ ngồi gan, tăng phân ly glycogen goài gan, tăng phân ly glycogen e) Hormon trưởng thành Hormon yên trước làm giảm thấm glucose vào mô, giảm tổng hợp glycogen, tăng phân ly glycogen, làm tăng đường huyết f) ACTH tuyến yên trước ACTH kích thích vỏ thượng thận tiết hormon steroid có glucocorticoid (gây tăng đường huyết) II ĐỊNH LƯỢNG AMYLASE HUYẾT Nguyên tắc _ Trước kia, hoạt độ amylase máu, nước tiểu xác định phương pháp Wohlgemuth Phương pháp dựa phản ứng thủy phân tinh bột amylase; xác định độ pha lỗng amylase có 1ml huyết hay nước tiểu có khả thủy phân hết 2mg tinh bột sau 30 phút, 37 pH = 6,8 để suy hoạt độ enzym Bình thường: Amylase máu = 16 – 31 đơn vị Wohlgemuth Amylase nước tiểu = 32 – 64 đơn vị Wohlgemuth (Một đơn vị Wohlgemuth hoạt độ enzyme có 1ml huyết thanh, hay nước tiểu thủy phân hết 1mg tinh bột điều kiện xác định) _ Hiện nay, người ta xác định hoạt độ amylase theo phương pháp động học Nguyên lý: amylase thủy phân 2-chloro-4-nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3) thành 2-chloro-4-nitrophenol (CNP), 2-chloro-4-nitrophenyl-maltodioside glucose (G), theo phản ng sau: CNPG3 ỗ Amylase ố CNP + 2CNPG2 + 3G3 + 2G Sự giải phóng CNP từ chất tăng hấp thụ tỷ lệ thuận với hoạt độ amylase huyết Hiện nay, người ta dung Kit để xác định hoạt độ amylase máu, nước tiểu Trị số bình thường phụ thuộc vào kĩ thuật thuốc thử (chú yếu chất G3, G7) Các hãng khác cho kết khác nhau, kết đơn vị tính U/L Trong G3 2-chloro-4-nitrophenyl maltotrioside (CNPG3) G7 p-nitrophenylmaltoheptaoside (EPS) Thuốc thử Mã số: 12018; đóng gói 12 x 10ml - Đệm MES (pH = 6,0) 36 mmol/l - CNPG3 1,6 mmol/l - Calcium acetate 3,6 mmol/l - Sodium chloride 37 mmol/l - Potassium 253 mmol/l - Sodium azide 0,095% Tiến hành Cho vào cuvette 25 37 Mẫu thử 20 10 Thuốc thử RGT 1.000 1.000 Trộn đều, ủ phút nhiệt độ tương ứng, đọc kết thời điểm sau 1,2 phút Kết U/l (25) = A/min x 9864 U/l (37) = A/min x 24820 Chuyển đổi đơn vị: U/l = 16,67 x 10-3 = 60 U/l Ta có : U/l (37) = A/min x 24820 = 96,7 Ý nghĩa lâm sàng amylase Amylase huyết tăng cao torng viêm tụy cấp, đặc biệt cao viêm tụy cấp có hoại tử Ngồi ra, amylase huyết tăng số trường hợp như: Đợt cấp viêm tụy mạn Tắc ống dẫn tụy sỏi u; thuốc gấy co thắt đột ngột vòng (như opiat, codein, methylcholin, chlorothiazide), mức tăng amylase huyêt từ 2-15 lần so với bình thường Biến chứng viêm tụy (nang giả tụy, cổ trướng, apxe), chấn thường tụy, vết thương bụng Các u ác tính (đặc biệt u phổi, u buồng trứng, u tụy, u vú…) thường tăng 25 lần so với giới hạn bình thường (điều thấy viêm tụy) Suy thận tiến triển: thường tăng, chí khơng có viêm tụy Tăng tiết amylase Loét dày, tá tràng thủng vào tụy Do sỏi, u chèn ép tắc đường dẫn tụy Ung thư tuyến tụy Đôi khi, viêm gan truyền nhiễm, amylase khơng có nguốn gốc tụy vào máu tăng Tắc ruột, xơ gan, bệnh thận, thiếu niệu amylase nước tiểu giảm làm tăng amylase máu Amylase giảm tụy bị hoại tử lan rộng, ngồi giảm số bệnh lý như: Viêm tụy mạn tính Viêm tụy mạn tính tiến triển Xơ hóa ống dẫn tụy tiến triển Ứng dụng lâm sàng bệnh lý viêm tụy Để chẩn đoán bệnh viêm tụy cấp, bệnh viện thong thường người ta làm xét nghiệm sau: Amylase máu: Hoạt độ amylase máu nước tiểu viêm tụy cấp tăng cao so với bình thường Viêm tụy cấp làm hoạt độ 5amylase máu tăng nhanh cao bệnh hởi phát sau – giờ, tăng cao 460 U/l vòng 75% bệnh nhân, tăng 30-40 lần so với bình thường, cực đại sau 20 – 30 trì từ 48 – 72 Amylase tăng cao viêm tụy tiến triển, thường tăng cao giai đoạn đầu, giảm dần qua giai đoạn sau Hoạt độ amylase huyết tương tăng cao ( 1000 U/l) coi dấu hiệu viêm tụy cấp Hoạt độ cao tương tự gặp tắc nghẽn ống dẫn tụy Nó có xu hướng giảm sau vài ngày 10% bệnh nhân viêm tụy cấp Đặc biệt, ngày sau triệu chứng khởi phát gặp giá trị bình thường, chí chết viêm tụy cấp Amylase huyết tương tăng từ – 10 ngày gợi ý ung thư tụy kết hợp hay nang giả tụy  Amylase nước tiểu Tăng amylase nước tiểu phản ánh thay đổi amylase huyết tương sau – 10h Hoạt độ enzyme 24 bình thường, chí lấy mẫu xét nghiệm cho giá trị tăng Hoạt đô enzyme hữu ích, tăng 74 U/l/giờ Giá trị bình thường amylase Amylase máu: Người lớn: 53 – 123 U/L hay 0,88 – 2,05 nkat/L Người có tuổi: tăng nghẹ so với giá trị bình thường Vậy amylase người bình thường  Tăng hoạt độ amylase máu Các nguyên nhân thường gặp là: Viêm tụy cấp: rượu, tự miễn Đợt tiến triển cấp viêm tụy mạn Viêm tụy cấp thuốc (drug-induced acute pancreatitis) (VD: acid aminosalicylic, azathioprine, corticosteroid, dexamethasone, acid ethacrymic, rượu, furosemide, thiazide, mercaptopurin, phenformin, triamcinolon) Tắc nghẽn ống tụy sôi ung thư biểu mơ Bệnh lý đường mật: • Sỏi ống mật chủ • Viêm túi mật cấp Biến chứng viêm tụy (nang giả tụy, cổ chướng, áp-xe) Chấn thương tụy (VD: chấn thương bụng, sau tiến hành tụyđường mật ngược dòng qua nội soi) Tính thấm đường tiêu hóa bị biến đổi: • Bệnh ruột thiếu máu cục thủng ruột non • Thủng ổ loét dày tá tràng hay thùng ổ loét vào hậu cung mạc nối • Thủng thực quản Ngộ độc rượu cấp Bệnh lý tuyến nước bọt: viêm mưng mủ tuyến nước bọt, quai bị, tắc nghẽn ống dẫn nước bọt sỏi, sau tia xạ Các khối u ác tính, ung thư tụy, phổi, buồng trứng, thực quản, vú đại tràng (thường hoạt độ amylase tăng cao > 25 lần giới hạn bình thường cao mức tăng gặp viêm tụy cấp) Suy thận giai đoạn cuối (hoạt độ amylase máu tăng khơng có viêm tụy) Các nguyên nhân khác: • Bệnh gan mạn (VD: xơ gan với hoạt độ amylase máu thường tăng ≤ lần giá trị bình thường) • Nhiễm toan ceton đái tháo đường • Tăng lipid máu • Cường chức tuyến giáp • Có thai (bao gồm thai ngồi tử cung vỡ) • U nang buồng trứng • Bỏng • Phẫu thuật lồng ngực gần đây, phình tách động mạch chủ • Đái myoglobin (myoglobinuria) • Vỡ lách • Một số trường hợp chảy máu nội sọ (cơ chế không biết)  Giảm hoạt độ amylase máu Tình trạng phá hủy tụy nặng lan rộng (VD: viêm tụy cấp bùng phát, viêm tụy mạn giai đoạn cuối, xơ hóa nang giai đoạn cuối) Tổn hại gan nặng (VD: viêm gan, nhiễm độc, nhiễm độc thai nghén, nhiễm độc giáp nặng, bỏng nặng)  Các yếu tố góp phần làm thay đổi kết xét nghiệm: Mẫu bệnh phẩm bị vỡ hồng cầu làm thay đổi kết xét nghiệm Bệnh phẩm bị nhiễm bẩn nước bọt gây tăng giả tạo kết xét nghiệm Tăng glycerid nặng (>5 lần giá trị bình thường cao) gây tình trạng ức chế hoạt độ enzyme Suy thận gây tăng vừa hoạt độ amylase huyết Các thuốc làm tăng hoạt độ amylase huyết là: acetaminophen, kháng sinh, aspirin, corticosteroid, estrogen, furosemide, thuốc kháng viêm steroid, prednison, salicylate lợi tiểu nhóm thiazid Các thuốc làm tăng hoạt độ amylase niệu là: rượu, aspirin, bethanechol, codein, indomethacin, meperidin, morphin, pentazocin, thuốc lợi tiểu nhóm thiazide Các thuốc làm giảm hoạt độ amylase huyết là: citrate, oxalate gắn với ion canxi Các thuốc làm giảm hoạt độ amylase niệu là: fluorid, glucose ...I ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG HUYẾT THANH: Nguyên tắc Nồng độ glucose huyết xác định phản ứng oxy hóa với enzyme glucose oxidase (GOD) Phản ứng tạo hydroperoxid... kia, hoạt độ amylase máu, nước tiểu xác định phương pháp Wohlgemuth Phương pháp dựa phản ứng thủy phân tinh bột amylase; xác định độ pha lỗng amylase có 1ml huyết hay nước tiểu có khả thủy phân hết... enzym Bình thường: Amylase máu = 16 – 31 đơn vị Wohlgemuth Amylase nước tiểu = 32 – 64 đơn vị Wohlgemuth (Một đơn vị Wohlgemuth hoạt độ enzyme có 1ml huyết thanh, hay nước tiểu thủy phân hết