NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CÁC ENZIM PROTEASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ

Mủ đu đủ được thu hoạch từ trái trong khoảng từ 810 tuần tuổi để thu được enzyme protease với hoạt tính và hiệu suất cao. Sắc ký trao đổi ion với giá thể gel SPStreamline kết hợp với sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể gel PhenilSepharoz có thể tinh sạch được một trong các thành phần enzyme trong mủ đu đủ. Thuận lợi của quy trình tinh sạch là có thể sản xuất nhiều mà không cần phải qua nhiều công đoạn như tủa bằng ammonium sulfat hay bằng cồn, sản phẩm tinh sạch hơn và không gây ô nhiễm môi trường. Thêm vào đó, do nguồn papain dồi dào, gel dùng để chạy sắc ký có thể tái sử dụng nhiều lần, vì vậy gía thành thấp hơn papain thương mại. Tuy nhiên phương pháp này khó tách rửa enzyme có hàm lượng lớn và phải sử dụng một lượng lớn dung dịch đệm để tách rửa nên nồng độ enzyme thu được sau khi qua cột rất loãng, có thể nên kết hợp sử dụng phương pháp siêu lọc để tách muối đồng thời có hoạt tính enzyme tốt hơn. Xử lý dung dịch enzyme với 2PDS trước khi cho qua cột sắc ký trao đổi ion có thể bảo vệ enzyme tránh tình trạng tự phân giải trong quá trình tinh sạch

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CÁC ENZIM PROTEASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ (Carica papaya) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Nguyễn Thị Hà1 Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 03/08/2014 Ngày chấp nhận: 09/06/2015 Title: Purification of enzyme proteases from papaya (Carica papaya) latex by liquid chromatography Từ khóa: Enzim protease, Sắc ký trao đổi ion, sắc ký tương tác kỵ nước Keywords: Proteases, papaya latex, Ionexchange chromatography, Hydrophobic interaction chromatography ABSTRACT Enzyme proteases with high yield and activity could be extracted from the latex of the papaya fruits of 8-10 weeks maturity Ion-exchange chromatography on gel SP-Streamline in combination with Hydrophobic Interaction Chromatography on gel Phenyl Sapharose could be applied to obtain one of the enzyme components in papaya latex with high purity The advantages of the procedures were producing a wide range of enzyme without spending many stages of Preliminary precipitation with organic solvents: ammonium sulfat, acetone and ethanol As a result, enzyme would be more purified and environmentally friendly In addition, papain sources was various and gel could be reused So, the price was lower compared to commercial papain However, because enzyme concentration was very diluted, it was better to combine ultrafilter to separate salt Treating enzyme solution with 2-PDS before throughout ion exchange chromatography column could prevent enzyme from autolyzing during the process of purification of enzyme TÓM TẮT Mủ đu đủ thu hoạch từ trái khoảng từ 8-10 tuần tuổi để thu enzyme protease với hoạt tính hiệu suất cao Sắc ký trao đổi ion với giá thể gel SP-Streamline kết hợp với sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể gel Phenil-Sepharoz tinh thành phần enzyme mủ đu đủ Thuận lợi quy trình tinh sản xuất nhiều mà không cần phải qua nhiều công đoạn tủa ammonium sulfat hay cồn, sản phẩm tinh không gây ô nhiễm môi trường Thêm vào đó, nguồn papain dồi dào, gel dùng để chạy sắc ký tái sử dụng nhiều lần, gía thành thấp papain thương mại Tuy nhiên phương pháp khó tách rửa enzyme có hàm lượng lớn phải sử dụng lượng lớn dung dịch đệm để tách rửa nên nồng độ enzyme thu sau qua cột lỗng, nên kết hợp sử dụng phương pháp siêu lọc để tách muối đồng thời có hoạt tính enzyme tốt Xử lý dung dịch enzyme với 2-PDS trước cho qua cột sắc ký trao đổi ion bảo vệ enzyme tránh tình trạng tự phân giải trình tinh nghệ chế biến thực phẩm, công nghiệp hóa chất, bào chế dược phẩm, kỹ nghệ tơ sợi dệt may công nghiệp thuộc da (Phan Xi Păng, GIỚI THIỆU Papain trích ly từ mủ trái đu đủ Carica papaya ứng dụng phổ biến cơng 30 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 2002) Thành phần enzim papain thu từ trái đu đủ xanh phức tạp không đồng nhất, dùng phương pháp kết tủa muối ammonium sulfat hay trích ly cồn (Nguyễn Đức Lượng, 2002), cho sản phẩm thơ có hoạt tính khơng cao Tinh phương pháp sắc ký lỏng giá thể khác cột trao đổi ion, cột sắc ký lực hấp phụ hay cột sắc ký tương tác kỵ nước (Zucker ctv 1984, Dekeyser ctv 1994) tinh enzim từ mủ đu đủ pháp dùng để phân tích hiệu hàm lượng protein cần phân tách hỗn hợp có hàm lượng thấp Các protein bám lại giá thể rửa giải nhiều cách thay đổi pH, nồng độ muối hay dùng chất cạnh tranh, có chất với nhóm chức giá thể, chất cạnh tranh đẩy protein tách khỏi giá thể  Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography -HIC) Sắc ký tương tác kỵ nước thực dựa nguyên lý tương tác kỵ nước nhóm kỵ nước bề mặt protein cần phân tách với nhóm kỵ nước giá thể sử dụng Dung dịch protein môi trường nước bao quanh lớp áo nước nhóm ưa nước hydrophobic hướng tạo liên kết hydro với phân tử nước, gốc kỵ nước hydrophilic hướng vào Trong mơi trường có nồng độ muối cao, phân tử protein bị lớp áo nước bao quanh, nhóm kỵ nước lộ bên ngồi tương tác với gốc kỵ nước giá thể Protein bám lại giá thể rửa giải cách dùng gradien nồng độ muối giảm dần hay dùng gradien nồng độ tăng dần chất hữu ethylen glycol (50-80%), thực nghiệm thường người ta phối hợp hai gradien để rửa giải hết protein bám cột VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Mủ đu đủ 2.2 Phương pháp  Sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp phân tách dựa vào nguyên lý tương tác điện tích bề mặt phân tử protein dung dịch với nhóm trao đổi ion (nhóm mang điện tích) chất rắn (giá thể) mức độ khác Có hai loại giá thể dùng sắc ký trao đổi ion: Chất trao đổi ion âm (anion exchanger) chất mang nhóm điện tích dương (+) tương tác với ion âm (-) Ngược lại, chất trao đổi ion dương (cation exchanger) chất mang nhóm điện tích âm (-) tương tác với ion dương (+) Trong trình sắc ký, phân tử protein dung dịch liên kết trao đổi ion thuận nghịch với giá thể Các protein không bám trước theo dòng dung dịch đệm, protein tạo liên kết ion bám lại giá thể rửa giải dung dịch đệm với gradien nồng độ muối gradien pH tăng dần (continuous gradient) hay rửa giải dung dịch đệm có nồng độ muối hay pH khác (stepwise)  Sắc ký lọc gel hay sắc ký rây phân tử (Gel filtration hay Size Exclusion Chromatography) Phương pháp sắc ký lọc gel dùng để phân tách protein dựa vào khả khác kích thước phân tử chúng Nguyên lý sắc ký lọc gel dựa phân bố protein dung môi tự dung môi nằm lỗ hạt Dung môi tự pha động, dung mơi nằm lỗ pha tĩnh Mức độ khuếch tán phân tử chất tan phụ thuộc chủ yếu vào kích thước cấu hình chúng Gel hạt xốp có cấu trúc mạng lưới khơng gian ba chiều khâu ghép hở tạo lỗ hổng bên hạt Các lỗ có kích thước khơng cho phân tử lớn chui lọt, chúng khuếch tán vào kẽ hở hạt bị rửa khỏi cột sớm, phân tử bé có khả xâm nhập vào lỗ Khi dòng pha động liên tục qua, phân tử nhỏ lại khỏi lỗ di chuyển pha động ta tách phân đoạn phân tử có kích thước phân tử khác nhau, lớn trước, nhỏ sau Tùy theo trọng lượng phân tử chất cần phân tách mà loại gel có kích thước lỗ khác sử dụng Các protein đẩy dựa vào mức độ tích điện protein, nói cách khác dựa vào tương tác mạnh hay yếu protein giá thể Các protein có độ tích điện thấp, mức độ tương tác yếu đẩy trước Các protein có độ tích điện cao, mức độ tương tác mạnh đẩy sau  Sắc ký lực chromatography - AC) hấp phụ (Affinity Sắc ký lực hấp phụ thực dựa nguyên lý tương tác đặc hiệu thuận nghịch protein cần tinh hỗn hợp với nhóm chức giá thể Các tương tác đặc hiệu tương tác enzim - chất, enzim-chất ức chế, kháng nguyên - kháng thể, DNA-protein… Phương 31 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Cơng nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 trích ly enzim nước cất với tỉ lệ :10 :w :v xác định hoạt tính theo phương pháp Kunitz cải tiến với chất casein (Kunitz, 1947), kết nhận Hình KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hoạt tính enzim papain theo thời gian tăng trưởng trái đu đủ Mủ đu đủ thu trái từ 2-20 tuần tuổi, Hình 1: Biến đổi hoạt tính enzim q trình tăng trưởng trái đu đủ Kết Hình cho thấy trái hai tuần tuổi hoạt tính enzim papain mủ cao nhiên trái lúc nhỏ lượng mủ Hoạt tính enzim tăng dần cao trái đu đủ 10 tuần tuổi Điều phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Đức Lượng (2000) sử dụng phương pháp kết tủa với cồn 70o Papain thu có hoạt tính cao trái giai đoạn 10 tuần tuổi 3.2 Sắc ký trao đổi ion cột SP-Streamline lý với 2-PDS sau qua cột sắc ký với giá thể trao đổi ion SP-Streamline Kết cho thấy tính đa dạng thành phần enzim mủ đu đủ (Hình 2) Các protein phân tách thành bốn phân đoạn, phân đoạn UB protein không bám giá thể, phân đoạn khơng có hoạt tính enzim lượng protein Các phân đoạn I, II III rửa giải với dung dịch đệm với nồng độ muối tương ứng 0.25M, 0.35M 0.6M NaCl Dung dịch enzim trích ly từ mủ đu đủ xử A280 nm Phân đoạn sắc ký Hình 2: Sắc ký đồ dung dịch enzim papain trích ly từ mủ đu đủ xử lý với 2-PDS cột SP-Streamline, dung dịch đệm ammonium acetat 0.1M, pH 5.0 có chứa 5mM EDTA 0.5mM phenylmercuric acetat Ghi chú: UB: phân đoạn protein không bám giá thể I: phân đoạn 0.25M NaCl II: phân đoạn 0.35M NaC III: phân đoạn 0.6M NaCL 32 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 Kết tương tự kết Dekeyser (1994) với giá thể trao đổi ion Mono S 5/5 Phân đoạn I ứng với enzim papain với hàm lượng thấp khoảng 11% tổng protein, phân đoạn II ứng với enzim chymopapain chiếm phần lớn tổng protein, khoảng 60% ; phân đoạn có lẫn enzim papaya proteinaz IV Phân đoạn III ứng với enzim papaya proteinaz III, chiếm 29% protein tổng số 3.3 Sắc ký lực hấp thụ với giá thể gel Bacitracin-Eupergit C Do phân đoạn protein nhận sau qua cột trao đổi ion phức tạp Để tách enzim khỏi protein tạp, dùng phương pháp sắc ký lực hấp thụ với giá thể gel BacitracinEupergit C Hình 3: Sắc ký đồ phân đoạn enzim papain cột sắc ký Bacitracin-Eupergit C Chú thích a: phân đoạn I, 0.25M NaCl b: Phân đoạn II, 0.35M NaCL c: phân đoạn III, 0.6M NaCl Các phân đoạn enzim I, II, III nhận qua cột sắc ký trao đổi ion tiếp tục cho qua cột sắc ký lực hấp thụ Bacitracin-Eupergit C (1983) Tuy nhiên, phân tích điện di gel SDS-PAGE (Laemmli, 1970) cho thấy enzim chưa tách khỏi protein tạp (Hình 4), protein tạp lẫn enzim phân đoạn bám vào giá thể rửa giải lúc Có thể tính đặc hiệu Bacitracin khơng cao để tách enzim khỏi hỗn hợp Kết sắc ký đồ cho thấy ba phân đoạn sau qua cột lực hấp phụ bacitracinEupergit cho phân đoạn (Hình 3), tương tự kết nhận Stepanov 33 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 Hình 4: Điện di đồ phân đoạn enzim papain nhận sau qua cột sắc ký BacitracinEupergit C Chú thích: 1: protein chuẩn 2, 10: phân đoạn 0.6M NaCl 4: phân đoạn 0.25M NaCl 5, 6,7 8: phân đoạn 0.35M NaCl sau cho qua cột sắc ký lọc gel nhằm tách protein có khối lượng phân tử thấp Tuy nhiên, kết nhận sắc ký lọc gel có phân đoạn protein nhất, điện di gel SDSPAGE cho thấy enzim chưa tách khỏi protein tạp Các dải băng protein khối lượng phân tử thấp diện phân đoạn có chứa enzim (Hình 5) 3.4 Sắc ký lọc gel với giá thể gel Sephadex G25 Theo Kyden (1998) có khả protein tạp sản phẩm phân giải enzim có mang nhóm – SH tự phân tử liên kết với enzim qua cầu nối disulfit, phân đoạn enzim xử lý trước với hợp chất có tính khử Ditiotreitol để phá vỡ cầu nối disulfit Hình 5: Điện di đồ phân đoạn enzim nhận sau qua cột sắc ký Sephadex G 25 Chú thích: protein chuẩn 2,3 4: phân đoạn 0.25M NaCl 6: phân đoạn 0.35M NaCl 8: phân đoạn 0.6M NaCl 34 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 3.5 Sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể Phenil –Sepharoz 3.5.1 Rửa giải protein với nồng độ muối từ 1.0M-0.0M ammonium sulfat Do phương pháp không đạt hiệu việc tinh enzim, cần có phương pháp thích hợp đặc hiệu để tách enzim khỏi hỗn hợp, phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể Phenil –Sepharoz áp dụng Dung dịch enzim sau qua cột sắc ký tương tác kỵ nước, protein bám vào giá thể rửa giải gradien nồng độ muối khác Phân đoạn 0.35M NaCl thu sau qua cột SP-Streamline, phân đoạn có chứa enzim chymopapain papaya proteinaz III, cho qua cột sắc ký tương tác kỵ nước Phenil –Sepharoz voi nồng độ ammonium sulfat ban đầu dung dịch protein 1,0M Các protein bám lại giá thể rửa giải với gradien nồng độ muối giảm dần từ 1.0-0.0M ammonium sulfat Qua sắc ký đồ (Hình 6) nhận thấy có phân đoạn protein tách ra, phân đoạn có hoạt tính enzim A280 Phân đoạn sắc ký Hình 6: Sắc ký đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz, gradien nồng độ ammonium sulfat 1.0M-0.0M Tuy nhiên, kết điện di gel SDS-PAGE (Hình 7) cho thấy phân đoạn enzim lẫn protein tạp Có thể muối ammonium sulfat nồng độ 1.0M chưa đủ cao để tách lớp áo nước phân tử enzim đưa phần có tính kỵ nước phân tử enzim bên ngồi 24 kDa Hình 7: Điện di đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz, gradien nồng độ ammonium sulfat 1.0M-0.0M Chú thích: 8: protein chuẩn 5: phân đoạn 6: phân đoạn 7: phân đoạn 35 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 dung dịch protein trước qua cột rửa giải protein với gradien Ammonium sulfat từ 1,50,0M, thành phần protein sau qua cột HIC phân tách thành phân đoạn 3.5.2 Rửa giải protein với gradien nồng độ muối ammonium sulfat từ 1.5-0.0M Kết sắc ký đồ (Hình 8) cho thấy tăng nồng độ muối đến 1.5M ammonium sulfat A280 Phân đoạn sắc ký Hình 8: Sắc ký đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz với gradien (NH4)2SO4 từ 1.5M-0.0M 25kDa Hình 9: Điện di đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz, với gradien nồng độ ammonium sulfat 1.5M-0.0M Chú thích: 8: protein chuẩn 2,3 4: phân đoạn 0.35M NaCl trước qua cột HIC 5: phân đọan 6: phân đoạn 7: phân đoạn Kết điện di gel SDS-PAGE cho thấy enzim trường hợp tinh sạch, điện di đồ (Hình 9, cột 5) có băng protein khối lượng phân tử khác điểm đẳng điện cần kiểm tra lại phương pháp điện di điểm đẳng điện để chắn có enzim tinh hồn tồn Bên cạnh đó, cần phải nghiên cứu thêm việc nâng qui trình tinh lên phạm vi lớn hơn, cột trao đổi ion, việc nâng cấp lên phạm vi tinh lớn nghiên cứu thực được, nhiên cột sắc ký Như vậy, kết hợp hai phương pháp sắc ký trao đổi ion giá thể SP-Streamline sắc ký tương tác kỵ nước giá thể Phenil-Sepharoz phân đoạn enzim 0.35M NaCl, có khả phân đoạn enzim chymopapain tinh từ mủ đu đủ Tuy nhiên, enzim mủ đu đủ có 36 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 38 (2015)(2): 30-37 tương tác kỵ nước cần phải nghiên cứu tiếp tục TÀI LIỆU THAM KHẢO Dekeyser, P.M.1994 Fractionation and purification of the thiol proteinases papaya latex University of Ghent, Wolterslaan 16,9000 ghent, Belgium Janson, J.C and Kyden L.1998 Protein purification, 2nded A John Willey & Con, Inc, Puplication Kunitz, M 1947 Crystalline soybean trypsin inhibitor Part II General properties J General Physiology 30: 291-296 Leammli U.K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227:680-685 Nguyễn Đức Lượng ctv 2002 Nghiên cứu thu nhận tinh chế papain từ đu đủ trồng Việt Nam Một số ứng dụng papain y học công nghệ thực phẩm Hội nghị khoa học công nghệ lần Trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh 1-12 Phanxipăng 2003 Đu đủ lạ hay quen Kiến thức ngày Liên hiệp hội Văn học nghệ thuật TP Hồ Chí Minh (457) Stanley Zucker ctv 1984 the proteolitic activities of chymopapain, papain, and papaya proteinase III Departement of Biochemistry, Strangeways Research Laboratory, Worts causeway, Cambridge CB1 4RN, U.K KẾT LUẬN Mủ đu đủ thu hoạch từ trái khoảng từ 8-10 tuần tuổi để thu enzim với hoạt tính hiệu suất cao Sắc ký trao đổi ion với giá thể gel SP-Streamline kết hợp với sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể gel Phenil-Sepharoz dùng để tinh enzim mủ đu đủ Thuận lợi qui trình tinh sản xuất nhiều mà không cần phải qua nhiều công đoạn tủa ammonium sulfat hay cồn, sản phẩm tinh không gây ô nhiễm môi trường Thêm vào đó, nguồn papain dồi dào, gel dùng để chạy sắc ký tái sử dụng nhiều lần, giá thành thấp papain thương mại Nhưng phương pháp khó tách rửa enzim có hàm lượng lớn Mặt khác, ta sử dụng lượng lớn dung dịch đệm để tách rửa nên nồng độ enzim thu sau qua cột lỗng, nên kết hợp sử dụng phương pháp siêu lọc để tách muối đồng thời có hoạt tính enzyme tốt Xử lý dung dịch enzim với 2-PDS trước cho qua cột sắc ký trao đổi ion bảo vệ enzim tránh tình trạng tự phân giải trình tinh LỜI CẢM TẠ Cám ơn Viện Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện vật chất cho thí nghiệm 37 ... trưởng trái đu đủ Mủ đu đủ thu trái từ 2-20 tuần tuổi, Hình 1: Biến đổi hoạt tính enzim q trình tăng trưởng trái đu đủ Kết Hình cho thấy trái hai tuần tuổi hoạt tính enzim papain mủ cao nhiên... tương tác kỵ nước giá thể Phenil-Sepharoz phân đoạn enzim 0.35M NaCl, có khả phân đoạn enzim chymopapain tinh từ mủ đu đủ Tuy nhiên, enzim mủ đu đủ có 36 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ... tương ứng 0.25M, 0.35M 0.6M NaCl Dung dịch enzim trích ly từ mủ đu đủ xử A280 nm Phân đoạn sắc ký Hình 2: Sắc ký đồ dung dịch enzim papain trích ly từ mủ đu đủ xử lý với 2-PDS cột SP-Streamline, dung