Phòng trị bệnh thối rễ (do fusarium sp ) và thối nõn (do phytophthora sp ) trên cây khóm (dứa) bằng nấm đối kháng sinh học trichoderma spp và biện pháp tổng hợp (IPNM) tại tỉnh hậu giang

1.1.1 Khả năng tiết enzym và tác dụng đối kháng của Trichoderma1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động đối 2.1 Sưu tập nấm gây bệnh và nấm đối kháng tại thị xã Vị Tha

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH HẬU GIANG

TẠI TỈNH HẬU GIANG

Cơ quan chủ trì: TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Chủ nhiệm đề tài: Ths DƯƠNG MINH

HẬU GIANG-2010

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH HẬU GIANG

TẠI TỈNH HẬU GIANG

Cơ quan chủ trì: TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Chủ nhiệm đề tài: Ths DƯƠNG MINH

HẬU GIANG-2010

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài (dự án): “Phòng trị bệnh thối rễ (do Fusarium sp.) và thối nõn (do

Phytophthora sp.) trên cây khóm (dứa) bằng nấm đối kháng sinh học Trichoderma spp và biện pháp tổng hợp (IPNM) tại tỉnh Hậu Giang”

Lĩnh vực: Phòng trừ sinh học dịch bệnh hại cây

2 Chủ nhiệm đề tài: Ths Dương Minh

3 Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Cần Thơ

Địa chỉ: Đường 3/2, Thành phố Cần Thơ Số điện thoại: 07103-832663

4 Danh sách cán bộ tham gia chính (tên, học vị, chức danh, đơn vị công tác):

nghiệp & SHƯD, ĐHCT

nghiệp & SHƯD, ĐHCTTrần Ngọc Thúy Kỹ sư Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nôngnghiệp & SHƯD, ĐHCT

5 Thời gian thực hiện đã được phê duyệt:

Năm bắt đầu : Tháng 5/2005 Năm kết thúc: Tháng 5/2007

6 Thời gian kết thúc thực tế (thời điểm nộp báo cáo kết quả): 24/12/2008

7 Kinh phí thực hiện đề tài: 180.000.000 đồng (Một trăm tám mươi triệu đồng)

II KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA ĐỀ TÀI

1 Kết quả nghiên cứu:

1.1 Ý nghĩa khoa học của kết quả nghiên cứu

Đề tài phần lớn đã áp dụng tiến bộ khoa học công nghệ cao trong việc triểnkhai thí nghiệm và ứng dụng thực tiễn Các thí nghiệm đều được bố trí đúngphương pháp, thu thập số liệu nghiêm túc, xử lý thống kê đầy đủ, do đó kết quả cógiá trị khoa học cao

1.2 Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng kết quả khoa học

Đề tài có thể ứng dụng, phát triển khoa học-công nghệ, trong nghiên cứu,giảng dạy và trong sản xuất Kết quả có triển vọng để chuyển giao và áp dụng rộngrãi trong sản xuất

2 Các sản phẩm khoa học (nếu có)

Bài báo cáo Tổng kết khoa học và luận văn tốt nghiệp Đại học

3 Kết quả tham gia đào tạo (nếu có)

Đề tài là đối tượng nghiên cứu cho 01 luận văn tốt nghiệp đại học và hỗ trợ hợp đồng cho 02 cán bộ nghiên cứu của đơn vị trong 02 năm.

4 Các kết quả khác (nếu có)

Trichoderma phòng trị rất có hiệu quả bệnh thối rễ và thối nõn trên khóm tại

tỉnh Hậu Giang Từ đó giúp giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trường và môi sinh doviệc sử dụng thuốc trừ bệnh hóa học lâu dài Việc sử dụng phân hữu cơ kết hợp với

Trichoderma ngoài khả năng phòng trừ bệnh cây cũng đã dần dần giúp nông dân tạo

tập quán sử dụng phân hữu cơ trong canh tác khóm, đồng thời còn giúp cải thiệnđược phẩm chất sản phẩm, cải thiện tính chất đất đai hình thành các vùng canh tácnông nghiệp theo hướng bền vững tại tỉnh nhà

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

Xác nhận của tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài

(Ký tên và đóng dấu)

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được một số kết quả như sau:

- Qua khảo sát và điều tra từ các nông hộ (19) trồng khóm tại Vị Thanh, tỉnh Hậu

Giang, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 10 chủng nấm gây bệnh Fusarium solani, 5 chủng nấm gây bệnh Phytophthora nicotianae (được thử nghiệm qua quy trình Koch)

và 50 chủng nấm đối kháng Trichoderma Qua kết quả thử nghiệm cho thấy hai chủng nấm F solani F-VTa7 (gây bệnh thối rễ) và P nicotianae P-VTa18 (gây bệnh thối

nõn) có thể hiện độc tính cao nhất trên cây khóm con qua quy trình Koch

- Trắc nghiệm hiệu quả đối kháng của 51 chủng Trichoderma đối với các chủng F solani và P nicotianae có độc tính trên đĩa petri (in-vitro) cho thấy, chín (9) chủng Trichoderma T-VTa14c, T-VTa16b, T-VTa18b, T-VTa18c, T-VTa20a, T-

VTa23c, T-VTa24a, T-VTa24c và T-VTa25a có khả năng đối kháng tốt và ổn định

đối với bệnh thối rễ trên khóm do nấm F solani và sáu (6) chủng nấm VTa14c,

T-VTa15a, T-VTa16b, T-VTa17a, T-VTa18b, T-VTa18c có hiệu suất đối kháng cao và

ổn định đối với bệnh thối nõn trên khóm do nấm P nicotianae.

- Trong điều kiện nhà lưới, các chủng Trichoderma BM2a, VTa14c, VTa16b, T-VTa18b, T-VTa18c đều có khả năng đối kháng mạnh với F solani (F- VTa7) và P nicotianae (P-VTa18) gây bệnh trên khóm con so với 2 loại thuốc trừ bệnh hóa học Appencard Super 75 DF (phòng trị Fusarium) và Curzate M-8 72 WP (phòng trị Phytophthora) Trong các chủng này, 2 chủng T-BM2a và T-VTa18b tỏ

T-ra có hiệu quả cao trong việc khống chế bệnh hại

- Dựa vào điều kiện canh tác của nông dân, trong ba mô hình thí nghiệm thựchiện ngoài đồng thực hiện tại thị xã Vị Thanh (tỉnh Hậu Giang) đã cho thấy việc xử lý

các chủng Trichoderma triển vọng riêng lẻ hay phối hợp đều có khả năng khống chế

bệnh thối rễ và thối nõn Kết quả này thể hiện qua khả năng phục hồi phục hồi rễ cao,

cấp bệnh trên lá giảm và mật số của Trichoderma đều tăng so với các nghiệm thức

không xử lý Việc xử lý bệnh trên ruộng khóm với sự phối hợp các chủng

Trichoderma đã giúp kéo dài hiệu quả phòng trị bệnh và giúp cây phát triển tốt.

- Trichoderma đáp ứng tốt với các khoáng N, P, K, Ca và Mg khi được nuôi

cấy trong môi trường PDB Cung cấp đạm ở dạng (NH4)2SO4 (28 mmol), KH2PO4

(4 µmol), CaSO4 (1,25 mmol) và MgSO4 (32 µmol) là tốt nhất cho sự phát triển sợi

nấm và sinh bào tử của chủng Trichoderma T-BM2a

1.1.1 Khả năng tiết enzym và tác dụng đối kháng của Trichoderma

1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động đối

2.1 Sưu tập nấm gây bệnh và nấm đối kháng tại thị xã Vị Thanh, Hậu Giang 112.2 Xác định tác nhân gây bệnh thối rễ và thối nõn qua quy trình Koch 12

2.3 Trắc nghiệm hiệu quả đối kháng của Trichoderma đối với Fusarium

solani và Phytophthora nicotianae đã phân lập được 12

2.4 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma đối với Fusarium

solani và Phytopthora nicotianae trong điều kiện nhà lưới 13

2.5 Mô hình đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma triển

vọng đối với bệnh thối rễ (do Fusarium solani) và thối nõn (do

Phytophthora nicotianae) trên ruộng trồng khóm

14

2.6 Nghiên cứu tác động của các dinh dưỡng khoáng N, P, K, Ca và Mg

lên sự phát triển và hình thành bào tử của Trichoderma T-BM2a 16

3.2 Khả năng tác gây hại của các tác nhân gây bệnh thối rễ và bệnh

3.3 Hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma dựa trên khả năng ức

chế sự phát triển sợi nấm của các chủng F solani và P nicotianae 213.4 Hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma đối với nấm bệnh F.

solani và P nicotianae trên cây khóm trồng trong điều kiện nhà lưới 25

3.5 Khả năng đối kháng giúp phục hồi rễ và nõn của năm chủng

Trichoderma có triển vọng đối với bệnh thối rễ, thối nõn do F.

solani và P nicotianae trên ruộng trồng khóm 29

3.5.1 Khả năng phục hồi của các ruộng khóm khi xử lý bằng các chủng

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

IPNM Quản lý tổng hợp dịch hại và dinh dưỡng

2.1 Điều tra và khảo sát các ruộng khóm tại xã Hỏa Tiến, thị xã VịThanh, Hậu Giang 17

3.1 Khả năng gây hại của chủng F solani F-VTa7 trên cây khóm con 273.2 Khả năng gây hại của chủng P nicotianae P-VTa18 trên câykhóm con 27

3.3 Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma T-VTa14c đối với

chủng F solani F-VTa7 gây bệnh thối rễ trên khóm 27

3.4 Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma T-VTa18c đối với

chủng P nicotianae P-VTa18 gây bệnh thối nõn trên khóm 28

3.5 Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma T-VTa18b đối với chủng F solani F-VTa7 gây bệnh thối rễ trên khóm trong điều

kiện nhà lưới

28

3.6

Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma T-VTa14c đối với

chủng P nicotianae P-VTa18 gây bệnh thối nõn trên khóm trong

3.7 Xử lý bệnh hại với Trichoderma giúp cây phục hồi và cho năng suất 363.8 Thí nghiệm ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng đến sự sinh trưởngvà phát triển của chủng Trichoderma T-BM2a 36

DANH SÁCH BẢNG

1.1 Hàm lượng và nồng độ của N - P2O5 - K2O bón cho khóm tại Hậu Giang 103.1 Sự hiện diện của các chủng Fusarium solani, Phytophthora

nicotianae và Trichoderma tại huyện trồng khóm trọng điểm

3.2 Lượng phân bón/ha của các hộ điều tra tại xã Hỏa Tiến, huyện Vị

3.3 Chỉ số bệnh (%) trên cây khóm con sau 25, 35 và 45 ngày chủng

3.4 Tỷ lệ cây chết (%) trên cây khóm con sau 45 ngày chủng nấm

3.5 Chỉ số bệnh (%) trên cây khóm con sau 20, 30 và 40 ngày chủng

3.6 Tỷ lệ chết (%) trên cây khóm con sau 40 ngày chủng nấm gây

bệnh Phytophthora nicotianae (Đại học Cần Thơ, 2006) 213.7 Hiệu suất đối kháng (%) của các chủng Trichoderma thu thập tại Vị

Thanh (Hậu Giang) đối với hai chủng Fusarium solani gây bệnh trên

thối rễ khóm ở 3 ngày sau khi nuôi cấy trên môi trường PDA 223.8 Hiệu suất đối kháng (%) của các chủng Trichoderma thu thập tại

Vị Thanh (Hậu Giang) đối với ba chủng nấm Phytopthora

nicotianae gây bệnh trên khóm ở 3 ngày sau khi nuôi cấy trên môi

3.9 Chỉ số bệnh (%) thối rễ trên cây khóm sau 15, 30 và 45 ngày sau

khi chủng Trichoderma (tương đương 40, 55 và 70 ngày sau khi

3.10 Chỉ số bệnh (%) thối nõn trên cây khóm sau 15, 30 và 45 ngày sau

khi chủng Trichoderma (tương đương 40, 55 và 70 ngày sau khi

chủng nấm bệnh P nicotianae) (Đại học Cần Thơ, 2006) 263.11 Chỉ số bệnh (%) trên lá và thân khóm do F solani và P nicotinae

ở các ruộng khóm sau khi xử lý với các chủng Trichoderma (Hậu

3.14 Tác động của N trên sinh khối khô (g/lít) của chủng Trichoderma

3.15 Tác động của N đến mật số bào tử (logarit) của chủng

Trichoderma T-BM2a trong môi trường PDB sau 7 ngày nuôi cấy 333.16 Tác động của P, K, Ca và Mg đến sinh khối khô (g/lít) của chủng

Trichoderma T-BM2a trong môi trường PDB sau 7 ngày nuôi cấy 343.17 Tác động của P, K, Ca và Mg mật số bào tử (logarit) của chủng

Trichoderma T-BM2a trong môi trường PDB sau 7 ngày nuôi cấy 343.18 Nồng độ N, P2O5, K2O được tính từ thí nghiệm dinh dưỡng khoáng 35

MỞ ĐẦU

Khóm (Ananas comosus L Merr.) là một trong những loại trái cây hàng đầu

được nhiều người ưa chuộng, được sử dụng để ăn tươi hoặc chế biến đóng hộp, làmthức uống (Vũ Công Hậu, 2000) Nhờ khả năng chịu được đất phèn, khóm thườngđược tận dụng trồng trên những vùng phèn của đồng bằng sông Cửu Long(ĐBSCL) (Nguyễn Bảo Vệ và Lê Thanh Phong, 2004)

Hiện nay, ĐBSCL có khoảng 19.000 ha khóm nguyên liệu, trong đó tập trungchủ yếu ở Tiền Giang, Hậu Giang, Kiên Giang Giống khóm trồng chủ yếu thuộcnhóm Queen, cho năng suất bình quân 15,2 tấn/ha (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải,1996) Nhóm này chiếm ưu thế nhờ ít chua, màu sắc đẹp và tiêu thụ khóm tươi tốt.Tuy nhiên, trong nhiều năm qua khóm của ĐBSCL vẫn còn chủ yếu bán cho thươnglái với giá cả không ổn định, thiếu sự bao tiêu sản phẩm làm nông dân ngại đầu tư.Trong tự nhiên, việc canh tác khóm thường gặp những tổn hại do nấm bệnh gây

ra như: Fusarium spp (gây bệnh thối rễ), Phytophthora parasitica (gây bệnh thối đọt)

… Bệnh càng nặng vào các tháng mưa nhiều và nóng ẩm cao (Nguyễn Bảo Vệ và LêThanh Phong, 2004) Theo Hidalgo và ctv (1999), giữa các tác nhân quan trọng làmgiảm năng suất khóm, tác nhân gây bệnh quan trọng nhất gây thối trái và chết cây ở

Brazil (1962) là nấm bệnh Fusarium subglutinans.

Các nghiên cứu ngoài nước (Hoitink và Boehm, 1999; May-Louise và Kimati, 2000;

Etebarian và ctv., 2000) cũng cho thấy việc sử dụng Trichoderma làm nấm thiên địch để khống chế nấm bệnh Phytophthora có hiệu quả Những nghiên cứu khác cho rằng các dòngTrichoderma trong tự nhiên có thể phòng trị nhiều loại nấm trong đất (Sheela và ctv., 1995; Hoynes và ctv., 1999) Ngoài hoạt động khống chế sự phát triển và sự hình thành bào tử, loài T harzianum còn có khả năng kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn của cây

trồng (Ahmed và ctv., 1999; Sharon và ctv., 2001; CABI, 2004)

Gần đây, xu thế áp dụng các biện pháp sinh học để giúp cây trồng khỏe, đềkháng với nguồn bệnh trong đất đang được quan tâm Trong đó, việc sử dụng

Trichoderma đang được nghiên cứu ở nhiều nơi nhờ chúng có khả năng sinh trưởng

nhanh tại vùng rễ cây, tạo ra nhiều cơ chế tấn công các loài nấm gây hại, giúp cây

phát triển tốt Nấm Trichoderma vừa ký sinh nấm gây hại, tạo kháng sinh, còn giúp

cây tăng tính chống chịu nhờ tăng hệ thống rễ, làm hòa tan các chất khoáng và làm

bất hoạt các enzym của các loại nấm ký sinh Việc sử dụng Trichoderma còn giúp

giảm lượng phân đạm bón cho cây (40% ở bắp) (Harman, 2005)

Trên cơ sở đó, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu phòng trị bệnh thối rễ

(Fusarium) và thối nõn (Phytophthora) trên cây khóm bằng biện pháp sử dụng nấm

đối kháng Trichoderma và phòng trừ tổng hợp (IPNM) tại tỉnh Hậu Giang để cải

thiện năng suất và phẩm chất của trái khóm ngày càng cao hơn

CHƯƠNG 1LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Nấm Trichoderma

Trichoderma thuộc ngành Mycota, lớp nấm Bất Toàn (Deuteromycetes), bộ nấm

Bông (Moniliales), họ Dermatiaceae và chi Trichoderma (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 1982; Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998; Phạm Văn Kim, 2003a).

Gams và Bissett (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma với hình dạng, kích

thước và màu sắc khác nhau Một số loài được ứng dụng phổ biến trong phòng trừ sinh

học như Trichoderma harzianum Rifai, T hamatum Bain, T atroviride Bissett, T viride Pers, T reeseii Simmons và T koningii Ouden.

Trichoderma xuất hiện phổ biến trong đất tự nhiên, đất nông nghiệp và trong các

vật liệu hữu cơ như gỗ mục… (Wells, 1993; Harman, 2000) Đặc trưng của

Trichoderma là sống hoại sinh, đồng thời nó cũng có khả năng sống ký sinh trên các

loài nấm gây bệnh cho cây trồng (Cook và Baker, 1989)

1.1.1 Khả năng tiết enzym và tác dụng đối kháng của Trichoderma trong việc phòng trừ sinh học bệnh hại cây trồng

Yếu tố quan trọng giúp Trichoderma đối kháng tốt với nhiều loài vi sinh vật gây

bệnh hại cây trồng là khả năng tiết ra nhiều chất (Gayal và Khandeparkar, 1998) Khi phát

triển trên vùng tế bào ký chủ, Trichoderma sẽ tiết ra các exo-enzym như

β-1,3-glucanaz, chitinaz, lypaz, proteaz, trong đó hai enzym β-1,3-glucanaz và chitinaz

giữ vai trò quan trọng trong khả năng ký sinh của Trichoderma với nấm bệnh (Cruz

và ctv., 1995a, 1995b; Margolles-Clark và ctv., 1995) Sự kết hợp của hai loại

enzym 1,3-β-glucosidaz và endo-chitinaz không những ức chế sự tăng trưởng mà

còn ngăn cản sự nẩy mầm của bào tử nấm bệnh so với tác dụng riêng lẻ của từngloại enzym (Margolles-Clark và ctv., 1995)

Tác động gây chết nấm bệnh của T viride là nhờ khả năng tiết kháng sinh

(antibiotics) “gliotoxin” (Grondona và ctv., 1997) Chất viridin do T viride sinh ra có

khả năng làm ức chế sự sinh trưởng của một số loài nấm Colletotrichum lini, Fusarium

coeruleum và F culmorum (Nguyễn Lân Dũng, 1983).

Khi được nuôi cấy trên môi trường có chitin, một số dòng của T harzianum đã

tiết ra ít nhất 6 loại enzym thuộc nhóm chitinaz Chitinaz do T harzianum tiết ra có khả năng chống lại nấm Venturia inaequalis gây bệnh trên cây táo (Dasgupta, 1994; Bolar

và ctv., 1999) Enzym này cũng ảnh hưởng mạnh mẽ quá trình mọc mầm của bào tử nấm bệnh Botrytis cinerea (Elad, 2000).

Inglis và Kawchuk (2002) cho biết endo-chitinaz do T harzianum tiết ra giúp cây thuốc lá và cây cà chua chống chịu được các loài nấm bệnh thuộc lớp

Ascomycetes như Alternaria alternata, A solani, Botrytis cinerea và nấm Rhizoctonia solani (lớp Basidiomycetes).

Các enzym thủy phân celluloz do Trichoderma tiết ra cũng có vai trò quan trọng trong việc làm mềm vách tế bào của nấm gây bệnh Các loài T reesei, T.

lignorum và T koningi tiết ra khá nhiều enzym cellulaz giúp phân hủy hoàn toàn tế

bào chứa celluloz (Nguyễn Lân Dũng, 1983; Gayal và Khandeparkar, 1998).

Theo Kredics và ctv (2003), Trichoderma cũng có thể đối kháng với vi

khuẩn nhờ hoạt động của những enzym như proteaz, NAGaz và muramidaz giúp

phân hủy tế bào vi khuẩn Chất kháng sinh “gliotoxin” do T viride sinh ra có thể

ức chế sự phát triển của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus

viridans… (Nguyễn Lân Dũng, 1983).

Trichoderma định cư ở vùng rễ, ngoài việc biến đổi các chất vô cơ, tăng cường

khả năng sản xuất hormon cây trồng còn làm gia tăng khả năng đối kháng của cây

chủ đối với mầm bệnh (Yedidia và ctv., 1999) Bên cạnh việc tiết enzym, tốc độ phát triển và sinh khối do Trichoderma tạo ra cũng có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình đối kháng với nấm gây bệnh hại cây trồng (Mehrotra, 2000).

Khả năng đối kháng với các mầm bệnh cây của Trichoderma có thể xảy ra

theo nhiều cơ chế, trong đó ba cơ chế được ứng dụng phổ biến trong phòng trừ sinhhọc bao gồm: (a) Ký sinh lên nấm bệnh, (b) Tiết kháng sinh tiêu diệt nấm bệnh(antibiosis) và (c) Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống (Harman, 1996)

Trichoderma có thể tấn công trực tiếp lên nấm bệnh bằng cách cuộn quanh

khuẩn ty nấm bệnh và tiết enzym phân hủy chitin của vách tế bào nấm bệnh thànhnhững phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Klein và

Eveleigh, 1998; Dương Minh và ctv., 2001; Kredics và ctv., 2003).

Okigbo và Ikediugwu (2000) ghi nhận rằng những loài Trichoderma có hệ

khuẩn ty nhỏ, mảnh cũng là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh họcchống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý những bệnh hại sau thu hoạch

Trong các loài Trichoderma thì T harzianum là loài có khả năng ký sinh mạnh trên nhiều nấm bệnh như Fusarium oxysporum, Macrophomiana phazolina, Alternaria

alternata, A solani, Botrytis cinerea, Fusarium spp., Sclerotium rolfsii, S homoeocarpa, Pythium spp., P aphanidermatum, Crinipellis perniciosa… (Hadar và

ctv., 1984; Tronsmo, 1991; Harman, 1996; Agrios, 1997; Inglis và Kawchuk, 2002;

Marco và ctv., 2002; Muhammad và Amusa, 2003).

Ở rễ cây con dưa leo, chủng T harzianum đã giúp tạo kích kháng nhờ tăng

hoạt động của peroxidaz và chitinaz trong cây (Yedidia và ctv., 1999) Mehrotra

(2000), chất kháng sinh do T viride tiết ra có khả năng đối kháng hiệu quả với nấm Armillaria mellea gây bệnh trên cam quít và làm giảm bệnh trên cây ăn

trái do nấm Crinipellis perniciosa gây ra Nếu xử lý trái cam quít với T viride

sẽ làm giảm bệnh thối mốc xanh do nấm Penicillium digitatum gây ra một cách

có ý nghĩa (Agrios, 1997) T viride (Pers.) cũng ngăn chặn được các bệnh thối

rễ gây hại trên khoai mỡ (Okigbo và Ikediugwu, 2000).

1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động đối kháng của Trichoderma

Các yếu tố môi trường như pH, dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm (Green, 1996)hay thuốc trừ sâu, kim loại nặng, vi khuẩn đối kháng, hàm lượng O2 và CO2

(Kredics và ctv., 2003) có tác động mạnh mẽ đến hiệu quả phòng trừ nấm bệnh trên

cây trồng của Trichoderma Ngoài ra, khả năng sản xuất enzym của nấm cũng chịu

ảnh hưởng của độ yếm khí cũng như hàm lượng oxy hòa tan, tốc độ lắc… (Marco

và ctv., 2002)

Ảnh hưởng của pH môi trường

Vì pH có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của Trichoderma nên giá trị pH cho thấy hiệu quả tác động đối kháng của Trichoderma (Wells, 1993).

Zaldívar và Velásquez (2001) khẳng định pH có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và

khả năng ký sinh của Trichoderma lên nấm gây hại, do đó ảnh hưởng lên hiệu quả của việc ứng dụng Trichoderma trong việc phòng trừ sinh học bệnh cây.

Theo Srinivas và Panda (1998), pH thích hợp cho sự phát triển của Trichoderma

thay đổi theo từng chủng nấm pH tối ưu cho sự phát triển của nấm thường trong

khoảng 4,0 – 6,5 và chỉ có vài loài Trichoderma spp có thể chịu đựng được khi sống

trong môi trường có pH < 3,0 (Kubicek và Pranz, 1998)

Sự tăng sinh khối của các chủng Trichoderma ở pH tối hảo có ý nghĩa trong quá trình đối kháng Khi pH = 5 sẽ thích hợp cho Trichoderma tiết enzym β-

glucosidaz, cellobiohydrolaz và β-1,4-N-acetyl-glucosaminidaz (NAGaz); ở pH = 3 thích hợp cho Trichoderma tiết β-xylosidaz; pH = 6 tiết trypsin, nếu pH = 6 – 7 sẽ thích hợp cho việc tiết ra những enzym phân hủy protein (Kredics và ctv., 2003) Đối với loài T harzianum và T hamatum, khi ký sinh lên nấm bệnh Rhizoctonia

solani và Sclerotium rolfsii nấm sẽ tiết ra enzym β-1,3-glucanaz ở pH = 4,5 và chitinaz ở pH = 5,3 (Chet và Baker, 1980)

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lên sự mọc mầm của bào tử, sự phát triển của tơ nấm, khả

năng phân hủy và cạnh tranh, sự sản sinh và chuyển hóa các hợp chất… của

Trichoderma (Kredics và ctv., 2003).

Nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển của hầu hết các loài Trichoderma spp là

25 – 30oC, dù chúng cũng có thể thích nghi ở những vùng có nhiệt độ cao hơnhay thấp hơn (Klein và Eveleigh, 1998; McCray, 2002)

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy những loài Trichoderma có nguồn gốc nhiệt đới (như T citrinoviride) sẽ có khoảng nhiệt độ tối hảo cao hơn những loài có nguồn gốc

ôn đới (như T polysporum và T viride) (Tronsmo và Dennis, 1978).

Khả năng chịu đựng nhiệt độ cũng là một yếu tố cần quan tâm, một số loài

như T aureoviride, T harzianum, T viride vẫn sống và phát triển tốt ở nhiệt độ thấp

đến 5oC (Kredics và ctv., 2003) Khả năng chịu lạnh của T hamatum có thể giúp làm giảm bệnh do nấm Botrytis cineria và Sclerotium scleortiorum trong thời gian

dài khi tồn trữ cà rốt

Ảnh hưởng của nguồn carbon

Trichoderma có khả năng phân hủy nhiều loại polysaccharid (như celluloz,

hemicelluloz) và các polymer (như chitin) có liên quan Theo Manczinger và Polner

(1985), những nguồn carbon được Trichoderma sử dụng gồm: glucoz,

galactoz, fructoz, mannoz, cellobioz, trehaloz, xyloz, L-arabinoz, mannitol, D-arabitol, glycerol, salicin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetate, β-methyl-D-glucosid và N-acetyl-β-D-glucosamin (chitin), trong đó nguồn carbon tốtnhất cho nấm phát triển là glucoz, fructoz, mannoz, galactoz, xyloz, trehaloz vàcellobioz (Danielson và Davey, 1973) Tuy nhiên, việc sử dụng các nguồn carbon

D-như inulin, pectin, lactoz, sucroz, maltoz… cũng thay đổi tùy theo loài (Manczinger

và Polner, 1985)

Việc tiết chitinaz của Trichoderma có thể tăng cao khi chitin được sử dụng như

là nguồn carbon (Zaldívar và Velásquez, 2001) nhưng lại bị giới hạn bởi glucoz (Margolles-Clark và ctv., 1995) Lượng enzym sản sinh tùy thuộc vào nồng độ chitin Nghiên cứu của El-Katatny và ctv (2000) cho thấy enzym sản sinh ra nhiều nhất khi

T harzianum được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 1,3% chitin Khi bổ sung

0,5% chitin vào môi trường nuôi cấy thì khả năng tiết chitinaz và β-1,3-glucanaz của

Trichoderma cũng tăng lên từ 2 – 5 lần (El-Katatny và ctv., 2003)

Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Nitrat là nguồn đạm chủ yếu cho nấm phát triển, các amino acid có nguồn đạm

tốt nhất cho Trichoderma là alanin, acid aspartic và acid glutamic (Jackson và ctv., 1991) Theo Cook và Baker (1989), loài T harzianum có khả năng tồn tại được trong đất kém dinh dưỡng ít nhất là 130 ngày, nhưng nó lại phát triển yếu khi sống trong tầng rễ của cây họ đậu.

Ẩm độ đất cũng có liên quan đến khả năng mọc mầm của bào tử Trichoderma và

sự phát triển của ống mầm, đồng thời ảnh hưởng đến khả năng tiết và hoạt động của các enzym như β-glucosidaz, cellobiohydrolaz… (Kredics và ctv., 2003)

Ngoài ra, O2 và CO2 cũng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma là nấm hiếu khí dù chúng vẫn sống được trong môi trường có

hàm lượng oxy rất thấp Nguồn oxy cung cấp và hoạt động của ty thể là những yếu

tố giúp điều hòa hoạt động của cellulaz trên T viride (Kubicek và Pranz, 1998).

Bên cạnh đó, nồng độ CO2 cũng có tác động lên sự phát triển của Trichoderma

trong phòng thí nghiệm và hình thái của chúng ở trong đất Theo ghi nhận của

Domsch và ctv (1980) thì sự phát triển của hai loài T harzianum và T koningii bị

ức chế mạnh khi có sự hiện diện của ion HCO3-; loài T polysporum cũng sinh

trưởng chậm trên môi trường có chứa HCO3- và NaCl 5%

1.2 Nấm Phytophthora

1.2.1 Sự phân bố của Phytophthora

Phytophthora thuộc giới Chromista, ngành Oomycota, lớp Oomycetes, bộ

Phythiales, họ Phythiaceae, chi Phytophthora (CABI, 2004).

Vòng đời của Phytophthora bao gồm 3 loại hình bào tử sinh sản vô tính là bọc

bào tử (sporangium), động bào tử (zoospore) và bào tử áo (chlamydospore) Thêmvào đó, nó còn có noãn bào tử (oospore) là dạng bào tử sinh sản hữu tính Nhiều sợinấm lưỡng bội có thể sản sinh ra bọc bào tử vô tính Các bọc bào tử này có thể nẩymầm trực tiếp hoặc có thể sản sinh ra từ 8 – 32 bào tử động, các động bào tử này có thể

phân bố rải rác hoặc tập trung trong bào nang trước khi nẩy mầm Một vài loài như P.

cinamoni sinh ra nhiều bào tử áo vô tính từ sợi nấm Để sinh sản hữu tính thì nấm cần

tạo ra được noãn bào tử Tất cả các loại bào tử này đều có tiềm năng gây bệnh, riêng

bào tử áo và bào tử noãn còn có chức năng ngủ nghỉ (tiệm sinh) cho loài Tất cả các

loài Phytophthora đều có giai đoạn lưu tồn trong đất (Drenth và Guest, 2004).

Drenth và Guest (2004) cho biết hiện có trên 60 loài Phytophthora đã được mô

tả và tất cả các loài đó đều gây bệnh cho cây trồng Phytophthora rất đa dạng về hình

thái, chúng có khả năng lưu tồn lâu trong đất khi gặp điều kiện bất lợi nên việc phòng

trị rất khó khăn Phytophthora là một trong những nấm bệnh quan trọng trên thế giới,

gây nhiều trở ngại cho sự phát triển của ngành trồng trọt (O’Gara và ctv., 2004)

Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến sự phân bố của Phytophthora Nhiệt độ

ảnh hưởng lên sự nẩy mầm của bào tử, phát triển của sợi nấm và sự hình thành các

dạng bào tử Các loài của Phytophthora có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, chẳng hạn loài P nicotianae có nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển từ 27 – 32oC và tối

đa là 37oC, loài P citrophthora có nhiệt độ tối hảo 24 - 28oC và tối đa 32 – 33oC; loài

P cactorum có nhiệt độ tối hảo là 25oC và tối đa là 31oC (Erwin và Ribeiro, 1996)

1.2.2 Đặc điểm gây hại của Phytophthora

Phytophthora là loại nấm đa ký chủ, gây hại trên nhiều loại cây trồng như: ca

cao, sầu riêng, cam quít… và cả trên các loại rau và hoa kiểng (CABI, 2004; NguyễnThân, 2004; Drenth và Guest, 2004)

Theo Vũ Công Hậu (2000), Phytophthoralà loại nấm nguy hiểm đối với cây khóm, có thể gây hại cho nhiều bộ phận của cây Loại gây thối nõn thường là P.

nicotianae hoặc P cinamoni làm lá nõn chuyển sang màu vàng tối, xám rồi héo, nắm

ngọn lá có thể kéo cả túm lá lên và thấy chân lá thối đen Cây khóm bị bệnh ở mọilứa tuổi, nhưng thường bị hại nhất ở cây con vừa trồng, nhất là trên các chồi ngọn Ởnhiệt độ 20 – 25oC trên vùng cao thì P cinamoni gây hại chủ yếu, còn ở nhiệt độ 30oC

ở các vùng thấp hoặc tại các xứ nhiệt đới thì P nicotianae là đối tượng chính.

Phytophthora tồn tại trên ruộng dưới dạng bào tử áo (chlamydospore), nhưng

chúng xâm nhiễm không đáng kể vào cây trồng mà nguồn lây lan chủ yếu là do độngbào tử (zoospore) (CABI, 2004; Ngô Vĩnh Viễn và ctv., 2003)

Trên cây khóm, bệnh thối nõn do 3 loài Phytophthora chính gây ra:

Phytophthora nicotianae, Phytophthora cinamoni và Phytophthora palmivora,

gây bệnh đơn lẻ hoặc kết hợp (Ngô Vĩnh Viễn và ctv., 2003) Qua kết quảnghiên cứu ở một số tỉnh trồng khóm ở phía Bắc và Nam Việt Nam, Ngô VĩnhViễn và ctv (2003) đã kết luận rằng tác nhân chủ yếu gây bệnh thối nõn khóm là

do Phytophthora gây ra Ở các tỉnh phía Bắc, nấm P nicotianae gây hại là phổ biến, P cinamoni ít phổ biến hơn Tác giả cũng cho biết ở những đất có pH cao,

bệnh phát triển nặng hơn so với đất chua phèn (pH thấp), cụ thể là ở những vùngđất tại Đồng Giao (Ninh Bình) với pH đất từ 5,7 – 7,9 có tỷ lệ cây bị thối nõn từ5,2 – 68,4% Ở nước ta, nhiều địa phương trồng khóm bị thối nõn do

Phytophthora lên tới 60% sau ba tháng trồng, đặc biệt với giống Cayenne (Ngô

Vĩnh Viễn và ctv., 2003; Dang Vu Thi Thanh và ctv., 2004)

Sự phát tán và xâm nhiễm của bọc bào tử (sporangium) và động bào tử

(zoospore) ở P nicotianae lên thân cây cần được tiếp xúc với nước ít nhất là 5

giờ (khi gặp mưa lớn hoặc ngập lũ) Khi các bào tử bám được vào cây, nếu cóđiều kiện thuận lợi chúng sẽ xâm nhập vào mô bên trong, sinh sản vô tínhtrong 40 – 72 giờ, tạo ra các bọc bào tử và động bào tử để tiếp tục thực hiệnchu trình mới, tạo sự phát triển của dịch bệnh (CABI, 2004)

1.3 Nấm Fusarium

1.3.1 Sự phân bố của Fusarium

Fusarium thuộc ngành Mycota, lớp nấm Bất Toàn (Deuteromycetes), bộ nấm

Bông (Moniliales), họ Tuberculariaceae, chi Fusarium (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998; Phạm Văn Kim, 2003a)

Fusarium có bào tử dạng hình liềm, có vách ngăn (thường được gọi là đại bào

tử) Hình dạng của bào tử là một chỉ tiêu quan trọng giúp phân biệt các loài

Fusarium (Burgess và ctv.,1994; Seifert, 1996) Theo Agrios (1997), ba dạng bào tử

của F solani thường hiện diện là tiểu bào tử (microconidium), đại bào tử (macroconidium) và bào tử áo (chlamydospore) Tiểu bào tử có kích thước trung bình là 18,1 x 4,0 µm, đại bào tử có 3 – 5 vách ngăn, kích thước trung bình 29,4 x 3,9 µm (Barreto và ctv., 2003) Bào tử áo là những bào tử có vách dày.

1.3.2 Đặc điểm gây hại của Fusarium

Fusarium là loại nấm hiện diện khắp nơi trên thế giới, gây bệnh quan trọng

trên nhiều loại cây trồng như các loại cây họ đậu, họ cam quít, khoai tây, cà chua…

(Booth, 1971; Marasas và ctv., 1984) Các loài Fusarium lan truyền chủ yếu nhờ

nước (nước mưa, nước tưới), gió, không khí, cây giống nhiễm bệnh, tàn dư câybệnh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Fusarium gây hại ở tất cả thời kỳ sinh trưởng của cây, chủ yếu là thời kỳ cây

con (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) Nấm hiện diện trong đất dưới dạng bào

tử, lan truyền dễ dàng nhờ vào nước, xác bả hữu cơ, gió, gia súc và dụng cụ tiếp xúc

(Agrios, 1997) Fusarium phát triển mạnh khi nhiệt độ trên 25oC và điều kiện ẩm

ướt (Marasas và ctv., 1984) Những triệu chứng bệnh do Fusarium chủ yếu xuất

hiện ở rễ, cổ rễ và gốc thân (Đường Hồng Dật, 1977)

Trên cây khóm, bệnh do Fusarium xảy ra ở tất cả các bộ phận của cây nhưng dễ

nhiễm nhất ở trái và chồi non (Calderson và ctv., 1993) Bộ rễ khóm bị xâm nhiễmảnh hưởng đến toàn bộ cây khóm, làm cây còi cọc, chậm sinh trưởng và phát dục, lábệnh bị vàng, chuyển dần qua màu đỏ nhạt và bị khô đầu lá (Py và ctv., 1984)

Py và ctv (1984) cũng cho biết những vùng trồng khóm lớn như Hawaii, Úc,

Nam Phi… thì bệnh do nấm F moniliforme var subglutinans gây hại trên tất cả các

giai đoạn sinh trưởng của cây, nhất là ở cây khóm con với triệu chứng như sau:

- Trên cây con và trưởng thành: Bệnh biểu hiện ở cuống lá, nơi gắn vào thân.Nấm bệnh tấn công gây hư hại một bên thân hoặc từng phần trên thân, lâu dần làmchiều dài thân bị ngắn lại Các lá ở trung tâm có dạng dựng đứng, vùng mô phân sinh

bị chết làm cho sự sắp xếp của lá bị rối loạn Khi nhổ những lá ở vùng tổn hại sẽ thấy

có tích tụ nhựa ở vùng gốc, cắt dọc theo thân rễ sẽ thấy những vùng thối đen lan tràn

từ dưới lên, có mùi đặc trưng

- Trên ngọn thân: Bệnh gây ra những vết hoại tử nâu, rỉ nhựa Nếu nghiêmtrọng, cả phần dưới ngọn tràn lan nhựa và làm chết ngọn sau đó

- Trên trái: Sự tấn công của nấm bắt đầu từ một mắt khóm, sau đó lan ra nhiềumắt, sâu vào thịt trái rồi làm hư cả trái Ở các mắt bệnh bị rỉ nhựa, vết bệnh màu nâuđen, phần thịt trái hư hỏng bị nhũn ra

Theo Py và ctv (1984), F moniliforme var subglutinans phát triển tốt ở 25

-30oC Nấm thích nghi trên các nền đất khác nhau và có thể chịu được pH = 2 – 3.Loài nấm này ký sinh trên nhiều cây trồng như lúa miến, bắp, mía, xoài… nhưng ởmỗi loại cây là một nòi riêng biệt, tương ứng với vùng địa lý được phân lập

Trong quá trình ký sinh, Fusarium tiết ra các độc tố khác nhau như: Fusarinic,

Fumosin B1, Fumosin B2 làm kiềm hãm các hoạt động enzym của tế bào ký chủ, phá

vỡ quá trình trao đổi chất, hô hấp, đồng thời làm giảm khả năng đề kháng của cây trồng(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) Độc tố Fusaric acid đã gây bệnh héo rũ ở càchua, bông vải và nhiều loại cây trồng khác (Mehrotra, 2000)

Fusarium phân hủy được lignin nhờ enzym ligninaz do nấm tiết ra giúp phân cắt

lignin thành các phân tử ngắn, làm cho phần gỗ của cây bị phân hủy (Phạm Văn Kim,

2000) Fusarium còn tiết ra các enzym phân hủy celluloz, đồng thời tạo ra các phân tử

làm bít kín mạch nhựa của cây (Bilgrami và Verma, 1978)

1.4 Dinh dưỡng cây khóm

Khóm là cây phát triển lượng sinh khối lớn nên yêu cầu rất nhiều dinh dưỡng.Trung bình trên 1 ha đất trồng, khóm lấy từ đất 83 kg N (thân lá 74 kg, quả 9 kg) + 28

kg P2O5 (thân lá 23 kg, quả 5 kg) + 437 kg K2O (thân lá là 402 kg, quả 35 kg) Nhu cầu

về canxi và lân cũng không cao nhưng lại cần nhiều kali Một số nguyên tố vi lượngkhác cũng quan trọng đối với khóm như sắt, kẽm, mangan, đồng, magie… (NguyễnMạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2006) Theo Dierolf và ctv (2001) (trích từ LêVăn Bé, 2005), khi bón 180 kg N + 22 kg P2O5 + 280 kg K2O + 72 kg Ca + 24 kg Mg+ 20 kg S/ha cho khóm thì năng suất trái có thể lên đến 50 tấn/ha

Các chất dinh dưỡng lấy đi trên ruộng gồm trái và chồi ngọn, chồi giâm, chồi

rễ và các các dư thừa khác được thu hoạch Do đó, một lượng lớn các chất dinhdưỡng lấy đi có liên quan đến năng suất trái và các dư thừa Hàm lượng khoáng chất(%) có trong trái được ghi nhận là 0,075 – 0,08 N, 0,015 P2O5, 0,2 – 0,26 K2O,0,015 – 0,02 CaO và 0,13 – 0,18 MgO tính theo trọng lượng tươi (Py và ctv., 1987)

Do đó, lượng dưỡng chất thiết yếu được lấy đi khỏi ruộng từ trái và các dư thừađược xem là đáng kể (Malézieux và Bartholomew, 2003)

Để cung cấp dinh dưỡng cho khóm, 80% nông dân ở Hậu Giang sử dụng côngthức phân là 3,75 g N + 0 g P2O5 + 0 g K2O/cây, trong khi nông dân Kiên Giang sửdụng 3,25 g N + 0 g P2O5 + 0 g K2O/cây và hơn 50% nông dân Tiền Giang sử dụngcông thức phân: 3,6 g N + 1,8 g P2O5 +1,2 g K2O/cây Như vậy, nông dân chủ yếubón phân N, bỏ qua các yếu tố dinh dưỡng khác nên làm giảm phẩm chất của trái(Lê Văn Bé, 2005)

Võ Thị Gương và ctv (1997) khi nghiên cứu ảnh hưởng của lân, vôi và kaliđến năng suất khóm trồng trên vùng đất phèn ở ĐBSCL nhận thấy năng suất giống

Queen đạt 35,5 tấn/ha khi bón phân với công thức 10 g N + 5 g P2O5 + 12 g

K2O/cây và để đạt 44,7 tấn/ha thì cần bón 10 g N + 7 g P2O5 + 12 g K2O/cây

Lê Thanh Phong và ctv (2005) khi nghiên cứu ảnh hưởng của các mức độ phânbón N-P-K lên giống Queen ở ĐBSCL cho rằng ở nghiệm thức không bón N-P-K thìnăng suất trái thu được là 20,3 tấn/ha, còn ở nghiệm thức bón 2 g N + 3 g P2O5 + 2 g

K2O/cây và 8 g N + 6 g P2O5 + 8 g K2O/cây năng suất lần lượt đạt 24,4 và 28 tấn/ha.Thí nghiệm tại xã Hỏa Tiến (Vị Thanh, Hậu Giang) của Lê Thanh Phong vàctv (2005) và Lê Văn Bé (2005) cho thấy, ở công thức phân 10 g N + 7 g P2O5 + 8 g

K2O/cây (tương đương lượng phân 330 kg N + 230 kg P2O5 + 270 kg K2O/ha) chonăng suất khóm giống Queen rất cao (28 tấn/ha) (Bảng 1.1) Như vậy, việc bónphân không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển mà còn ảnh hưởng rấtlớn đến năng suất của cây khóm

Bảng 1.1 Hàm lượng và nồng độ của N - P2O5 - K2O bón cho khóm tại Hậu Giang

(Lê Thanh Phong và ctv., 2005; Lê Văn Bé, 2005)

Phân bón Lượng (g/cây) Nồng độ (mmol/cây)

Như vậy, các thí nghiệm trên các vùng đất khác nhau tại ĐBSCL cho thấy, cáccông thức phân có ảnh hưởng tốt đến năng suất của khóm biến động từ 2 – 10 g N +

3 – 7 g P2O5 + 8 – 12 g K2O/cây

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Sưu tập nấm gây bệnh và nấm đối kháng tại thị xã Vị Thanh, Hậu Giang

Từ các dữ liệu thống kê về phân bố diện tích trồng khóm của sở Nông nghiệp vàPhát triển Nông thôn Hậu Giang và phòng Nông nghiệp thị xã Vị Thanh, nhóm nghiêncứu đã chọn thị xã Vị Thanh là thị xã trọng điểm trồng khóm của tỉnh để điều tra, khảosát (Hình 2.1) tình hình bệnh thối rễ (Hình 2.2, 2.3, 2.4 và 2.5), thối nõn và sưu tập nấm

Trichoderma đối kháng để làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm.

Các ruộng khảo sát được chọn tại xã Hỏa Tiến (các ấp Thạnh Thắng, ThạnhXuân và Thạnh An), thị xã Vị Thanh (trọng điểm trồng khóm) tỉnh Hậu Giang, vớidiện tích mỗi ruộng tối thiểu là 0,3 ha

Công việc khảo sát bao gồm thu thập các mẫu đất từ vùng cây khỏe mạnh (để

trích Trichoderma), mẫu đất và rễ cây bệnh (để thu thập nấm Fusarium), mẫu đất và nõn cây bệnh (để thu thập nấm Phytophthora) Phiếu điều tra được thực hiện với các

chủ ruộng để tìm hiểu, đánh giá tình trạng canh tác và tình hình xuất hiện, mức thiệt hại

do sâu bệnh trên ruộng (nhất là các bệnh tấn công vùng rễ và nõn cây) để đề ra phươngpháp thí nghiệm nhằm xử lý bệnh thối rễ và thối nõn trên các ruộng thí nghiệm

Mẫu bệnh và mẫu đất (để thu thập bào tử Trichoderma) được lấy ở ruộng đã

nhiễm bệnh thối rễ Sau chuyến điều tra, các mẫu bệnh và đất được phân lập để thu

lấy nguồn nấm bệnh và nấm đối kháng Trichoderma trên các môi trường chuyên biệt đã được khuyến cáo: TSM cho Trichoderma (Kubicek và Harman, 1998), SNA

và PDA cho Fusarium (Burgess và ctv., 1994), CMA cho Phytophthora (Drenth và

Sendall, 2001)

Thành phần dinh dưỡng của môi trường TSM (Trichoderma Selective Medium)

gồm: 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,9 g K2HPO4, 0,15 g KCl, 1,0 g NH4NO3, 3 g glucoz, 0,25 gchloramphenicol, 20 g agar, nước cất vừa đủ 1000 ml; pH = 6,5 - 6,8) Thành phầndinh dưỡng của môi trường PDA (Potato Dextroz Agar) gồm: 200 g khoai tây, 20 gdextroz, 20 g agar, nước cất vừa đủ 1000 ml, pH = 6,5) Môi trường tồn trữ SNA(Synthetic Nutrient Agar) gồm: 1,0 g KH2PO4, 1,0 g KNO3, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,2 gKCl, 0,2 g glucoz, 0,2 g sucroz, 20 g agar, nước cất vừa đủ 1000 ml, pH = 6,5) Thànhphần dinh dưỡng của môi trường CMA (Corn Meal Agar) gồm: 60 g bắp xay bể, 20 gagar, nước cất vừa đủ 1.000 ml, pH = 6,5

Fusarium được định danh loài dựa theo khóa phân loại của Booth (1971), Burgess

và ctv (1994) và Gerlach và Nirenberg (1982) Phytophthora được định danh theo khóa phân loại Phytophthora của Drenth và Sendall (2001).

2.2 Xác định tác nhân gây bệnh thối rễ và thối nõn qua quy trình Koch

Các chủng Fusarium và Phytophthora sau khi phân lập và định danh đã được

xác định khả năng gây bệnh trên cây khóm con theo quy trình Koch Thí nghiệmđược bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 lọ thủytinh (v = 500 ml) chứa 5 cây khóm con cấy mô (1,5 tháng tuổi)

Các lọ chứa cây khóm con được cấy các chủng nấm bệnh (thu từ rễ, nõn và đất

của các cây bệnh từ các ruộng đã điều tra) với một khoanh khuẩn lạc nấm F solani hoặc P nicotianae (φ = 5 mm, nuôi cấy 7 – 10 ngày trên môi trường PDA) vào mặtmôi trường của các lọ trồng khóm Phản ứng của các chủng nấm đối với cây khóm

con được ghi nhận qua cấp bệnh trên lá, rễ và thân như sau (Borrás và ctv., 2001):

Cấp 0: Cây bình thường, không bị bệnh, 1: Cây bị bệnh 1 - 2%,

2: Cây bị bệnh 3 - 5%, 3: Cây bị bệnh 6 - 10%, 4: Cây bị bệnh 11 - 20%, 5: Cây bị bệnh 21 - 50%, 6: Cây bị bệnh 51 - 100%.

Tính chỉ số bệnh và tỷ lệ cây chết

- Công thức tính chỉ số bệnh (CSB) dựa theo Townsend – Neuberger (1943)

a: số lượng cây bệnh ở mỗi cấp

b: chỉ số bệnh tương ứng với mỗi cấp

n: tổng số cây quan sát

C: cấp bệnh quy ước cao nhất

- Tỷ lệ cây chết (TLCC (%)) được tính theo công thức:

TLCC (%) = (số cây chết/tổng số cây quan sát) x 100

2.3 Trắc nghiệm khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma đối với Fusarium solani và Phytophthora nicotianae đã phân lập được

Các chủng Trichoderma được thu thập từ xã Hỏa Tiến (thị xã Vị Thanh, Hậu

Giang) được đem thử khả năng đối kháng trên đĩa petri (môi trường PDA) với các

chủng Fusarium và Phytopthora thể hiện độc tính cao nhất (trên các ruộng khảo sát

và qua quy trình Koch) được dùng để đánh giá khả năng đối kháng Chủng

Trichoderma T-BM2a (thu thập tại Bình Minh, Vĩnh Long) là chủng có khả năng

đối kháng mạnh với các chủng F.solani và P palmivora trong các nghiên cứu trước

( )% ( )x100

Cxn axb CSB =∑

nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi Fusarium hoặc Phytopthora và Trichoderma

trong cùng dĩa petri, với khoảng cách tâm điểm hai khoanh khuẩn lạc (φ = 5 mm) là

4 cm Phản ứng của hai chủng nấm này được theo dõi và đo bán kính khuẩn lạc để

đánh giá khả năng đối kháng của từng chủng Trichoderma đối với từng chủng nấm

F solani hoặc P nicotianae.

Hiệu suất đối kháng (A.E: antagonistic efficacy) được ghi nhận ở 3 ngày saukhi chủng, theo công thức của Ahmed và ctv (1999):

Qua kết quả trắc nghiệm khả năng đối kháng trên đĩa petri, các chủng

Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nhiều chủng F solani và P nicotianae

sẽ được tiếp tục khảo sát khả năng khống chế với các chủng nấm gây bệnh thối rễ

(Fusarium) và thối nõn (Phytopthora) trên cây khóm con 3,5 tháng tuổi (trồng từ

cây cấy mô) trong điều kiện nhà lưới Hai loại thuốc trừ bệnh hóa học đặc trị làCurzate M-8 72 WP (sử dụng ở nồng độ 2‰, dùng trị bệnh thối nõn) và AppencardSuper 75 DF (nồng độ 2‰, dùng trị bệnh thối rễ) được sử dụng làm đối chứngdương (+) trong thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trong các chậu nhựa (v = 1.000 ml) chứa 0,5 kgđất, gồm đất vườn (pH = 4,0 – 4,5) + 5% phân chuồng hoai (v/v), thanh trùng hỗnhợp 2 lần (cách nhau 48 giờ ở 121oC trong 25') Các cây khóm con được trồng vàochậu nhựa (5 cây/chậu) và để ổn định trong một tuần Đối với các chủng nấm gây

bệnh thối rễ F solani, tưới huyền phù bào tử nấm vào các chậu với mật số 106 bào

tử/g đất Đối với các chủng nấm gây bệnh P nicotianae, dùng lưỡi lam cạo tạo vết

thương lên thân, nơi tiếp giáp bẹ lá non, sau đó chủng nấm bệnh với mật số 106 bọc

bào tử/cây Khi cây bắt đầu có biểu hiện bệnh, tiến hành chủng Trichoderma (106

bào tử/g đất đối với các nghiệm thức đã chủng nấm bệnh F solani và 106 bào tử/cây

đối với các nghiệm thức đã chủng nấm bệnh P nicotianae).

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại,mỗi lần lặp lại là một chậu trồng 5 cây khóm Các nghiệm thức được bố trí như sau:

Nghiệm thức Chủng Phytophthora Chủng Fusarium Chủng Trichoderma

2.5 Mô hình đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma triển vọng đối với bệnh thối rễ (do Fusarium solani) và thối nõn (do Phytophthora nicotianae) trên ruộng trồng khóm

Thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối rễ (do nấm F solani)

và thối nõn (do nấm P nicotianae) trên cây khóm của các chủng nấm đối kháng

Trichoderma trên các mô hình ở xã Hỏa Tiến, thị xã Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang

Ba thí nghiệm được thực hiện trên các ruộng mô hình (dựa vào điều kiện canhtác của nông dân) với các giống khóm thuộc nhóm Queen (2 thí nghiệm) vàCayenne (1 thí nghiệm) Cấp bệnh ở trên lá và thân của các cây thí nghiệm được

chọn là cấp 3 (lá và thân bị bệnh 6 – 10% theo Borrás và ctv (2001)).

Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại, mỗilặp lại là một lô gồm 50 – 70 cây khóm thí nghiệm Các nghiệm thức được bố trínhư sau:

T1 = Đối chứng (không xử lý) T2 = T-BM2a

T7 = T-mix (phối hợp 5 chủng Trichoderma trên)

 Mô hình 1: Năm chủng Trichoderma sử dụng đơn hoặc phối hợp được pha

với nước phun trên các lô khóm thí nghiệm với lượng 1 g/m2 chế phẩm (mật số 109

bào tử/g, dạng đơn hoặc phối hợp) Mô hình này được thiết lập trên hai ruộng khómthuộc nhóm Queen của các nông dân Phạm Văn Đáng (ấp Thạnh Thắng, xã HỏaTiến, thị xã Vị Thanh; khóm 2 năm tuổi) (kích thước lô là 2,7 m x 3,8 m = 10,26

m2) và Võ Văn Sạn (ấp Thạnh Thắng, xã Hỏa Tiến, thị xã Vị Thanh; khóm 2 nămtuổi) (kích thước lô là 2,5 m x 6,0 m = 15 m2)

 Mô hình 2: Được thực hiện trên ruộng khóm thuộc nhóm Cayenne, cũng bố

trí như mô hình 1 trên ruộng khóm của ông Chiêm Văn Đởm (ấp Thạnh Thắng, xãHỏa Tiến, thị xã Vị Thanh, khóm 4 năm tuổi) (kích thước lô 4,0 m x 4,5 m = 18 m2).Các lô thí nghiệm được xử lý rệp sáp với chế phẩm sinh học Ometar (của viện

Nghiên cứu Lúa Ô Môn) chứa bào tử nấm Metarhizium anisopliae (1,6 x 109 bàotử/g) với nồng độ 12,5 g/lít, phun ướt đều lên vùng quanh gốc khóm trước khi xử lý

Trichoderma.

Tưới nước cho cây 1 lần/tuần trong mùa nắng

∗ Các chỉ tiêu ghi nhận

- Cấp bệnh ở lá và thân được đánh giá trên 20 cây khóm/lô (lấy ở 5 điểm, mỗi

điểm 4 cây) theo Borrás và ctv (2001):

Cấp 0: Cây bình thường, không bị bệnh, 1: Cây bị bệnh 1 - 2%,

2: Cây bị bệnh 3 - 5%, 3: Cây bị bệnh 6 - 10%, 4: Cây bị bệnh 11 - 20%, 5: Cây bị bệnh 21 - 50%, 6: Cây bị bệnh 51 - 100%

b a

n: tổng số cây quan sát;

C: cấp bệnh quy ước cao nhất

- pH và mật số Trichoderma tồn tại ở vùng rễ phục hồi của cây bệnh cũng được

ghi nhận qua số khuẩn lạc hiện diện CFU/g đất khô (CFU: colony forming unit)

2.6 Nghiên cứu tác động của các dinh dưỡng khoáng N, P, K, Ca và Mg lên sự

phát triển và hình thành bào tử của Trichoderma T-BM2a

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm trên môi trườngPDB (lỏng) nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của các loại khoáng N, P, K, Ca và

Mg lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng Trichoderma T-BM2a, là chủng nấm

có sinh khối và sản sinh bào tử thấp nhất Kết quả đạt được sẽ ứng dụng nhằm bổ

sung dinh dưỡng khoáng giúp tăng hiệu quả của Trichoderma trong quản lý bệnh

hại cây trồng

Chủng T-BM2a được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 7 - 10 ngày để thu

thập bào tử Sau đó, chủng 1 ml huyền phù bào tử Trichoderma (chứa 2 x 107 bàotử/ml) vào bình tam giác chứa 200 ml môi trường lỏng PDB (Potato dextroz broth:

200 g khoai tây, 20 g dextroz, nước cất vừa đủ 1.000 ml) Lắc ở tốc độ 125vòng/phút trong 7 ngày ở nhiệt độ 27,9 - 30,90C, ẩm độ không khí 65 - 86%

Cả hai thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại,gồm: Các dạng khoáng chứa N (dạng (NH4)2SO4, NH4NO3 và CO(NH2)2; nồng độ 28;

56 và 112 mmol), hợp chất P và K (KH2PO4, nồng độ K+ ở 2; 4 và 8 µmol), Ca (CaSO4;nồng độ 0,625; 1,25 và 2,5 mmol) và Mg (MgSO4; nồng độ 8; 16 và 32 µmol)

Số lượng bào tử trong mỗi bình tam giác thí nghiệm được xác định bằnglamme đếm hồng cầu hiệu Malassez Sinh khối nấm được thu qua giấy lọc(Whatman # 5) và sấy khô ở 1050C trong 8 giờ

Hình 2.1 Điều tra và khảo sát các ruộng khóm tại xã Hỏa Tiến, thị xã Vị Thanh, Hậu Giang

(A và B) (Hậu Giang, 2005)

Hình 2.2 Ruộng khóm bị bệnh thối rễ do nấm Hình 2.3 Cây khóm bị bệnh thối rễ do

Fusarium solani (Hậu Giang, 2005) Fusarium solani (Hậu Giang, 2005).

Hình 2.4 Rễ khóm bị thối do Fusarium solani Hình 2.5 Rễ và thân khóm bị thối do nấm

(Hậu Giang, 2005) Fusarium solani (Hậu Giang,

B

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Kết quả điều tra

Qua quá trình điều tra cho thấy hai huyện Vị Thủy và Long Mỹ có diện tíchtrồng khóm còn thấp, không tập trung và cây mới trồng 1 - 2 năm, các bệnh thối rễ

và thối nõn chỉ xuất hiện rải rác nên đã không thỏa theo tiêu chí điều tra đã đề ra(rẫy khóm đã trồng trên 3 năm, cây đang có bệnh để thu thập mẫu bệnh) Vì vậy,sau khi hội ý với các cán bộ kỹ thuật của sở Nông nghiệp & PTNT, công tác điềutra đã tập trung vào vùng trồng khóm trọng điểm của tỉnh (xã Hỏa Tiến, thị xã VịThanh) để điều tra và thu mẫu bệnh trên các hộ trồng khóm lưu niên có diện tích ≥0,3 ha ở mỗi hộ

Kết quả cho thấy nhóm nghiên cứu đã điều tra được 19 hộ nông dân trồng khóm

đã bị nhiễm bệnh thối rễ và thối nõn với tỷ lệ khá cao Trên các ruộng điều tra, đã thu

thập và phân lập được 50 chủng Trichoderma từ các mẫu đất ở cây khỏe trong ruộng,

5 chủng Phytophthora phân lập được từ phần nõn cây bệnh và 10 chủng Fusarium

phân lập từ các phần rễ cây bệnh của các giống khóm Queen và Cayenne (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Sự hiện diện của các chủng Fusarium, Phytophthora và Trichoderma tại

Hậu Giang (Đại học Cần Thơ, 2005 – 2006)

Thị xã Xã điều tra Số hộ PhytophthoraSố chủng FusariumSố chủng Trichoderma Số chủng

Các chủng nấm gây bệnh thối rễ khóm được xác định là Fusarium solani dựa theo

khóa phân loại của Booth (1971), Burgess và ctv (1994), Gerlach và Nirenberg (1982)

Các chủng nấm gây bệnh thối nõn khóm được xác định là Phytophthora

nicotianae dựa theo khóa phân loại Phytophthora của Drenth và Sendall (2001).

Kết quả Bảng 3.2 cho thấy lượng phân bón N, P, K được nông dân sử dụng trên ha

ở xã Hỏa Tiến (Hậu Giang) tương ứng là 2,1 N + 1,0 g P2O5 + 0,1 g K2O, rất thấp so vớimức khuyến cáo là 10 g N + 7 g P2O5 + 8 g K2O/cây

Bảng 3.2 Lượng phân bón/ha của các hộ điều tra tại xã Hỏa Tiến, huyện Vị Thanh,

Tất cả 10 chủng Fusarium gây bệnh thối rễ và 5 chủng Phytophthora gây bệnh

thối nõn thu thập từ các ruộng khóm đã được tiêm chủng lên cây khóm con cấy môtheo quy trình Koch

Kết quả thống kê (Bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6) cho thấy các chủng F solani và P.

nicotianae thu thập đều có khả năng gây hại với các mức độ khác nhau.

Bảng 3.3 Chỉ số bệnh (%) trên cây khóm con sau 25, 35 và 45 ngày chủng nấm gây

bệnh Fusarium solani (Đại học Cần Thơ, 2006).

F-VTa23 0 c 0 e 0 e

Ghi chú: Các số liệu trong cùng cột mang cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt nhau ở độ ý

NSKCF: Ngày sau khi chủng Fusarium

Bảng 3.4 Tỷ lệ cây chết (%) trên cây khóm con sau 45 ngày chủng nấm gây

bệnh Fusarium solani (Đại học Cần Thơ, 2006).

Ghi chú: Các số liệu trong cùng cột mang cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt nhau ở độ ý

Bảng 3.3 và 3.4 cho thấy có 5/10 chủng F solani gây hại cho cây khóm tại

vùng điều tra Trong 4 chủng này, có 2 chủng tạo độc tính cao (chỉ số bệnh trên50% ở 35 ngày và trên 80% ở 45 ngày sau khi chủng, NSKC), có khả năng gây hạinặng trên cây khóm con là F-VTa7 và F-VTa9 Trong đó, chủng F-VTa7 có độc tínhcao nhất (Hình 3.1), chỉ số bệnh và tỷ lệ cây chết 100% sớm nhất ở 45 NSKC; kếđến là F-VTa9 có chỉ số bệnh đạt 85,2% và tỷ lệ cây chết đạt 34,2% ở 45 NSKC.Riêng 3 chủng F-VTa8, F-VTa11 và F-VTa21 cũng biểu hiện triệu chứng bệnh (quachỉ số bệnh) nhưng ở mức độ thấp (4,7 - 18,0%) nhưng chưa đủ độc tố làm chết cây

qua 45 ngày khảo sát Năm chủng F solani còn lại (F-VTa8, F-VTa14, F-VTa15,

F-VTa17 và F-VTa18) đều không tạo độc tố trên cây khóm con và không gâychết cây sau 45 ngày khảo sát

Bảng 3.5 Chỉ số bệnh (%) trên cây khóm con sau 20, 30 và 40 ngày chủng nấm gây

bệnh Phytophthora nicotianae (Đại học Cần Thơ, 2006).

Ghi chú: Các số liệu trong cùng cột mang cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt nhau ở độ ý

NSKCP: Ngày sau khi chủng Phytophthora.

Bảng 3.5 và 3.6 cho thấy cả 5 chủng nấm P nicotianae thu thập và phân lập đều

gây bệnh trên cây khóm con với độc tính thể hiện trên cây của từng chủng nấm cũng

khác nhau (Bảng 3.5) Chủng nấm P nicotianae P-VTa18 có độc tính cao nhất (Hình 3.2) với chỉ số bệnh và tỷ lệ cây chết đều đạt 100% ở 40 ngày sau khi chủng nấm P.

nicotianae (Bảng 3.5 và Bảng 3.6).

Bốn chủng nấm P nicotianae còn lại (VTa7, VTa9, VTa21 và

P-VTa23) dù có biểu hiện bệnh (qua chỉ số bệnh) nhưng chưa có khả năng gâychết cây sau 40 ngày chủng bệnh Chỉ số bệnh của các chủng này ở 40 ngàysau khi chủng lần lượt là P-VTa7 (54,7%), P-VTa9 (28%), P-VTa21 (7,9%) vàP-VTa23 (1,7%) (Bảng 3.6)

Như vậy, kết quả điều tra và thu thập mẫu bệnh ở xã Hỏa Tiến, thị xã Vị

Thanh cho thấy có sự hiện diện của các chủng nấm F solani (gây bệnh thối rễ trên khóm) và nấm P nicotianae (gây bệnh thối nõn trên khóm) trên các cây

khóm bệnh; 5/10 chủng nấm (chiếm 50%) F solani và 5/5 chủng nấm (chiếm

100%) phân lập được đều có khả năng gây bệnh trên cây khóm con cấy mô ở cácmức độ và tốc độ khác nhau Dựa vào kết quả thử nghiệm theo quy trình Koch này,

có thể kết luận nấm Fusarium solani chính là tác nhân gây bệnh thối rễ và nấm

Phytophthora nicotianae chính là tác nhân gây bệnh thối nõn trên các ruộng khóm

tại những địa phương đã khảo sát

Bảng 3.6 Tỷ lệ chết (%) trên cây khóm con sau 40 ngày chủng nấm gây bệnh

Phytophthora nicotianae (Đại học Cần Thơ, 2006).

Ghi chú: Các số liệu trong cùng cột mang cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt nhau ở độ ý

3.3 Hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma dựa trên khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm của các chủng F solani và P nicotianae

Các chủng Trichoderma được phân lập từ các ruộng khóm của Vị Thanh được đánh giá hiệu quả đối kháng so với chủng Trichoderma T-BM2a (làm đối chứng +)

là chủng có khả năng đối kháng cao trong các nghiên cứu trước đây của nhómnghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện trên đĩa petri nhằm chọn lọc sơ khởi các

chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các chủng nấm gây bệnh F.

solani và P nicotianae qua khả năng ức chế sự phát triển khuẩn lạc của nấm bệnh.

Hai chủng F solani gây bệnh nặng (F-VTa7 và F-VTa9) và ba chủng P.

nicotianae gây bệnh (P-VTa7, P-VTa9 và P-VTa18) từ thí nghiệm trước (mục 3.2)

đã được chọn để đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma.

Nhìn chung, từ sau 3 ngày nuôi cấy các chủng Trichoderma đều có khả năng đối kháng với các chủng nấm gây bệnh F solani và P nicotianae nhưng với khả

năng đối kháng thay đổi tùy chủng nấm

Kết quả đánh giá khả năng đối kháng đối với nấm F solani (Bảng 3.7) cho thấy có 9 chủng Trichoderma (T-VTa14c, T-VTa16b, T-VTa18b, T-VTa18c, T-

VTa20a, T-VTa23c, T-VTa24a, T-VTa24c và T-VTa25a) có khả năng đối kháng cao

và ổn định với F solani (F-VTa7 và F-VTa9) với hiệu suất đối kháng tương đương

với BM2a (56,2%) trung bình là 48,3 – 58,9% Trong các chủng này, 4 chủng