định lượng coliforms trong nước uống đóng chai aqua moon

định lượng coliforms trong nước uống đóng chai aqua moon

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGHUYÊN THIÊN NHIÊN

BÀI BÁO CÁO ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TRONG NƯỚC

UỐNG ĐÓNG CHAI AQUA MOON



GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Ths BẰNG HỒNG LAM

Mục lục

Trang

Danh sách bảng

Danh sách hình

Chương 1 Đặt vấn đề

Ngày nay, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì điều mà họ quan tâm là vệ sinh ăn uống Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Điều này không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước khác trên thế giới cũng vậy Một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi sinh vật gây hại trong thực phẩm

Kiểm soát chất lượng vệ sinh và an toàn thực phẩm luôn là mối quan tâm của mọi xã hội, mọi thời đại, đặc biệt là hiện nay, khi cuộc sống của con người ngày càng cao, chất lượng môi trường sinh quyển ngày càng thấp, nghĩa là hiểm họa từ các tác nhân lý, hóa và nhất là sinh học từ môi trường vào thực phẩm đang trở nên ngày một lớn Trong xu thế hội nhập hiện nay, các xí nghiệp chế biến thực phẩm nếu muốn sản phầm của mình đủ sức cạnh tranh không chỉ trên thị trường nội địa mà cả trên các thị trường nhập khẩu lớn với yêu cầu vệ sinh ngày càng một khắc khe Do vậy buộc các nhà sản xuất phải

có những qui trình kiểm tra vệ sinh thật khắc khe để đạt được các tiêu chuẩn quốc tế, một trong những chỉ tiêu mà họ quan tâm đến đó là số lượng

Coliforms trong các sản phẩm của mình.

Coliforms là sinh vật phổ biến trong đường tiêu hóa của con người và động

vật hầu hết chúng tồn tại một cách tự nhiên không gây hại cho con người Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress… thì

một số dòng Coliforms mang gen gây độc có thể gây bệnh trên người và một

số loài động vật Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá

mức an toàn trong vệ sinh thực phẩm Sự hiện diện một số lượng nhất định

Coliforms trong thực phẩm là đánh giá thực phẩm đó không an toàn cho người

sử dụng

Chương 2 Nội dung 2.1 Định nghĩa

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ

khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 370C trong 24 –

48 giờ Trong thực tế phân tích, coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn

có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt

Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật.

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm, nước, hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy

rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi

sinh vật gây bệnh khác cũng cao Tuy nhiên, mối liên hệ giữa các vi sinh vật

gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E coli, Citrobacter,

Klebsiella và Enterobacter Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được

thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC

Bảng 1: Biểu hiện sinh hóa các giống của Coliforms

Proskauer Citrat

Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số phản ứng dương tính và –(+): đa số phản ứng âm tính.

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi

trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 440C trong môi trường canh EC Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả

năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,50C trong canh Trypton

Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các

động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường

Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm Có

những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2oC và

cao đến 50oC trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5oC tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3-6oC

Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9.

Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy sau 12-16 giờ ở 37oC, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp

Coliforms gồm 2 nhóm:

trường dinh dưỡng ở 44oC, không mọc ở 4oC trong 30 ngày Là loại vi khuẩn

ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 41oC

đất, mọc nhanh ở 4oC trong 3-4 ngày và 10oC trong 1 ngày Không mọc ở

41oC, ở 44oC ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các Coliforms không có

nguồn gốc từ phân

2.2 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân bằng

phương pháp MPN

2.2.1 Khái niệm

MPN là phương pháp dùng để đánh giá mật độ vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu, với độ chính xác tương đối cao Phương pháp này còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ, chúng dựa trên kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật cần định lượng trong một môi trường lỏng thích hợp với một số lần lặp lại nhất định Pha loãng một số lần mẫu có chứa vi sinh vật, sau đó kiểm tra xem tới

độ pha loãng nào còn phát hiện sự có mặt của vi sinh vật cần kiểm tra

2.2.2 Nguyên tắc

Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân trong mẫu nước,

chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3-5 ống lặp lại Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm, đây là các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1ml mẫu nước ban đầu

2.2.3 Môi trường và hóa chất

- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)

- Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)

Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham

- Canh Tryptone

- Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate) môi trường

có chứa sodium citrate là nguồn carbon duy nhất Khi vi khuẩn sử dụng sodium citrate sẽ kiềm hóa môi trường và môi trường thạch sẽ có màu xanh

- Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water)

- Thuốc thử Kovac,s

- Canh MR- VP

- Thuốc thử Methyl Red

- Thuốc thử α-napthol

2.2.4 Quy trình phân tích

Thông tin về sản phẩm

Nước uống đóng chai AQUA MOON sản xuất tại cơ sở An Hạnh (địa chỉ: 22D2, Hà Huy Tập, khóm Đông Thịnh 6, phường Mỹ Phước, Long Xuyên, An Giang)

2.2.4.1 Định lượng Coliforms

Chuẩn bị mẫu nước đóng chai AQUA MOON, pha loãng mẫu, được mẫu có

độ pha loãng 10-1

Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB Thực hiện tương tự với dung dịch mẫu

đã pha loãng 10-2 và 10-3 Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy

nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu

quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn Ủ các ống nghiệm ở

37oC trong 48 giờ Ghi nhận số ống có sinh hơi Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở

37oC trong 48 giờ Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi

độ pha loãng

2.2.4.2 Định lượng Coliforms chịu nhiệt

Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 giờ Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng

2.2.4.3 Định lượng coliforms phân

Dùng que cấy vòng ria dung dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ Các

khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Coliforms phân hay E.coli giả định Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy truyền

vào canh Trypton, ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 giờ Nhỏ thuốc thử Kovacs vào các ống nghiệm Ống nghiệm có sự xuất hiện của màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+) Thực hiện tương tự cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả (+) trên môi trường Trypton tương ứng với mỗi độ pha loãng

2.2.5 Cách đọc kết quả

Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ống nghiệm có kết quả dương tính ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng Bảng MPN thích hợp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng

Chuẩn bị mẫu nước, pha loãng mẫu để có độ pha

loãng 10-1, 10-2, 10-3

Hình 1: Quy trình định hượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt,

Coliforms phân bằng phương pháp MPN

Đếm số ống canh EC (+) và indol (+), tra bảng MPN

Thử nghiệm Indol

ủ ở 44,5 ± 0,2 o C

24 giờ

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào canh Tryptone Cấy lên thạch EMB,ủ ở 37oC, 24 giờ

Cấy vào ống canh EC

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

ủ ở 44,5 ± 0,2 o C

24 giờ

ủ ở 37 o C ± 1 o C

48 giờ

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Chuyển 1ml dd 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh

LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại

Coliforms phân Coliforms chịu nhiệt

ủ ở 37 o C, 48 giờ

Coliforms

2.3 Định lượng Coliforms, Coliforms phân bằng phương pháp đếm khuẩn

lạc

2.3.1 Khái niệm

Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc

2.3.2 Nguyên tắc

Mẫu nước đem về được pha loãng và cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ Ngoài lactose, môi trường chọn

lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ

thị pH như neutral red, crystal violet Trên môi trường này khuẩn lạc

Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5 mm, xung quanh

khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để định lượng

Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình

đếm được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa

2.3.3 Môi trường và hóa chất

− Môi trường Troptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các binhg hay chai thủy tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4-8oC Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt

− Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng Có thể sử dụng môi trường Desoxycholate Agar thay cho VRB

− Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa một ống Durham úp ngược Hấp khử trùng Sau khi hấp kiểm tra các ống để đảm bảo không có bọt khí trong ống Durham

− Môi trường canh EC Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng

− Môi trường canh Trypton Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng

− Thuốc thử Kovac’s hay Indol

2.3.4 Quy trình phân tích

Chuẩn bị mẫu nước đóng chai AQUA MOON, pha loãng mẫu, được mẫu có

Mẫu được pha loãng tương tự như phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

sao cho chứa <100 tế bào Coliforms trong 1ml dung dịch pha loãng Chuyển

1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần để trộn điều dịch mẫu với môi trường Để ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thương Bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 45oC lên trên môi trường TSA Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37oC trong 24-48 giờ Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng

- Thử nghiệm khẳng định Coliforms

Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác không phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên

men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms cần thực hiện thêm

bước khẳng định như sau: Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy truyền sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL (trường hợp

khẳng định Coliforms tổng số) hoặc môi trường EC ( trường hợp khẳng định

giờ Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường

và sinh hơi trong ống Durham Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định

Ngoài ra, trường hợp thử nghiệm khẳng định Coliforms phân, các khuẩn lạc

cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm indol ở 44oC Thử

nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên

môi trường EC vừa là (+) trên thử nghiệm indol

Hình 2: Quy trình định lượng Coliforms, Coliforms phân

bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.3.5 Cách tính kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của

Coliforms và Coliforms phân theo công thức sau:

A (CFU/g hay CFU/ml) =

Chuẩn bị mẫu nước, pha loãng mẫu để có độ pha

loãng 10-1, 10-2, 10-3 Cấy 1ml dd mẫu vào đĩa petri, bổ sung 5ml môi trường TSA, lắc đều, để yên 1 – 2 giờ

Mật độ Coliforms phân

Thử nghiệm Indol Chọn ống canh (+) (sinh hơi)

Cấy vào ống canh EC, ủ

44oC, 24 – 48 giờ

Mật độ Coliforms

Đếm số ống canh (+) (sinh hơi);

tính tỉ lệ khẳng định Coliforms

Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở

37oC, 24 – 48 giờ

Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5 mm; chọn 5 khuẩn lạc

Rót vào mỗi đĩa 10 - 15ml môi trường thạch VRB, để

đông, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ

Đếm số ống canh EC (+) và indol

(+), tính tỉ lệ khẳng định Coliforms

phân

ni: số điã có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỉ lệ khẳng định

Chương 3 Kết luận và kiến nghị 3.1 Kết luận

Coliforms là sinh vật phổ biến trong đường tiêu hóa của con người và động

vật khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ gây hại cho con người nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress…

Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn

trong vệ sinh thực phẩm Sự hiện diện một số lượng nhất định Coliforms trong

thực phẩm là đánh giá thực phẩm đó không an toàn cho người sử dụng

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị Số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm, trong nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiện diện của

các vi sinh vật gây bệnh khác Số lượng Coliforms cao thì khả năng hiện diện

của vi sinh vật gây bệnh khác cao So với hầu hết các vi khuẩn gây bệnh

đường ruột, Coliforms có khả năng sống lâu hơn Nếu trong một thể tích nước

nhất định (100 mL) không phát hiện thấy vi khuẩn chị thị đường ruột này thì

có thể dùng làm nước uống hoặc nước sinh hoạt

3.2 Kiến nghị

Do Coliforms hiện diện ở khắp mọi nơi nên phải kiểm tra trên nhiều sản phẩm

khác nhau

Sử dụng thêm nhiều phương pháp khác để kiểm tra định lượng Coliforms,

Coliforms phân, Coliforms chịu nhiệt.

Nên ăn uống hợp vệ sinh, chọn thực phẩm an toàn để tránh các bệnh lây nhiễm đường ruột