DSpace at VNU: Thành phần Proteinaz ngoại bào của vi khuẩn cộng sinh với tuyến trung (Xenorhabdus Sp, Ca)

TAP CHỈ KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN, T xx, số 3, 2004 T H À N H P H Â N P R O T E IN A Z NGOẠI BÀO CỦA VI K H U A N CỘNG S IN H V ỚI T U Y Ế N T R U N G (X E N O R H A B D U S SP CA) T rịn h H ồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thuỳ Dương, P h a n Thị Hà Khoa S in h học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ HQ G H N Mở đ ầ u Vi khuẩn X enorhabdus Photorhabdus cộng sinh với hai chủng tuyến trùng Steinernem a H eterorhabditis tương ứng [1] Trong phức hệ cộng sinh này, vi k huẩn nằm ơng tiêu hố tuyến trùng Khi tuyến trù n g xâm nhập vào côn trùng, vi khuẩn vào xoang máu côn trùng Tại đây, chúng n hân lên sô' lượng tạo yếu tô gây bệnh côn trùng lipopolysacarit, proteinaz, lipaz, chất kháng sinh protein độc [6] Trên thê giới, tu y ến trùng sử dụng phòng trừ sinh học có hiệu Các proteinaz nghiên cứu nhiều vi k h u ấn cộng sinh với tuyên trùn g [7,8,10 ] Các proteinaz có vai trò quan trọng tham gia vào q trìn h diệt trùng Ớ Việt Nam, năm gần đây, tuyến trùn g nghiên cứu sử dụng phòng trừ sinh học [4,5] Trong cơng trình nghiên cứu trước, chúng tơi đă tiến hành phân tích proteinaz ngoại bào vi k h uẩn cộng sinh với tuyến trù ng phân lập Việt Nam Các proteinaz thuộc loại proteinaz kiềm, đa dạng phong phú [9] Nhằm tiếp tục tìm hiểu proteinaz vi k h u ẩn cộng sinh với tuyến trùng, viết chúng tồi trìn h bày kết nghiên cứu th àn h phần proteinaz vi khuẩn Xenorhabdus sp CA làm sở cho việc sử dụng có hiệu phức hợp tuyến trùng-vi khuẩn phòng trừ sinh học nước ta N g u y ên liệu p h n g pháp Vi khuẩn Xenorhabdus sp CA phân lập từ tuyến trù ng Steinernem a carpocapsae Phòng Tuyến trùng, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Nghĩa Đô-Từ Liêm, Hà Nội cung cấp Chừ viết tắt: DMSO: Dimethyl Sulfoxide, PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride, pCMB: pchloromercuribenzoate, EDTA: ethylendiaminetetraacetic acid, o-phe: 1,10 - o-phenanthroline; SDS: sodium dodecyl sulfate 11 T rịn h H n g T h i, T rịn h T h ị Thanh Hương 12 Vi khuân phân lập môi trường NBTA- môi trường dinh dưỡng ag ar (3g cao thịt, 5g pepton, 15g thạch, dẫn nước đến llít, tiệt trùn g 30 phút 0,8 atm) có chứa 25mg Bromothymol Blue 40mg Triphenyltetrazolium Chloride Tách k h u ân lạc, cấy vào mơi trường dinh dường khơng có agar Nuôi cấy thực máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút 30°c, lắc qua đêm Sau đó, 2ml dịch nuôi cấy chuyên vào 100ml mồi trường dinh dưỡng lắc 30°c tròng 48 giò Dịch nuôi cấy sau 48 ly tâm 0 0 vòng/phút 10 p h ú t 4°c, thu lấy dịch trong, sau lọc qua màng 0,22^m sử dụng cho nghiên cứu Hoạt độ proteinaz xác định theo phương pháp Kunitz có cải tiến đà mơ tả trước [10] Điện di proteinaz theo phương pháp Heussen Dowdle (1980) thực mô tả từ trước [10] Kết n g h iên cứu bàn luận 3.1 Anh hưởng chát ức chê đặc hiêu nhóm đến hoat độ enzym Đê sơ xác định th n h phần proteinaz dịch nuôi cấy vi khuẩn, tiến hành thử tác dụng bơn chất ức chê đặc hiệu nhóm (PMSF, pCMB, EDTA phenanthroline) Kết cho thấy: enzym bị ức chế m ạnh n h ấ t EDTA PMSF (hình 1) PMSF chất ức chế đặc hiệu với nhóm proteinaz xêrin, EDTA chất ức chê đặc hiệu với nhóm proteinaz kim loại Như vậy, dịch nuôi cấy vi k h uẩn có th ể chứa hai loại proteinaz: proteinaz kim loại proteinaz xêrin 120 PMSF pCMB EDTA o-ph DMSO C c c h t ức c h é đ c hiệu Hình 1: Ảnh hưỏng chất ức chế đặc hiệu nhóm đến hoạt độ proteinaz vi khuân Xenorhabdus sp CA Tạp chí Khoa học Đ H Q G H N K IỈT N & C N ĩ.X X sỏ'3 2004 13 Thành phan prolcinux nuoại hào vi khuân cộnc sinh 3.2 Anh hưởng ion kim loai hoá trị hai đến hoat dô enzym Các ion kim loại sử dụng gồm ion: Ca2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fei+, Co"\ Zn2+, H g'+ với nồng độ cuối hỗn hợp phản ứng 10 5M Kết cho thấy enzym bị giảm hoạt tính mạnh n hất bới Hg2+, sau đến Zn2+, Co2+ Cu2+; ngược lại, ion Ca2+ Mg2> làm tăng hoạt độ enzym 10-15% (hình 2) 00 so 60 40 C ác ion Hình Ảnh hưởng ion kim loại hố trị hai đến hoạt độ proteinaz vi khuân Xenorhabdus sp CA 3.3 Xác đỉnh thành p h ần pr oteinaz bang điện di Đê sâu phân tích th àn h phần proteinaz có dịch ni cấy vi khuẩn, tiến hành điện di gel polyacrylamit có SDS có chất gelatin 0,1% (hình 3) Các băng enzym nhận thấy trôn gel nằm vùng (I, II III) với độ di động điện di tương ứng bàng: (0-0,08), (0,09-0,20) (0,25-0,31) Trong băng vùng II hoạt độ mạnh nhất, chúng bị ức chế mạnh EDTA PMSF Ngược lại, hai loại chất ức chê không ức chê băng vùng I Tuy nhiên, băng vùng III bị ức chê mạnh ủ với PMSF bị ức chế phẳn EDTA Hình Điện di proteinaz gel polyacrylamit có SDS có chất gelatin 0,1%: ảnh hướng EDTA PMSF lên hoạt độ proteinaz dịch nuôi cấy vi khuân Xenorhabdus sp CA Chú thích trcn hình điện cỉỉ: giêng 1: đối chứng nước; 2: EDTA; 3: PMSF; 4: DMSO Tạp clìi Khoa hoc D H Q G H N K IIT N & C N T.xx S ổ 3, 2004 14 T rịn h H im T h i T rịn lì T h ị T hanh Hương Đê đánh giá ánh hướng ion kim loại hố trị hai đơì với băng proteinaz bị ức chế bới EDTA, mẫu nghiên cứu điện di gel polyacrylam it có SDS có chất gelatin 0,1% Chuẩn bị mẫu sau: mẫu ủ vói EDTA vỏi nồng độ cuối hỗn hợp phản ứng 10 !M 10 phút, sau bổ sung ion kim loại với nồng độ cuối 10 *M; 2,5 10 *M 10 *M Kết cho thấy: ion Ca"*, Ba~\ MgJ\ M n '+, Pb",+ làm tăng rõ rệt hoạt độ enzvm thuộc vùng III; ion Ni“\ CdJ+, Fe“\ C u’J\ Co“+ thê ảnh hưởng không rõ ràng Điều đáng lưu ý là: ion Ca2+, Ba2\ Mg2\ M nj+ chi ản h hưởng đến hoạt độ băng proteinaz 0,25, Pb"+ có tác dụng đơi vói băng 0,31 Tuy nhiên, chúng tơi chưa tìm thấy ion kim loại có tác dụng khơi phục hoạt tính băng enzym vùng II (hình 4) 8 (a) (b) T ạp chí K hoa học Đ H Q C H N K H T N & C N ĩ XX S ổ 2004 15 Thành phần p ro tc in a / Iic o i hào vi khuân cộ nu sinh (e) Tạp Khoa học D H Q C ỈH N , K ỉ / I N & CN, T.xx, S ố 2004 16 T rịn h HỒ 11U T h i, T rịn h T h ị Thanh Hương (h) H ì n h Điện di proteinaz gel polyacrylamit có SDS có chất gelatin 0.1%: ánh hưởng ion kim loại đôi với hoạt độ proteinaz vi khuan Xenorhabdus sp CA sau bị ức chê bơi EDTA Chú thích hình điện di: giếng 1, 5: đối chứng nước; 2, 6: đối chửng EDTA; 3, 4, 8: proteinaz sau bị ức chê bời EDTA u với ion kim loại nồng độ 2,5 10 :‘M 10 M tương ứng Sau điện di: nứa bán gel (có giếng 1-4) ủ với đệm glycin-NaOH 0.1M pH 8.0 khơng có ion kim loại; nửa bán gel (có giếng 5-8) ủ với đệm trên, có ion kim loại nồng độ 2,5 10"‘M (a): Cai+, (bj: Ba-\ (c): Mg-\ (d): MnJ\ (e): ?b~\ (0: Nr", (g): Cd2+, (h): Fe2+ Tạp chí Khoa học ĐHQGHN K H I N & CN ỉ XX s\\ 2004 Thành phần p ro lc in a / Iicoại hào vị khuẩn cộng sinh 17 Các nghiên cứu từ trước cho biết vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùn g tiết lượng lớn proteinaz môi trường nuôi cấy [2,7,8,9,10] Các proteinaz phản loại thuộc proteinaz kiêm với pH thích hợp thuộc nhóm proteinaz kim loại đo chúng bị ức chê mạnh EDTA, chúng không bị ức chê PMSF[8,10] Tuy nhiên, rấ t cơng trình nghiên cứu sâu phân tích th àn h phần proteinaz ngoại bào vi khuân cộng sinh với tuyến trùng Trong nghiên cứu này, nhận thấy proteinaz ngoại bào Xenorhabdus sp CA bị ức chê mạnh EDTA mà bị ức chê mạnh bời PMSF Bằng kỹ th u ật điện di proteinaz, xác định th ành phần proteinaz, bang proteinaz có hoạt độ mạnh n h ất thuộc vùng II bị ức chê mạnh cá EDTA PMSF, băng proteinaz vùng III bị ức chê m ạnh bới PMSF bị ức chê phẩn EDTA Nghiên cứu ảnh hưởng ion kim loại đên hoạt độ proteinaz cho thấy ion Ca“\ Ba2+, Mg2+, M n2+ có tác dụng khơi phục hoạt tính băng 0,25 sau bị ức chế EDTA, Pb2+ có tác dụng với băng 0,31 Vì vậy, cho hai băng thuộc loại proteinaz kim loại-xêrin tìm thấy vi khuẩn Bacillus p u m ilu s [3] Bước cần phải tinh sạch, nghiên cứu tính chất cấu trúc phân tủ proteinaz K ết lu ậ n 1) Bằng kỷ th u ậ t điện di gel polyacrylamit có SDS có gelatin 0,1% xác định proteinaz ngoại bào vi khuân Xenorhabdus sp CA gồm vùng (1,11 III) với độ di động điện di tương ứng bằng: (0-0,08), (0,09-0,20) (0,25-0,31) 2) Các băng vùng II thê hoạt độ mạnh nhất, chúng bị ức chế mạnh EDTA PMSF Các băng vùng III bị ức chế m ạnh ủ với PMSF bị ức chê phần EDTA Chúng thuộc loại proteinaz kim loại-xêrin TÀI LIỆU THAM KHẢO Boemare N., A Ciivaudan, Brehelin M and c Laumond, Symbiosis and pathogenicity of nematode-bacterium complex, Symbiosis, 22(1997), pp 21-45 Caldas c., A Cherqui, A Pereira, N Simoes, Purification and characterization of an extracellular protease from Xenorhabdus nematophila involved in insect immunosuppression, Applied and Environmental Microbiology, 68, 3(2002), pp 1297-1304 Phạm Thị Trân Châu and Ưrbanek H., Serine neutral proteinase from Bacillus pumilus as metalloenzyme, Acta Microbiologica Polonica, Ser B, 6, (23), 1(1974), pp 21-25 Nguyễn Ngọc Châu, Nghiên cứu sử dụng tuyến trùng phòng trừ sinh học sâu hại câv trồng ỏ Việt Nam, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Hà Nội, XXXVI, 3(1998), tr 24-29 Nguyễn Ngọc Châu, Nguyền Vũ Thanh, Lại Phú Hoàng, Phan Kê Long, Bước đầu điêu tra tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng Việt Nam, Tạp chí Sinh học, Hà Nội, 21, 2b(1999), tr 90-95 Tap chi Khoa học t ) Ỉ I Q ( Ỉ Ỉ Ỉ N K H Ỉ N & C N T.XX sỏ'3, 2004 T rịn h H T h i, T rịn h T h ị Thanh Hương 18 Forst S., and K Nealson, Molecular biology of the symbiotic-pathogenic bacteria Xenorhabdus spp and Photorhabdus spp, Microbiological Reviews, 60(1996), pp 21-43 Ong K.L., F.N Chang, Analysis of proteins from different phase variants of the entomopathogenic bacteria Photorhabdus luminescens by two dimensional zymography, Electrophoresis, 18(1997), pp834-839 Schmidt T.M., B Bleakley, and K.H Nealson, Charaterization of an extracellular protease from the insect pathogen Xenorhabdus luminescens, Applied and Environmental Microbiology, 54, 11(1998), pp 2793-2797 Trịnh Hồng Thái, Nguyễn Hoài Hà, Phạm Thị Trân châu, Bưốc đầu nghiên cứu proteinaz vi khuân phân lập từ tuyến trùng Steinernema carpocapsae TL Heterorhabditis sp TK3, Tạp chí Sinh học, Hà Nội, 21b(1999), tr 173-179 10 Trinh H Thai, R.A Boigegrain M Brehelin, Purification and characterization of the extracellular protease from the insect pathogen Photorhabdus luminescens, J Genetics and Applications Specical Issue, Biotechnology, 2001, pp 10-17 VNU JOURNAL OF SCIENCE, Nat., Sci., & Tech., T x x , N03, 20 04 COMPOSITION OF EXTRACELLULAR PROTEINASE PRODUCED BY ENTOMOPATHOGENIC BACTERIA (XENORHABDUS SP CA) Trinh H ong Thai, Trinh Thi T hanh Hương, L u on g Thuy Duong, P h an Thi Ha D epartm ent o f Biology, College o f Science, VN U Xenorhabdus Steinernem a sp.CA, * an carpocapsae was entomopathogenic isolated in bacterium Vietnam associated Extracellular with proteinase the of Xenorhabdus sp.CA was strongly inhibited by EDTA and PMSF Proteinase composition was analyzed by using a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis incorporating 0.1% gelatin Proteinase activity was identified in areas (I, II, II) with relative motility of (0-0,08), (0,09-0,20) (0,25-0,31), respectively Proteinase activity of II was the strongest, the proteinases were inhibited by EDTA and PMSF In contrary, they did't inhibite the proteinases of I However, the proteinases of III were strongly inhibited by PMSF and partly inhibited by EDTA Ions of Ca2+, Ba2+, Mg2+, Mn2+, Pb2-*" increased the proteinase activity of III, however, the effect of Ni2+, Cd2+, Fe2+, Cu2+, Co2+ was very weak It is interested th a t ions of Ca2+, Ba2+, Mg2+, Mn2+ influenced on the band of 0.25, and Pb2+ influenced only on the band of 0.31 Unexpectively, we did't find any metal ions which effected on the proteinases of II The proteinases were classified as serine metalloproteinase Tạp chí Khoa học Đ H Q G H N K H T N & C N T.xx, So 3, 2004 ... hào vị khuẩn cộng sinh 17 Các nghiên cứu từ trước cho biết vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùn g tiết lượng lớn proteinaz môi trường nuôi cấy [2,7,8,9,10] Các proteinaz phản loại thuộc proteinaz. .. ngoại bào vi khuân cộng sinh với tuyến trùng Trong nghiên cứu này, nhận thấy proteinaz ngoại bào Xenorhabdus sp CA bị ức chê mạnh EDTA mà bị ức chê mạnh bời PMSF Bằng kỹ th u ật điện di proteinaz, ... chế đặc hiệu với nhóm proteinaz xêrin, EDTA chất ức chê đặc hiệu với nhóm proteinaz kim loại Như vậy, dịch nuôi cấy vi k h uẩn có th ể chứa hai loại proteinaz: proteinaz kim loại proteinaz xêrin