định lượng coliforms trong nước uống đóng chai aqua moon
TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGHUYÊN THIÊN NHIÊN BÀI BÁO CÁO ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TRONG NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI AQUA MOON GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Ths. BẰNG HỒNG LAM AN GIANG 2015 Mục lục Nội dung Trang 2 Danh sách bảng 3 Danh sách hình 4 Chương 1 Đặt vấn đề Ngày nay, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì điều mà họ quan tâm là vệ sinh ăn uống. Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước khác trên thế giới cũng vậy. Một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi sinh vật gây hại trong thực phẩm. Kiểm soát chất lượng vệ sinh và an toàn thực phẩm luôn là mối quan tâm của mọi xã hội, mọi thời đại, đặc biệt là hiện nay, khi cuộc sống của con người ngày càng cao, chất lượng môi trường sinh quyển ngày càng thấp, nghĩa là hiểm họa từ các tác nhân lý, hóa và nhất là sinh học từ môi trường vào thực phẩm đang trở nên ngày một lớn. Trong xu thế hội nhập hiện nay, các xí nghiệp chế biến thực phẩm nếu muốn sản phầm của mình đủ sức cạnh tranh không chỉ trên thị trường nội địa mà cả trên các thị trường nhập khẩu lớn với yêu cầu vệ sinh ngày càng một khắc khe. Do vậy buộc các nhà sản xuất phải có những qui trình kiểm tra vệ sinh thật khắc khe để đạt được các tiêu chuẩn quốc tế, một trong những chỉ tiêu mà họ quan tâm đến đó là số lượng Coliforms trong các sản phẩm của mình. Coliforms là sinh vật phổ biến trong đường tiêu hóa của con người và động vật. hầu hết chúng tồn tại một cách tự nhiên không gây hại cho con người. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress… thì một số dòng Coliforms mang gen gây độc có thể gây bệnh trên người và một số loài động vật. Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn trong vệ sinh thực phẩm. Sự hiện diện một số lượng nhất định Coliforms trong thực phẩm là đánh giá thực phẩm đó không an toàn cho người sử dụng. 5 Chương 2 Nội dung 2.1. Định nghĩa Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 37 0 C trong 24 – 48 giờ. Trong thực tế phân tích, coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37 0 C trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước, hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa các vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E. coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC. Bảng 1: Biểu hiện sinh hóa các giống của Coliforms Phản ứng Indol Methyl Red Voges Proskauer Citrat Escherichia +(-) + - - Citrobacter -(+) + - + Klebsiella -(+) - + + Enterobacter -(+) - + + Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số phản ứng dương tính và –(+): đa số phản ứng âm tính. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44 0 C trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5 0 C trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm. Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2 o C và 6 cao đến 50 o C. trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5 o C tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3-6 o C. Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9. Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy sau 12-16 giờ ở 37 o C, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp. Coliforms gồm 2 nhóm: - Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong môi trường dinh dưỡng ở 44 o C, không mọc ở 4 o C trong 30 ngày. Là loại vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 41 o C. - Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc thủy sinh hay từ đất, mọc nhanh ở 4 o C trong 3-4 ngày và 10 o C trong 1 ngày. Không mọc ở 41 o C, ở 44 o C ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các Coliforms không có nguồn gốc từ phân 2.2. Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân bằng phương pháp MPN 2.2.1. Khái niệm MPN là phương pháp dùng để đánh giá mật độ vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu, với độ chính xác tương đối cao. Phương pháp này còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ, chúng dựa trên kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật cần định lượng trong một môi trường lỏng thích hợp với một số lần lặp lại nhất định. Pha loãng một số lần mẫu có chứa vi sinh vật, sau đó kiểm tra xem tới độ pha loãng nào còn phát hiện sự có mặt của vi sinh vật cần kiểm tra. 2.2.2. Nguyên tắc Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân trong mẫu nước, chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3-5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm, đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1ml mẫu nước ban đầu. 7 2.2.3. Môi trường và hóa chất - Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate) - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL) Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Canh Tryptone - Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate) môi trường có chứa sodium citrate là nguồn carbon duy nhất. Khi vi khuẩn sử dụng sodium citrate sẽ kiềm hóa môi trường và môi trường thạch sẽ có màu xanh. - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) - Thuốc thử Kovac , s - Canh MR- VP - Thuốc thử Methyl Red - Thuốc thử α-napthol 2.2.4. Quy trình phân tích Thông tin về sản phẩm Nước uống đóng chai AQUA MOON sản xuất tại cơ sở An Hạnh (địa chỉ: 22D2, Hà Huy Tập, khóm Đông Thịnh 6, phường Mỹ Phước, Long Xuyên, An Giang). 2.2.4.1. Định lượng Coliforms Chuẩn bị mẫu nước đóng chai AQUA MOON, pha loãng mẫu, được mẫu có độ pha loãng 10 -1 . Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10 -1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dung dịch mẫu đã pha loãng 10 -2 và 10 -3 .Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại. Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37 o C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 37 o C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng. 2.2.4.2. Định lượng Coliforms chịu nhiệt Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2 o C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng. 8 2.2.4.3. Định lượng coliforms phân Dùng que cấy vòng ria dung dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37 o C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Coliforms phân hay E.coli giả định. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy truyền vào canh Trypton, ủ ở 44,5 ± 0,2 o C trong 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovacs vào các ống nghiệm. Ống nghiệm có sự xuất hiện của màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+) . Thực hiện tương tự cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC. Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả (+) trên môi trường Trypton tương ứng với mỗi độ pha loãng. 2.2.5. Cách đọc kết quả Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ống nghiệm có kết quả dương tính ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng Bảng MPN thích hợp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. 9 10 Chuẩn bị mẫu nước, pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 Hình 1: Quy trình định hượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân bằng phương pháp MPN Đếm số ống canh EC (+) và indol (+), tra bảng MPN Thử nghiệm Indol ủ ở 44,5 ± 0,2 o C 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào canh Tryptone Cấy lên thạch EMB,ủ ở 37 o C, 24 giờ Cấy vào ống canh EC Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng ủ ở 44,5 ± 0,2 o C 24 giờ ủ ở 37 o C ± 1 o C 48 giờ Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng Chuyển 1ml dd 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại Coliforms phân Coliforms chịu nhiệt ủ ở 37 o C, 48 giờ Coliforms [...]... hơi); tính tỉ lệ khẳng định Coliforms Chọn ống canh (+) (sinh hơi) Mật độ Coliforms Thử nghiệm Indol Đếm số ống canh EC (+) và indol (+), tính tỉ lệ khẳng định Coliforms phân Mật độ Coliforms phân Hình 2: Quy trình định lượng Coliforms, Coliforms phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.3.5 Cách tính kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliforms phân theo... trình phân tích Chuẩn bị mẫu nước đóng chai AQUA MOON, pha loãng mẫu, được mẫu có độ pha loãng 10-1 11 - Mẫu được pha loãng tương tự như phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để định lượng Coliforms