Định lượng glucose trong huyết thanh, amylase huyết và tìm glucose trong nước tiểu

Tác dụng làm tăng tính thấm của màng tế bào đối với Glucose, làm tăng sự sử dụng glucose ở tất cả các mô cơ thể bằng cách kích thích sinh sinh tổng hợp các enzym chìa khóa của sự đường p

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH

BÀI: ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG HUYẾT THANH, AMYLASE HUYẾT VÀ TÌM GLUCOSE TRONG NƯỚC

TIỂU

Ngày thực tập: 13/2/2017 Nhóm7: Ngô Tấn Tài – Tổ 38 Nguyễn Huỳnh Phúc – Tổ 38

Khối 4 – Lớp G

I ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG HUYẾT THANH:

1 Nguyên tắc

Nồng độ glucose huyết thanh được xác định bằng phản ứng oxy hóa với enzyme glucose oxidase (GOD) Phản ứng tạo ra hydroperoxid (H2O2) Chất này được ly giải bởi phenol và 4-aminophenazon dưới xúc tác của enzyme peroxidase (POD) tạo ra

quinoneimin có màu đỏ tím Cường độ màu của quinoneimin tỉ lệ thuận với lượng

glucose ban đầu có trong mẫu

Phương trình phản ứng:

II Thuốc thử

Thuốc thử R

Đệm phosphat (pH 7.5) 0,1 mol/L

4-aminophenazon 0,25 mmol/L

Phenol 0,75 mmol/L

Glucose oxidase > 15 KU/L

Peroxidase > 1,5 KU/L

Mutarotase > 2,0 KU/L

Chất ổn định > 2,0 KU/L

Dung dịch chuẩn 100mg/dl hay 5,55 mmol/L

III Tiến hành

Ống chuẩn Ống đo Huyết thanh - 10 μl

Dd Glucose chuẩn 10 μl

-Thuốc thử R 1.000 μl 1.000 μl

Trộn đều , ủkhoảng 10 phút ởnhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ ánh sáng của ống đo, ống chuẩn so với ống trắng ở bước sóng 500 nm

IV Kết quả

Glucouse huyết thanh(mg/dl) = (mg/dl)

V Biện luận

- Trong cơ thể bình thường, chuyển hóa glucid luôn được điều hòa theo nhu cầu của cơ thể thể hiện quan trọng và rõ rệt nhất là sự điều hòa đường huyết

- Bình thường đường huyết 0,7 – 1,2 g/L hay 70 – 120 mg% hay 4,22 – 6,67 mmol/L

- Theo kết quả ,Glucose huyết thanh đo được là 75,68 mg/dl hay 75,68 mg%

à Đường huyết này nằm ở khoảng bình thường

- Đường huyết luôn ổn định nhờ sự cân bằng giữa hai nguồn:

+ Bổ sung, cung cấp glucose vào máu Nguồn glucid ngoại sinh từ thức ăn, nguồn nội sinh do phân giải glycogen và tân tạo glucose ở khoảng giữa các bữa ăn

+ Sử dụng glucose ở các tổ chức, quan trọng nhất là mô cơ , mô mỡ, mô thần kinh và tổng hợp glycogen dự trữ ở tất cả các tổ chức ( nhiều nhất ở gan và cơ)

+ Glucose được liên tục lọc qua quản cầu thận và được tái hấp thu hoàn toàn qua ống thận Khi lượng glucose máu vượt quá ngưỡng thận ( khoảng 180mg%) thì glucose được thải ra qua nước tiểu ( đường niệu)

- Cơ chế diều hòa đường huyết

+Gan đóng vai trò rất quan trọng trong điều hòa đường huyết nhờ chức năng glycogen của gan Ngoài gan, cơ cũng tham gia vào quá trình đường huyết

+ Có nhiều yếu tố ảnh hupwngr dến đường huyết, và các yếu tố đó tác động trước hết đến glycogen của gan và chuyển hóa glucid ở cơ và các mô khác

Hệ thống nội tiết điều hòa chính xác và nhanh chóng qua hệ thần kinh trung ương, gồm hai hệ thống đối lập nhau:

+ Làm giảm đường huyết: chủ yếu là insulin, lao động nặng

+ Làm tăng đường huyết: chủ yếu là gluccagon, adrenalin và hormon của các tuyến khác (tuyến giáp trạng, vỏ thượng thận, yên trước)

Biểu hiện tăng đường huyết có thể do thiếu insulin hay thừa các hormon tăng đường huyết (cường năng các tuyến tương ứng, giảm đường huyết có thể do thừa insulin hay thiểu năng các tuyến tương ứng)

Các rối loạn chuyển hóa glucid sẽ thể hiện qua lâm sàng và các xét nghiệm Các biện pháp động học nhằm thăm dò khả năng đáp ứng của các hệ thống điều chỉnh đường huyết khi ta gây tăng hoặc giảm đường huyết (nghiệm pháp tăng đường huyết, nghiệm pháp tiêm adrenalin) hoặc nhằm đánh giá chức năng chuyển hóa chuyển biết của cơ quan ( nghiệm pháp galactose niệu)

a) Adrenalin và glucagon

Khi đường huyết giảm thì glucagon được tế bào α của tụy tiết ra và tác động lên gan và kích thích gan phân giải glycogen hình thành glucose vào máu Sự co

cơ hoặc sự kích thích thần kinh (đáp ứng “chiến đấu hay bỏ chạy”) khiến tủy thượng thận giải phóng adrenalin, adrenalin kích thích gan phân giải glycogen thành glucose vào máu và kích thích cơ tăng phân giải glucogen cung cấp năng lượng cho cơ hoạt động Xét tác dụng của adrenalin Adrenalin gắn vào thụ thể (gọi là thụ thể β hướng adrenalin-β-adrenergic) trên màng của tế bào đích, chẳng hạn tế bào gan Diều này kích thích adenylat cyclase xúc tác sự tạo AMPv từ ATP AMPv hoạt hóa proteinkinase thành dạng hoạt động (protein kinase A) Sau đó là hàng loạt phản ứng (xem sơ đồ)

b) Insulin

Do tế bào β đảo Langerhans tuyến tụy Tác dụng làm tăng tính thấm của màng

tế bào đối với Glucose, làm tăng sự sử dụng glucose ở tất cả các mô cơ thể bằng cách kích thích sinh sinh tổng hợp các enzym chìa khóa của sự đường phân, tăng

sự tổng hợp glycogen bằng sự tăng hoạt glycogen synthase, làm giảm sự phân lyglycogen ở gan, cơ Do đó làm giảm đường huyết

c) Thyroxin

Hormon tuyển giáp tăng hấp thụ glucose ở ruột, tăng phân ly glycogen ở gan,

do đó làm tăng đường huyết

d) Glucocorticoid

Hormon vỏ thượng thận làm tăng đường huyết bằng cách tăng tân tạo glucose, tăng hấp thụ glucose ở ruột, ức chế tiêu dùng glucose ở các mô ngoài gan, tăng phân ly glycogen

goài gan, tăng phân ly glycogen

e) Hormon trưởng thành

Hormon của yên trước làm giảm sự thấm glucose vào các mô, giảm tổng hợp glycogen, tăng phân ly glycogen, do đó làm tăng đường huyết

f) ACTH của tuyến yên trước

ACTH kích thích vỏ thượng thận tiết hormon steroid trong đó có glucocorticoid (gây tăng đường huyết)

II ĐỊNH LƯỢNG AMYLASE HUYẾT

1 Nguyên tắc

_ Trước kia, hoạt độ amylase máu, nước tiểu được xác định bằng phương pháp Wohlgemuth Phương pháp dựa trên phản ứng thủy phân tinh bột của

amylase; xác định độ pha loãng của amylase có trong 1ml huyết thanh hay nước tiểu có khả năng thủy phân hết 2mg tinh bột sau 30 phút, ở 37 và pH = 6,8 để suy

ra hoạt độ enzym

Bình thường:

Amylase máu = 16 – 31 đơn vị Wohlgemuth

Amylase nước tiểu = 32 – 64 đơn vị Wohlgemuth

(Một đơn vị Wohlgemuth là hoạt độ enzyme có trong 1ml huyết thanh, hay nước tiểu thủy phân hết 1mg tinh bột trong các điều kiện xác định)

_ Hiện nay, người ta xác định hoạt độ amylase theo phương pháp động học

Nguyên lý: amylase thủy phân 2-chloro-4-nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3) thành 2-chloro-4-nitrophenol (CNP), 2-chloro-4-nitrophenyl-maltodioside và glucose (G), theo phản ứng sau:

5 CNPG3 ç Amylase è 3 CNP + 2CNPG2 + 3G3 + 2G

Sự giải phóng CNP từ cơ chất và tăng sự hấp thụ của nó tỷ lệ thuận với hoạt độ amylase huyết thanh

Hiện nay, người ta dung Kit để xác định hoạt độ amylase máu, nước tiểu Trị số bình thường của nó phụ thuộc vào kĩ thuật và thuốc thử (chú yếu là cơ chất như G3, G7) Các hãng khác nhau cho kết quả khác nhau, kết quả đơn vị đều tính là U/L Trong đó G3

là 2-chloro-4-nitrophenyl maltotrioside (CNPG3) và G7 là

p-nitrophenyl-maltoheptaoside (EPS)

2 Thuốc thử

Mã số: 12018; đóng gói 12 x 10ml

- Đệm MES (pH = 6,0) 36 mmol/l

- CNPG3 1,6 mmol/l

- Calcium acetate 3,6 mmol/l

- Sodium chloride 37 mmol/l

- Potassium 253 mmol/l

- Sodium azide 0,095%

3 Tiến hành

Cho vào cuvette 25 37

Thuốc thử RGT 1.000 1.000

Trộn đều, ủ trong 1 phút ở nhiệt độ tương ứng, đọc kết quả ở thời điểm sau 1,2 và

3 phút

4 Kết quả

U/l (25) = A/min x 9864

U/l (37) = A/min x 24820

Chuyển đổi đơn vị:

1 U/l = 16,67 x 10-3

1 = 60 U/l

Ta có : U/l (37) = A/min x 24820

= 96,7

5 Ý nghĩa lâm sàng của amylase

Amylase huyết thanh tăng cao torng viêm tụy cấp, đặc biệt cao trong viêm tụy cấp

có hoại tử

Ngoài ra, amylase huyết thanh còn tăng trong 1 số trường hợp như:

Đợt cấp của viêm tụy mạn

Tắc ống dẫn tụy do sỏi hoặc u; thuốc gấy co thắt đột ngột cơ vòng (như opiat, codein, methylcholin, chlorothiazide), mức tăng amylase huyêt thanh từ 2-15 lần

so với bình thường

Biến chứng của viêm tụy (nang giả tụy, cổ trướng, apxe), chấn thường tụy, vết thương bụng

Các u ác tính (đặc biệt là u phổi, u buồng trứng, u tụy, u vú…) thường tăng hơn 25 lần so với giới hạn bình thường (điều này hiếm thấy ở viêm tụy)

Suy thận tiến triển: thường tăng, thậm chí cả khi không có viêm tụy

Tăng tiết amylase

Loét dạ dày, tá tràng thủng vào tụy

Do sỏi, hoặc u chèn ép tắc đường dẫn tụy

Ung thư tuyến tụy

Đôi khi, trong viêm gan truyền nhiễm, amylase không có nguốn gốc tụy vào máu tăng Tắc ruột, xơ gan, các bệnh về thận, thiếu niệu thì amylase nước tiểu giảm làm tăng amylase máu

Amylase giảm khi tụy bị hoại tử lan rộng, ngoài ra nó còn giảm trong 1 số bệnh lý như:

Viêm tụy mạn tính

Viêm tụy mạn tính tiến triển

Xơ hóa ống dẫn tụy tiến triển

6 Ứng dụng lâm sàng trong bệnh lý viêm tụy

Để chẩn đoán bệnh viêm tụy cấp, hiện nay ở các bệnh viện thong thường người ta làm các xét nghiệm sau:

Amylase máu:

Hoạt độ amylase máu và nước tiểu trong viêm tụy cấp tăng rất cao so với bình thường

Viêm tụy cấp làm hoạt độ 5amylase máu tăng nhanh và cao khi bệnh hởi phát sau 3 – 6 giờ, tăng cao hơn 460 U/l trong vòng 8 giờ ở 75% bệnh nhân, có thể tăng 30-40 lần so với bình thường, cực đại sau 20 – 30 giờ và có thể duy trì từ 48 –

72 giờ Amylase tăng cao trong viêm tụy tiến triển, thường tăng cao ở giai đoạn đầu, giảm dần qua các giai đoạn sau

Hoạt độ amylase huyết tương tăng cao ( trên 1000 U/l) được coi như dấu hiệu của viêm tụy cấp Hoạt độ cao tương tự có thể gặp trong tắc nghẽn ống dẫn tụy Nó có xu hướng giảm sau vài ngày ở hơn 10% bệnh nhân viêm tụy cấp Đặc biệt, khi quá 2 ngày sau các triệu chứng khởi phát có thể gặp giá trị bình thường, thậm chí ngay cả khi chết do viêm tụy cấp

Amylase huyết tương tăng từ 7 – 10 ngày sẽ gợi ý một ung thư tụy kết hợp hay nang giả tụy

 Amylase nước tiểu

Tăng amylase trong nước tiểu cũng phản ánh sự thay đổi amylase huyết tương sau 6 – 10h Hoạt độ enzyme 24 giờ có thể bình thường, thậm chí ngay cả khi lấy mẫu xét nghiệm từng giờ cho giá trị tăng Hoạt đô enzyme từng giờ có thể hữu ích, tăng hơn 74 U/l/giờ

Giá trị bình thường amylase

Amylase máu:

Người lớn: 53 – 123 U/L hay 0,88 – 2,05 nkat/L

Người có tuổi: tăng nghẹ so với giá trị bình thường

Vậy amylase của người trên bình thường

 Tăng hoạt độ amylase máu

Các nguyên nhân chính thường gặp là:

- Viêm tụy cấp: do rượu, tự miễn

- Đợt tiến triển cấp của viêm tụy mạn

- Viêm tụy cấp do thuốc (drug-induced acute pancreatitis) (VD: acid aminosalicylic, azathioprine, corticosteroid, dexamethasone, acid ethacrymic, rượu, furosemide, thiazide, mercaptopurin, phenformin, triamcinolon)

- Tắc nghẽn ống tụy do sôi hoặc ung thư biểu mô

- Bệnh lý đường mật:

• Sỏi ống mật chủ

• Viêm túi mật cấp

- Biến chứng của viêm tụy (nang giả tụy, cổ chướng, áp-xe)

- Chấn thương tụy (VD: chấn thương bụng, sau khi tiến hành tụy-đường mật ngược dòng qua nội soi)

- Tính thấm của đường tiêu hóa bị biến đổi:

• Bệnh ruột do thiếu máu cục bộ hoặc thủng ruột non

• Thủng ổ loét dạ dày tá tràng hay thùng ổ loét vào hậu cung mạc nối

• Thủng thực quản

- Ngộ độc rượu cấp

- Bệnh lý tuyến nước bọt: viêm mưng mủ tuyến nước bọt, quai bị, tắc nghẽn ống dẫn nước bọt do sỏi, sau tia xạ

- Các khối u ác tính, nhất là ung thư tụy, phổi, buồng trứng, thực quản,

vú và đại tràng (thường hoạt độ amylase tăng rất cao > 25 lần giới hạn bình

thường cao và mức tăng này hiếm khi được gặp trong viêm tụy cấp)

- Suy thận giai đoạn cuối (hoạt độ amylase máu tăng ngay cả khi không có viêm tụy)

- Các nguyên nhân khác:

• Bệnh gan mạn (VD: xơ gan với hoạt độ amylase máu thường tăng ≤

2 lần giá trị bình thường)

• Nhiễm toan ceton do đái tháo đường

• Tăng lipid máu

• Cường chức năng tuyến giáp

• Có thai (bao gồm cả thai ngoài tử cung vỡ)

• U nang buồng trứng

• Bỏng

• Phẫu thuật lồng ngực gần đây, phình tách động mạch chủ

• Đái myoglobin (myoglobinuria)

• Vỡ lách

• Một số trường hợp chảy máu nội sọ (cơ chế không được biết)

 Giảm hoạt độ amylase máu

- Tình trạng phá hủy tụy nặng và lan rộng (VD: viêm tụy cấp bùng phát, viêm tụy mạn giai đoạn cuối, xơ hóa nang giai đoạn cuối)

- Tổn hại gan nặng (VD: viêm gan, nhiễm độc, nhiễm độc thai nghén, nhiễm độc giáp nặng, bỏng nặng)

 Các yếu tố góp phần làm thay đổi kết quả xét nghiệm:

- Mẫu bệnh phẩm bị vỡ hồng cầu có thể làm thay đổi kết quả xét nghiệm

- Bệnh phẩm bị nhiễm bẩn nước bọt có thể gây tăng giả tạo kết quả xét nghiệm

- Tăng glycerid nặng (>5 lần giá trị bình thường cao) có thể gây tình trạng ức chế hoạt độ enzyme Suy thận cũng có thể gây tăng vừa hoạt độ amylase huyết thanh

- Các thuốc có thể làm tăng hoạt độ amylase huyết thanh là:

acetaminophen, kháng sinh, aspirin, corticosteroid, estrogen, furosemide, thuốc kháng viêm không phải steroid, prednison, salicylate và các lợi tiểu nhóm thiazid

- Các thuốc có thể làm tăng hoạt độ amylase niệu là: rượu, aspirin, bethanechol, codein, indomethacin, meperidin, morphin, pentazocin, thuốc lợi tiểu nhóm thiazide

- Các thuốc có thể làm giảm hoạt độ amylase huyết thanh là: citrate, oxalate do gắn với ion canxi

- Các thuốc có thể làm giảm hoạt độ amylase niệu là: fluorid, glucose