BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HỐ HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BA LOÀI THỰC VẬT NGẬP MẶN VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM: CỎ CHÔNG (SPINIFEX LITTOREUS), HẾP (SCAEVOLA TACCADA) VÀ CĨC ĐỎ (LUMNITZERA LITTOREA) Chun ngành : Hóa hữu Mã số: 62440114 HÀ NỘI, 2017 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TSKH TRẦN VĂN SUNG TS TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học Viện họp Học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, hồi 14 giờ, ngày tháng năm 2017 I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới (2015), Việt Nam đứng top đồ ung thư giới, bình qn năm có khoảng 70.000 người chết 200.000 người mắc bệnh mới, số tiếp tục gia tăng Trước tình hình nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm hợp chất tiêu diệt bệnh thời đại Trong năm gần số quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Brazin, Trung Quốc, Úc tập trung nghiên cứu khai thác sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ loài ngập mặn Tuy nhiên Việt Nam cơng trình nghiên cứu thăm dò hoạt tính sinh học thành phần hóa học loài ngập mặn ứng dụng dân gian để làm thuốc Chính vậy, với mong muốn phát chất có cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú từ loài ngập mặn ven biển người dân sử dụng làm thuốc chưa nghiên cứu nhiều mặt hóa học hoạt tính sinh học, chúng tơi lựa chọn lồi vùng ngập mặn lồi Cỏ chơng (S littoreus (Burm f.) Merr.), lồi Hếp (S taccada (Gaertn Roxb.) lồi Cóc đỏ (L littorea (Jack) Voigt.) làm đối tượng để nghiên cứu Với mong muốn trên, luận án đặt mục tiêu cụ thể sau: Chiết xuất phân lập chất từ lồi ngập mặn Cỏ chơng (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, gây độc tế bào, chống oxy hóa dịch chiết số chất phân lập từ loài kể Đề tài: “Nghiên cứu thành phần hố học thăm dò hoạt tính sinh học ba loài thực vật ngập mặn vùng ven biển Việt Nam: Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)” cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao, đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi ngập mặn ven biển, lĩnh vực chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu Việt Nam Các kết đề tài góp phần giải thích chất hóa học vị thuốc dân gian, nâng cao giá trị sử dụng loài ngập mặn Những đóng góp luận án Lần Việt Nam giới, thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) lồi Cỏ chơng (Spinifex littoreus) nghiên cứu Từ lồi Cỏ chơng phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất có chất lần phân lập từ thiên nhiên Từ lồi Cóc đỏ phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất Luận án cho thấy dịch chiết từ hoa lồi Cỏ chơng có hoạt tính chống ung thư vú (MCF7) dịch chiết từ cành lồi Cóc đỏ có hoạt tính chống oxy hóa (theo phương pháp DPPH) Lần Việt Nam thành phần hóa học hoạt tính sinh học Hếp (Scaevola taccada) nghiên cứu Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất có hợp chất lần đầu phân lập từ loài II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU: Đề cập đến ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước Quốc tế vấn đề liên quan đến loài thực vật ngập mặn nghiên cứu CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Lồi Cỏ chơng (Spinifex littoreus) thu hái bờ biển xã Tam Hải, tỉnh Quảng Nam: Cặn chiết n- hexan; n- butanol hoa Cỏ chơng - Lồi Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) thu hại bờ biển Thuận An Thừa Thiên Huế: Cặn chiết ethyl acetate methanol cành Cóc đỏ - Lồi Hếp (Scaevola taccada) thu hái đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi: Cặn chiết n-hexan ethyl acetate Hếp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật 2.2.2 Phương pháp phân lập, tinh chế hợp chất Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký cột (CC) 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Sử dụng phương pháp giếng nồng độ môi trường lỏng để đánh giá mức độ kháng khuẩn mẫu thử 2.2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH Sử dụng DPPH tạo gốc oxy hóa tự để sàng lọc chất chống oxy hóa 2.2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Xác định hàm lượng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB) 2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc Xác định cấu trúc dựa thông số vật lý kết hợp với phương pháp phổ đại gồm: Độ quay cực [α]D, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY, NOESY 2.3 Dữ liệu phổ chất phân lập từ loài nghiên cứu 2.3.1 Cây Hếp (S taccada) 2.3.1.1 Các chất phân lập từ dịch chiết n-hexan Hếp Glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Z-octadecadienoate) (ST1): Chất dạng dầu (+)-ESI-MS (m/z): 853.5 [M + Na]+ (10%); 354.3 [M+2H-C15H31CO - C15H31CO]+ (100%) IR (KBr, υ = cm-1): 2937 (-CH alkan), 1744 (C=O ester), 1632 (C=C) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.37 - 5.31 (4H, m, H-9’’, H-10’’, H-12’’, H-13’’), 5.26 - 5.25 (1H, m, H-2), 4.29 (2H, dd, J = 12; 4.5 Hz, H1a, H3a), 4.14 (2H, dd, J = 12.0; 6.0 Hz, H1b, H3b), 2.76 (2H, t, J = 6.5 Hz, -CH=CH-CH2-CH=CH-), 2.32 - 2.29 (6H, m, OCOCH2CH2), 2.06 - 1.99 (4H, m, CH2CH2-CH=CH-), 1.60 (6H, m, OCOCH2CH2), 1.36 - 1.25 (62H, m, CH2), 0.92 - 0.84 (9H, t, J = 6.5 Hz, CH3) 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): 173.29, 173.26, 172.85 (C=O- ester), 130.2 ; 129.72; 128.10; 127.92 (CH=CH); 68.91; 62.11; 34.07 - 22.57 (CH2), 14.10; 14.06 (CH3) α-amyrin (ST2): Chất dạng bột trắng IR (KBr, υ = cm-1): 3399.80 (OH), 2925 (-C-H), 1651 (C=C) (+)-ESI-MS (m/z): 445.20 [M+H2O+H]+ (20%) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.15 (1H, t, J = 3.5 Hz, H-12), 3.24 (1H, m, H-3), 2.02 (2H, dt, J =4.5; 13.5 Hz, H-2), 1.94 - 1.92 (2H, m, H-11), 1.65 (4H, m, H-1, H-15), 1.58 - 1.52 (1H, m, H-9), 0.75 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-5); 1.02 (s, H-23); 0.81 (s, H-24); 0.97 (s, H-25); 1.01 (s, H-26); 1.09 (s, H-27); 0.89 (s, H-28); 0.94 (d, J = 7.0 Hz, H-29), 0.80 (d, J = 7.0 Hz, H-30) 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): 38.83 (C-1), 28.14 (C-2), 79.09 (C-3), 38.83 (C-4), 55.22 (C-5), 18.38 (C-6), 32.97 (C-7), 40.05 (C-8), 47.76 (C-9), 36.93 (C-10), 23.40 (C-11), 124.46 (C-12), 139.62 (C-13), 42.12 (C-14), 27.3 (C-15), 26.65 (C-16), 33.78 (C-17), 59.11 (C-18), 39.70 (C-19), 39.64 (C-20), 31.28 (C-21), 41.56 (C22), 28.77 (C-23), 15.04 (C-24), 15.70 (C-25), 16.89 (C-26), 23.29 (C-27), 28.15 (C-28), 17.48 (C-29), 21.40 (C-30) Stigmasterol (ST3): Chất hình kim IR (KBr, ν = cm-1): 3397.79 (OH), 2951.45 (-C-H), 1664.76 (C=C) (+)-ESI-MS (m/z): 413.05 [M+H]+ (100 %) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.35 (1H, m, H-6), 5.15 (1H, dd, J = 15.2; 8.6 Hz, H-23), 5.02 (1H, dd, J = 15.2; 8.7 Hz, H-22), 3.52 (1H, m, H-3), 1.02 (s, H19), 1.01 (d, J = 6.7 Hz, H-21), 0.85 (d, J = 6.5 Hz, H-26), 0.84 (t, J = 7.1 Hz, H29), 0.81 (d, J = 6.6 Hz, H-27), 0.69 (s, H-18) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 37.28 (C-1), 31.68 (C-2), 71.80 (C-3), 42.32 (C-4), 140.77 (C-5), 121.70 (C-6), 31.88 (C-7), 31.88 (C-8), 50.18 (C-9), 36.53 (C-10), 21.22 (C-11), 39.70 (C-12), 42.23 (C-13), 56.88 (C-14), 24.37 (C-15), 28.91 (C-16), 55.98 (C-17), 12.05 (C18), 18.99 (C-19), 40.49 (C-20), 21.22 (C-21), 138.31 (C-22), 129.30 (C-23), 51.25 (C-24), 31.91 (C-25), 19.40 (C-26), 21.08 (C-27), 25.40 (C-28), 12.24 (C29) Myricadiol (ST4): Chất dạng thạch mềm IR (KBr, ν = cm-1): 3493.99; 3299.90 (-O-H), 2981.1 (-C-H), 1627.36 (C=C), 1088.85 (-C-O) (+)ESI-MS (m/z): 443.18 [M+H]+ (15%); 413.14 [M+2H-CH2OH]+ (100%) 1HNMR (DMSO, 500 MHz): 1.61; 1.59 (2H, m, H1α,H1β); 1.56; 1.53 (2H, m, H2α, H2β); 3.17 (1H, br s, H-3); 4.25 (1H, br s, 3-OH), 0.72 (1H, s, H-5), 2.17; 1.33 (2H, m, H7α,H7β); 1.44 (1H, m, H-9);1.38; 1.35 (2H, m, H12α, H12β); 5.41 (1H, m, H-15); 2.12; 1.96 (2H, m, H16α, H16β); 0.47 (1H, m, H-18); 1.41; 1.13 (2H, m, H19α, H19β); 1.25; 1.23 (1H, m, H21α, H21β); 1.48; 1.46 (2H, m, H22α, H22β); 0.98 (3H, s, H-23); 0.7 (3H, s, H-24); 0.88 (3H, s, H-25); 1.01 (3H, s, H-26); 0.90 (3H, s, H-27); 2.98; 2.87 (2H, m, H28α, H28β); 4.25 (1H, br s, 28-OH); 0.93 (3H, s, H-29), 0.86 (3H, s, H-30) 13C-NMR (DMSO, 125 MHz): 37.32 (C-1), 26.85 (C-2), 76.79 (C-3), 38.50 (C-4), 55.09 (C-5), 18.43 (C-6), 41.05 (C-7), 39.02 (C8), 48.69 (C-9), 37.49 (C-10), 16.95 (C-11), 33.13 (C-12), 36.89 (C-13), 157.70 (C-14), 115.85 (C-15), 30.15 (C-16), 40.09 (C-17), 44.54 (C-18), 35.51 (C-19), 28.19 (C-20), 32.40 (C-21), 27.32 (C-22), 28.06 (C-23), 15.84 (C-24), 15.15 (C25), 25.77 (C-26), 21.42 (C-27), 63.20 (C-28), 33.65 (C-29), 29.69 (C-30) 2.3.1.2 Các chất phân lập từ cặn chiết ethyl acetate Hếp n-tritriacontane (ST5): Chất dạng tinh thể màu trắng Rf = 0.3 (nhexane : CH2Cl2, 85:15) (+)-ESI-MS (m/z): 465 [M+H]+ (6%) Công thức phân tử: C33H68, M = 464 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 0.81 (6H, t, J = 6.7 Hz), 1.19 (60H, br s), 1.48 (2H, br s) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 14.12 (CH3), 29.37 (CH2), 22.70 (CH2), 29.67 - 29.71 (nhiều CH2), 31.94 (CH2) n-tetracosane (ST6): Chất dạng tinh thể màu trắng Rf = 0.3 (nhexane : EtOAc, 93:7) (+)-ESI MS (m/z): 339 [M+H]+ (6%) Công thức phân tử: C24H50, M = 338 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 0.87 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.25 (44H, br s) 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): 14.12 (CH3), 22.7 (CH2), 29.38 - 29.45 (nhiều CH2), 31.94 (CH2) β-sitosterol (ST7): Chất dạng tinh thể hình kim Rf = 0.4 (n-hexane : EtOAc, 8:2) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.38 - 5.36 (1H, m), 3.56 - 3.52 (1H, m), 2.33 - 2.25 (2H, m), 2.05 - 1.97 (2H, m), 1.89 - 1.82 (3H, m), 1.70 - 1.65 (2H, m), 1.54 - 1.11 (24H, m), 1.07 (3H, s), 1.00 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.87 (3H, t, J = 7.1 Hz), 0.86 (6H, br s), 0.70 (3H, s) Acid ursolic (ST8): Chất dạng bột màu trắng Rf = 0.4 (CH2Cl2 : MeOH, 96:4) (+)-ESI-MS (m/z): 479.23 [M+Na]+; (-)-ESI-MS (m/z): 455.08 [M-H]- IR (KBr, ν = cm-): 3414 (-OH), 1692 (C=O, acid), 2928 (C-H) 1H NMR (DMSO, 500 MHz): 5.11 (1H, br s, H-12), 4.25 (1H, m, 3-OH), 3.01 2.99 (1H, m, H-3), 2.10 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-18), 0.89 (3H, s, H-23), 0.67 (3H, s, H-24), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 1.04 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-29), 0.90 (3H, d, J = 9.5 Hz, H-30) 13 C-NMR (DMSO, 125 MHz): 38.24 (C-1), 26.98 (C-2), 76.85 (C-3), 38.37 (C-4), 54.79 (C-5), 18.00 (C-6), 30.19 (C-7), 39.10 (C-8), 47.02 (C-9), 36.53 (C-10), 23.81 (C-11), 124.58 (C-12), 138.19 (C-13), 41.64 (C-14), 32.71 (C-15), 22.85 (C-16), 46.83 (C-17), 52.38 (C-18), 38.44 (C-19), 38.50 (C-20), 27.54 (C-21), 36.32 (C-22), 28.26 (C23), 16.91 (C-24), 16.07 (C-25), 15.22 (C-26), 23.27 (C-27), 178.23 (C-28), 17.01 (C-29), 21.07 (C-30) β-sitosterol glucoside (ST9): Chất dạng tinh thể màu trắng 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) (ppm), J (Hz): 5.32 (1H, br s), 4.83 (3H, m); 4.39 (1H, t, J = 5.7 Hz); 4.22 (1H, d, J = 7.8 Hz); 3.64 (1H, dd, J = 5.5; 10.1 Hz); 3.48 3.38 (2H, m); 3.14 - 3.10 (2H, m); 3.08 - 3.05 (2H, m); 2.91 - 2.87 (1H, m); 2.38 - 2.34 (1H, m); 2.17 - 2.10 (1H, m); 1.97 - 1.90 (3H); 1.62 - 1.49 (m, 1H); 1.49 1.43 (m, 4H); 1.41 - 1.38 (m, 5H); 1.23 (3H, s); 1.00 (3H, d, J = 6.7 Hz); 0.96 (6H, br s); 0.90 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.81 (3H, d, J = 6.8 Hz); 0.80 (3H, d, J = 6.9 Hz); 0.65 (3H, s) 2.3.2 Cây Cóc đỏ (L.littorea) 2.3.2.1 Các chất phân lập từ dịch chiết ethyl acetate cành Cóc đỏ Hỗn hợp β-sitosterol stigmassterol (tỷ lệ 1:1) (CĐ1): 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.35 - 5.34 (1H, m, H-6), 5.16 (0.6H, dd, J = 8.5 Hz; 15.0 Hz, H-22), 5.02 (0.6H, dd, J = 8.5; 15.0 Hz, H-23), 3.54 - 3.50 (1H, m), 2.31 2.23 (2H, m), 2.09 - 1.95 (4H, m), 1.86 - 1.83 (2H, m), 1.72 - 1.66 (2H, m), 1.66 - 1.63 (2H, m), 1.58 - 1.39 (15H, m), 1.38 - 1.20 (16H, m), 1.17 - 1.06 (5H, m), 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz), 1.01 (3H, s), 0.91 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.81 (3H, d, J = 7.4 Hz), 0.83 - 0.75 (6H, m), 0.69 (3H, s) 13 C NMR (125 MHz, CDCl3): 140.68; 138.30; 129.29; 121.71; 71.8; 56.87; 56.77; 55.97; 51.24; 50.15; 45.90; 42.32; 42.21; 42.13; 40.47; 39.78; 39.69; 37.25; 36.50; 34.06; 32.40; 31.91; 31.77; 31.49; 24.72; 24.70; 22.68; 21.07; 19.79; 19.04; 14.08; 14.04 2-methyl-1,3-dihydroxy-5-tridecylbenzene (CĐ2): Chất dạng dầu màu vàng HR-(-)-ESI-MS (m/z): 305.2486 [M-H]- Công thức phân tử: C20H34O2, M= 306 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.23 (1H, s, H-4, H-6), 4.87 (1H, br s, 1-OH, 3-OH), 2.45 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-1’), 2.08 (3H, s, CH3-Ar), 1.67 – 1.53 (5H, m, CH2), 1.28 – 1.25 (17H, m, CH2), 0.87 (3H, t, J = 6.5 Hz, H13’) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 154.57 (C-1, C-3), 142.03 (C-5), 107.78 (C4, C-6), 107.34 (C-2), 35.54 (C-1’), 31.93; 31.20; 29.69; 29.69; 29.66; 29.60; 29.54; 29.36; 29.31; 22.69; 22.69 (CH2); 14.11 (C-13’); 7.72 (CH3-Ar) 1,3-dihydroxy-5-nonadecylbenzene (CĐ3): Chất dạng dầu màu vàng (-)-ESI-MS (m/z) 375.35 [M-H]- (100%) Công thức: C25H44O2, M = 376 H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.23 (2H, s, H-4, H-6), 6.17 (1H, s), 4.82 (2H, s, OH), 2.48 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-1’), 1.60 (2H, m), 1.29 – 1.16 (32H, m, CH2), 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-19’) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 156.5 (C-1, C-3), 146.1 (C-5), 107.99 (C-4, C-6), 100.17 (C-2), 35.85 (C-1’), 31.93; 30.07 - 22.70 (CH2); 14.11 (C-19’) 2-methyl-1,3-di-O-acetyl-5-tridecylbenzene (CĐ2a): H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.76 (1H, s, H-4, H-6), 2.55 (2H, t, J = 7.5 Hz; H-1’), 2.03 (3H, s, 1- CH3CO-, 3-CH3CO-), 1.94 (3H, s, CH3-Ar), 1.61 – 1.25 (22H, m, CH2), 0.88 (3H, t, J = 6.5 Hz, H-13’).13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 168.98 (C=O ester), 149.78 (C-1, C-3), 141.98 (C-5), 120.28 (C-2), 119.61 (C-4, C-6), 35.32; 31.93; 30.87; 29.69; 29.66; 29.55; 29.46; 29.36; 29.28; 22.69 (12xCH2), 20.80 (CH3CO-); 14.11 (C-13’), 7.72 (CH3-Ar) 2.3.2.2 Các chất phân lập từ cặn chiết ethyl acetate Cóc đỏ Quercetin (CĐ4): Dạng bột màu vàng IR (KBr, υ = cm-1): 3450 cm-1 (OH), 1662 cm-1 (C=O), 1614 cm-1 (C=C) 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 7.75 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 7.65 (1H, dd, J = 2.0; 8.5 Hz, H-6’), 6.91 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5’), 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8); 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 94.4; 99.4; 104.5; 116; 121.7; 124.1; 137.2; 146.2; 148; 158.2; 162.5; 165.6; 177.3 β-sitosterol glucoside (CĐ5): Chất rắn dạng bột màu trắng Rf = 0.38 (EtOAc : MeOH, 98:2) Chất CĐ5 xác định β-sitosterol glucoside dựa vào sắc ký mỏng so sánh với chất chuẩn có phòng thí nghiệm so sánh phổ 1H NMR 2.3.2.3 Các chất phân lập từ cặn chiết methanol cành Cóc đỏ Astragalin (CĐ6): (+)-ESI-MS (m/z) 448 [M]+ (80%) 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): Aglycon: 8.07 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, H- 6’); 6.91 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3’, H-5’), 6.42 (1H, br s, H-8); 6.23 (1H, br s, H-6) Glucose: 5.26 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1”), 3.71 (1H, dd, J = 12.0; 2.0 Hz, H6’’α); 3.55 (1H, dd, J = 12.0; 5.5 Hz, H6’’β); 3.45 – 3.22 (4H, m, H-2’’,3’’,4’’, 5’’) 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): Aglycon: 179.2 (C-4), 165.7 (C-7), 162.6 (C-5), 161.2 (C4’), 159.1 (C-9), 158.2 (C-2), 135.4 (C-3), 132.1 (C-6’), 132.0 (C-2’), 122.4 (C1’), 115.9 (C-5’), 115.9 (C-3’), 105.5 (C-10), 99.9 (C-6), 94.7 (C-8) Glucose: 104.5 (C-1’’), 78.7 (C-5’’), 78.5 (C-2’’), 75.3 (C-3’’), 70.9 (C4’’), 62.4 (C-6’’) 1-acetyl-D-mannitol (CĐ7): [αD]29 = +39 (MeOH, c = 0.1) HR-(+)ESI-MS (m/z): 247.0783 [M+ Na]+ (100%) 1HNMR (CD3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 4.40 (1H, dd, J = 3.0 Hz; 11.5, H1a), 4.19 (1H, dd¸ J = 6.5; 11.5 Hz, H1b), 3.90- 3.84 (2H, m, H-2, H6a); 3.82- 3.79 (2H, m, H-3, H-4), 3.72-3.64 (2H, m, H-5, H6b), 2.10 (3H, s, CH3CO-) 13 CNMR (CD3OD, 125 MHz), δC (ppm): 173.24 (COO), 72.88 (C-5), 71.02 (C-3), 70.90 (C-4), 70.33 (C-2), 67.94 (C-1), 65.13 (C-6), 21.0 (CH3) D-Mannitol (CĐ8): (-)-ESI-MS (m/z): 217.3 [M +Cl]- (60%, C6H14O6Cl) t0nc = 162 – 166 0C 1H NMR (DMSO, 500 MHz): 3.53 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-3, H-4), 3.47 – 3.43 (2H, m, H-2; H-5), 3.62 – 3.58 (2H, m, H1a; H6a), 3.39 – 3.37 (2H, m, H1b; H6b) 13C-NMR (DMSO, 125 MHz): 71.32 (C-2, C-5), 69.70 (C-3, C-4), 63.84 (C-1, C-6) Hexa-O-acetyl-D-manitol (CĐ8a): (+)-ESI-MS (m/z) 457.9 [M + + Na] (80%) 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.45 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3, H-4), 5.07 (2H, m, H-2, H-5), 4.22 (2H, dd, J = 12.5; 2.0 Hz, H1a, H6a), 4.07 (2H, dd, J = 12.5; 5.5 Hz, H1b, H6b), 2.09; 2.07; 2.04 (18H, s, CH3CO) 13C NMR (CDCl3, H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.39 – 5.31 (8H, m, -CH=CH-), 5.26 (1H, m, H-2), 4.29 (2H, dd, J = 12.0; 4.5 Hz, H1a, H3a), 4.14 (2H, dd, J = 12.0; 5.5 Hz, H1b, H3b), 2.80 - 2.75 (4H, m, -CH=CH-CH2-CH=CH-), 2.32 - 2.29 (6H, m, OCOCH2CH2), 2.07 – 2.00 (8H, m, CH2CH2-CH=CH-), 1.61 - 1.56 (6H, m, OCOCH2CH2), 1.38 1.22 (44H, br s), 0.90 - 0.83 (9H, m) 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): 173.29; 173.24; 172.85 (COO), 131.97, 130.24, 130.03, 129.68, 128.31, 128.26, 127.77, 127.13 (CH=CH), 68.91 (CH-O), 62.12 (2xCH2-O), 38.77 - 20.56 (CH2), 14.27, 14.11, 14.07 (CH3) n-hexacosanyl acetate (SL3): (+)-ESI-MS (m/z): 448 [M+Na+H]+ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 4.05 (2H, t, J = 6.5 Hz, -CH2-OCOCH3), 2.04 (3H, s, CH3-COO), 1.60 (2H, m, CH2CH2OCO), 1.28 (46H, br s), 0.88 (3H, t, J = 6.5 Hz, -CH3) 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 171.27 (CH3COO), 64.70 (CH2OH), 31.94- 22.71 (CH2), 21.02 (CH3CO),14.13 (CH3) 2.3.2.3 Các chất phân lập từ cặn chiết n-butanol hoa Cỏ chông (S)-(1,4- Dioxaspiro [4.5]decan-2-yl) methanol (lần phân lập từ thiên nhiên) (SL7): Dạng dầu màu vàng, [α]D25 (MeOH, c = 0.1): 3.8 HR-(+)-ESI-MS (m/z): 173.1173 [M+H]+ (95%); 195.0993 [M+Na]+ (80%) H NMR (CDCl3, CD3OD, 500 MHz): Glycerol: 4.24 – 4.20 (1H, m, H-2), 4.04 (1H, dd, J = 6.5; 11.5 Hz, H3α), 3.76 (1H, dd, J = 6,5; 8.5 Hz, H3β), 3.66 (1H, dd, J = 4.0; 11.5 Hz, H1α), 3.59 (1H, dd, J = 5.0; 11.5 Hz, H1β) Cyclohexane: 1.66 – 1.55 (8H, m, H-2’, 3’, 5’, 6’), 1.66 – 1.55 (2H, m, H-4’).13C NMR (CDCl3, CD3OD, 125 MHz): Glycerol: 75.7 (C-2), 65.45 (C-3), 62.94 (C-1) Cyclohexane: 109.91 (C-1’), 36.23 (C-2’), 34.63 (C-6’), 24.97 (C-4’), 23.85 (C5’), 23.63 (C-3’) n-butyl-D-fructofuranoside (SL8): Rf = 0.3 (n-hexane : EtOAc : MeOH, 2:8:0.5) [α]25D =+ 950 (c 0.1, MeOH) (+)-ESI-MS (m/z): 255.2 [M+H2O+H]+ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 4.13 (1H, m, H-3), 4.10 (1H, m, H-5), 3.92 (1H, m, H-4), 3.86 (1H, d, J = 12.5 Hz, H-1a), 3.77 (1H, d, J = 12.5 Hz, H-1b), 3.75 (2H, m, H-6) 3.57 (1H, m, H-1’a), 3.48 (1H, m, H-1’b), 1.52 (2H, m, H-2’), 1.35 (2H, m, H-3’), 0.91 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-4’) 10 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): 107.7 (C-2), 82.78 (C-5), 81.61 (C-3), 76.63 (C-4), 61.38 (C-6), 60.74 (C-1), 60.50 (C-1’), 32.09 (C-2’), 19.24 (C-3’), 13.79 (C-4’) Thymidine (SL9): Chất dạng rắn màu trắng Rf = 0.4 (n-hexane : aceton, 4:6) (-)-ESI-MS (m/z): 240.9 [M-H]- 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 7.82 (1H, s, H-6), 6.29 (1H, t, J = 7.0 Hz, H-1´), 4.41 (1H, br s, H-3´), 3.90 (1H, m, H-4´), 3.81 (1H, d, J = 11.5 Hz, H5´α), 3.74 (1H, dd, J = 12.0, 3.0 Hz, H5´β), 2.24 (2H, m, H-2´), 1.90 (3H, s, CH3) 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): 166.41 (C-4), 152.39 (C-2), 138.17 (C-6), 111.55 (C-5), 88.82 (C-4´), 86.27 (C-1´), 72.2 (C-3´), 62.84 (C-5´),41.18 (C-2´), 12.42 (CH3) 2,4-dimethoxyphenyl-1-β-D-glucopyranoside (SL10): Chất dạng bột, màu trắng Rf = 0.3 (CH2Cl2 : MeOH, 85:15) HR-(-)ESI-MS (m/z): 351.0872 [M+Cl]- (40%) (+)-ESI-MS (m/z): 339 [M+Na] 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): Glucose: 4.80 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-anomer), 3.48 – 3.35 (7H, m), 3.88 – 3.87 (1H, m), 3.93 (1H, d, J = 12.0 Hz, H6’α), 3.70 (1H, d, J = 12.0 Hz, H6’β) Vòng benzen: 6.87 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.84 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-3), 6.69 (1H, dd, J = 3.0; 8.5 Hz, H-5), 3.83 (3H, s, 2-OCH3), 3.80 (3H, s, 4-OCH3) 13 C NMR (CD3OD, 500 MHz): Glucose: 103.46 (C-anomer), 78.24 (C-2’), 74.95 (C-3’), 71.56 (C-4’), 78.04 (C-5’), 62.64 (C-6’) Vòng benzen: 153.94 (C1’), 151.15 (C-2’), 146.06 (C-4’), 114.06 (C-6’), 109.35 (C-5’), 104.14 (C-3’), 57.17 (4’-OCH3), 56.43 (2’-OCH3) 2,4-dimethoxyphenyl-1-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyran- oside) (SL10a): (+)-ESI-MS (m/z): 507.16 [M+Na]+ (35%), 523.13 [M+K]+ (100%) 1H NMR (CH3OD, 500 MHz): Glucose: 5.29 (1H, t, J = 9.5 Hz), 5.24 (1H, t, J = 7.5 Hz), 5.16 (1H, t, J = 9.5 Hz), 5.00 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1’ anomer), 4.28 (1H, dd, J = 12; 5.0, H6’α), 4.18 (1H, dd, J = 12.5; 2.0, H6’β), 3.82 (1H, m), 2.08 (3H, s, CH3COO), 2.07 (3H, s, CH3COO), 2.04 (3H, s, CH3COO), 2.03 (3H, s, CH3COO) Vòng benzen: 6.77 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-6), 6.61 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3), 6.54 (1H, dd, J = 9.0; 2.5 Hz, H-5), 3.85 (3H, s, 2-CH3O), 3.84 (3H, s) 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Các nghiên cứu Hếp 3.1.1 Kết thử hoạt tính sinh học Dịch chiết n-hexane âm tính với dòng tế bào ung thư biểu mơ (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU), ung thư biểu mô (KB) ung thư vú (MCF7) (IC50 > 128 μg/ml) 3.1.2 Cấu trúc chất phân lập từ loài Hếp Thứ tự Kí hiệu Tên chất Cấu trúc Triterpenoid ST2 α-amyrin 30 29 20 19 18 25 ST8 Acid ursolic 23 ST4 Myricadiol ST7 β-sitosterol ST9 Daucosterol ST3 Stigmasterol Sterol 12 10 24 21 22 H 17 16 28 R 15 HO 12 11 26 13 14 H 27 ST2: R = CH3 ST8: R = COOH Ester ST1 Glycerol 1,3dihexadecanoate-2 (9Z,12Zoctadecadienoate) H 2C 16' O O HC O H 2C (CH )14 CH 1' 2'' 1'' (CH 2)6 16''' O O CH2 1''' (CH2 )14CH 11' 9'' 10'' CH CH (Z) CH 12'' CH 13'' CH (Z) (CH2 )4 18'' CH O Hydrocarbon ST5 ST6 n-tritriacontane n-tetracosane 3.2 Các nghiên cứu Cóc đỏ C33H68 C24H50 3.2.1 Kết thử hoạt tính sinh học 3.2.1.1.Hoạt tính chống oxy hóa Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa Cóc đỏ Hoạt tính bắt gốc tự DPPH (EC50 , μg/ml) Dịch n-hexan EC50 > 128 μg/ml ethyl acetate EC50 > 128 μg/ml methanol EC50 128 μg/ml Dịch cành n-hexan EC50 > 128 μg/ml ethyl acetate EC50 = 81.92 μg/ml methanol EC50 = 80.81 μg/ml Dịch chiết cành có hoạt tính chống oxy hóa yếu với EC50 = 81.92; 80.81 μg/ml, dịch chiết khơng thể hoạt tính 3.2.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật nấm kiểm định Dịch chiết n-hexane, ethyl acetate methanol cành Cóc đỏ khơng thể hoạt tính kháng vi sinh vật nấm kiểm định loài vi khuẩn S aureus, B subtilis, L fermentum, S enterica, E coli, P aeruginosa nấm Candida albicans 3.2.2 Cấu trúc hợp chất phân lập từ lồi Cóc đỏ 13 TT Kí hiệu Tên chất Resorcinolic lipid Cấu trúc CĐ2 1,3-dihydroxy-2-methyl-5tridecylbenzene CĐ2a 1,3-di-O-acetyl-2-methyl-5tridecylbenzene CĐ3 1,3-dihydroxy-5nonadecylbenzene Hexitol CĐ7 1-mono-acetyl-D-mannitol CĐ8 D-mannitol CĐ8a hexa-O-acetyl-D-mannitol Đường CĐ9 CĐ10 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-Dglucopyranosyl-2’,3’,4’,6’tetra-O-acetyl-β-Dglucopyranoside 1,3,4,5- tetra-O-acetyl fructopyranose Flavonoid CĐ4 Quercetin 10 CĐ6 Astragalin Stetol 11 CĐ1 12 CĐ5 Hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol (1:1) Daucosterol 14 3.3 Các nghiên cứu Cỏ chông 3.3.1 Kết thử hoạt tính sinh học 3.3.1.1 Hoạt tính chống ung thư - Dịch chiết MeOH hoa có hoạt tính dòng tế bào ung thư vú MCF7 (IC50 = 75.64 μg/ml) - Dịch chiết n-hexane hoa có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan - HepG2 (IC50 = 70.4 μg/ml), ung thư vú – MCF7 (IC50 = 45.09 μg/ml) ung thư biểu mô – KB (IC50 = 128 μg/ml) - Dịch chiết n-hexane thân có hoạt tính dòng tế bào ung thư vú MCF7 (IC50 = 99.76 μg/ml) -Dịch chiết từ rễ hoạt tính với dòng tế bào ung thư thử nghiệm -Một số hợp chất n-butyl-α-D-fructofuranoside (SL8), thymidine (SL9) khơng thể hoạt tính chống ung thư với dòng tế bào - HepG2 , KB, MCF7, Lu (IC50 > 128 g/ml) 3.3.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật nấm kiểm định - Dịch chiết từ phận hoa, thân, rễ Cỏ chông hoạt tính kháng vi sinh vật nấm kiểm định (IC50>128 μg/ml) - Các hợp chất neomotienone (SL1), (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2yl)methanol (SL7), n-butyl-α-D-fructofuranoside (SL8), thymidine (SL9) hoạt tính 3.3.1.3 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH Dịch chiết từ phận hoa, thân, rễ hoạt tính chống oxy (EC50 > 128 μg/ml) 3.3.2 Cấu trúc hợp chất phân lập từ lồi Cỏ chơng Thứ tự Kí hiệu Tên chất Cấu trúc Dẫn xuất đường SL8 n-butyl-α-Dfructofuranoside 15 SL9 SL10 SL10A Thymidine 2,4-dimethoxyphenyl1-β-D-glucopyranoside 2,4-dimethoxyphenyl1-(2,3,4,6-tetra-Oacetyl-β-Dglucopyranoside) Terpennoid SL1 Neomotienone (chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên) Dẫn xuất glycerol SL2 SL7 Glycerol 1,2-di(9Z,12Zoctadecadienoate) 3dodecanoate (S)-(1,4dioxaspiro [4.5]decan-2yl)methanol (chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên) Ester alcol béo SL3 n-hexacosanyl acetate Sterol SL4 β-sitosterol 10 SL6 Daucosterol 16 11 SL5 Stigmasterol PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ CHẤT TIÊU BIỂU Neomotienone (SL1) (Chất lần phân lập từ thiên nhiên) Chất SL1 kết tinh từ phân đoạn đầu cột tổng cặn n-hexan hoa dạng tinh thể hình kim màu trắng Phổ IR cho đỉnh hấp thụ mạnh bước sóng (cm-1) 2946 (-CH alkan), 1695 (-C=O) Phổ (+)-ESI-MS cho peak ion giả phân tử m/z 425 [M+H]+ (21%), 447 [M+Na]+ (72%) phù hợp với công thức phân tử SL1 C30H48O, M= 424 Phổ 1H NMR cho tín hiệu doublet proton olefine δH 5.15 (1H, d, J = 6.0 Hz), tín hiệu methyl singlet δH 1.34; 1.12; 1.05; 1.04; 1.03, 0.74 với hai tín hiệu methyl doublet δH 0.94 (d, J = 6.5 Hz), 0.85 (d, J = 6.5 Hz) Ngồi có tín hiệu nhóm methylene (-CH2) methine (-CH) khoảng δH 2.71-1.14 ppm Phổ 13 C NMR DEPT cho tín hiệu triterpenoid qua tín hiệu cộng hưởng 30 carbon gồm nhóm xeton δC 217.78, hai carbon olefine δC 144.6 (=C); 118.2 (=CH), tám nhóm methyl δC 25.61; 25.56; 22.61; 22.50; 21.99; 20.98; 19.61; 18.70 ppm, năm carbon bậc bốn δC 47.65; 42.55; 40.52; 39.97; 38.65 ppm, năm nhóm methine δC 59.67; 52.31; 48.33; 45.99; 31.76 ppm nhóm methylene δC 35.74; 34.91; 34.11, 29.66, 28.58, 26.82, 26.02, 22.69, 20.04 ppm Số liệu phổ NMR gán sở phân tích số liệu phổ NMR chiều (HSQC, COSY HMBC) Hình 3.33 Các tương tác COSY (─) HMBC (→) chất SL1 17 Trên phổ COSY xuất tương tác proton olefin H-12 (δH 5.15 d, J = 6.0 Hz) với H11α (δH 2.19 m) H11β (δH 1.95 m), H2α (δH 2.69 m) với H1α (δH 2.10 m), H1β (δH 1.45 m) H2β (δH 2.33 td, 5.0; 14.5 Hz), H-18 (δH 2.14m) với H19β (δH 1.33 m), H16α (δH 1.95 m) với H15β (δH 1.27 m), H-22 (δH 1.49 m) với H-29 (δH 0.94, d, J = 6.5 Hz), H-30 (δH 0.85, d, J = 6.5 Hz) cho phép ghép nối mảnh H-11 - H-12, H-1 - H-2, H-18 - H-19, H-15 - H-16, H-22 - H-29 - H-30 Vị trí nhóm methyl 29-CH3, 30-CH3 khẳng định qua tương tác H-29 (δH 0.94 d, J = 6.5 Hz), H-30 (δH 0.85 d, J = 6.5 Hz) với C-21 (δC 59.67) C-22 (δC 31.76) phổ HMBC Vị trí nhóm methyl 26-CH3 khẳng định qua tương tác H-26 (δH 1.12 s) với C-7 (δC 29.66), C-9 (δC 48.34), C-14 (δC 42.55) Vị trí nhóm methyl 28-CH3 xác định qua tương tác H-28 (δH 0.74 s) với C-16 (δC 34.11) C-17 (δC 39.97 ), C-18 (δC 52.31), C-21 (δC 59.67) Vị trí nhóm methyl 25-CH3 khẳng định qua tương tác H-25 (δH 1.34 s) với C-1 (δC 35.74), C-5 (δC 45.99) C-9 (δC 48.34) Ngoài tương tác H-12 (δH 5.15 d, 6.0 Hz) với C-9 (δC 48.34), C-11 (δC 26.82), C-14 (δC 42.55) xác định vị trí nối đơi vòng Tương tác H16α (δH 1.95) với carbon bậc gắn gốc isopropyl (CH3)2CH- C-21 (δC 59.67) khẳng định cấu trúc neohopane chất SL1 Hình 3.35 Phổ HMBC vùng trường cao chất SL1 Hình 3.34 Phổ 1H 1H COSY chất SL1 18 Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR chất SL1 a C DEPT δa,bC δa,cH dạng pic (J = Hz) CH2 CH2 35.74 34.91 H1α: 2.10 m/H1β: 1.45 m H2α: 2.69 m H2β: 2.3 td (5.0; 14.5) C C CH CH2 217.78 47.65 45.99 20.04 10 11 CH2 C CH C CH2 29.66 40.52 48.34 38.65 26.82 12 13 14 15 CH C C CH2 118.26 144.60 42.55 26.02 16 CH2 34.11 17 18 19 C CH CH2 39.97 52.31 22.69 20 CH2 28.58 21 22 23 24 25 26 27 28 CH CH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 59.67 31.76 25.56 20.98 25.61 21.99 19.61 18.70 2.14 m H19α: 1.65 - 1.53 m H19β: 1.32 m H20α: 1.87 m H20β: 1.29 - 1.23 m 1.18 m 1.49 m 1.04 s 1.04 s 1.34 s 1.12 s 1.04 s 0.74 s 29 30 CH3 CH3 22.50 22.61 0.94 d (6.5) 0.85 d (6.5) 1.51 - 1.39 m H6α: 1.65 - 1.53 m H6β: 1.42 - 1.39 m 1.29 - 1.23 m HMBC (H→C) 3 COSY H1α, H1β,H2β 1.77 - 1.73 m 5, 8, 10 H11α: 2.19 m H11β: 1.97 m 5.15 d (6.0) 8, 9, 12, 13 H11β, H-9 9, 11, 14 H11α, H11β 14, 21 H16β, H15β H15α: 1.63 m H15β: 1.27 m H16α: 1.95 m H16β: 1.65 m đo CDCl3, b500 MHz, c125 MHz 19 H19β 17 17 H-29, H-30 3 1, 5, 7, 9, 14 16, 17, 18, 21 21, 22 21, 22 Số liệu chất SL1 có tương đồng với neomotiol (C-3 neomotiol gắn -OH) [155] Theo tài liệu tham khảo [156] cho thấy chất SL1 neomotienone Hợp chất bán tổng hợp từ neomotiol (năm 1965), chưa tìm thấy tài liệu phổ cơng bố Chất SL1 phân lập từ hoa cỏ chông chất lần phân lập từ thiên nhiên Các số liệu phổ NMR chất SL1 lần công bố Các hợp chất neohopane dạng hopane chuyển vị gặp có nhóm methyl (28-CH3) gắn với C-17 (các hopane thơng thường nhóm methyl gắn với C-18) (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2-yl)methanol (SL7) (chất lần phân lập từ thiên nhiên) Phổ 1H 13C NMR chất SL7 ghi hỗn hợp CDCl3 CD3OD cho tín hiệu phân tử glycerin tạo liên kết acetal qua tín hiệu cộng hưởng nhóm oxymethylene (-CH2-O-) δH 4.04 (1H, dd, J = 6.5; 11.5 Hz); 3.76 (1H, dd, J = 6.5; 8.5 Hz)/ δC 65.44 δH 3.66 (1H, dd, J = 4.0; 11.5 Hz); 3.59 (1H, dd, J = 5.0; 11.5 Hz)/ δC 62.94 với tín hiệu nhóm oxymethine δH 4.24 – 4.20 (1H, m)/ δC 75.7 ppm Mặc khác phổ HR-(+)ESI-MS xuất peak ion giả phân tử m/z 173.1173 [M+H]+ (95%) 195.0993 [M+Na]+ (80%) Tính tốn lý thuyết cho cơng thức phân tử C9H17O3 M = 173.1178, cho công thức C9H16O3Na M = 195.097 Như phần lại phân tử hợp phần C6H10 Trong số carbon lại có carbon acetal δC 109.91 ppm nhóm methylene (-CH2) δC 36.23; 34.62; 23.84; 23.62; 24.96 ppm phù hợp với tín hiệu phổ 1H NMR δH 1.65 – 1.54 (8H, m) 1.42 – 1.37 (2H, m) Điều cho thấy chất SL7 ketal cyclohexanon với glycerin Việc gán xác tín hiệu cộng hưởng proton H C–13 thực dựa việc phân tích phổ NMR chiều gồm HSQC, COSY, HMBC NOESY 20 Hình 3.40 Các tương tác COSY, HMBC NOESY (chính) chất SL7 Phổ COSY chứng minh có mặt hợp phần glycerol [HO─CH2─CH(OH)-CH2─OH] Trên phổ COSY cho thấy tín hiệu tương tác proton oxymethine H-2 (δH 4.24 – 4.20)/ H3α (δH 4.04); H3β (3.76); H1α (δH 3.66); H1β (δH 3.59) ghép nối mảnh cấu trúc H-1-H-2-H-3 hợp phần glycerol Hình 3.39 Phổ 1H NMR chất SL7 Hình 3.41 Phổ 1H 1H COSY chất SL7 Hình 3.42 Phổ HMBC chất SL7 Hình 3.43 Phổ NOESY chất SL7 21 Trên phổ HMBC cho tương tác H3α (δH 4.04)/ C-1’ (δC 109.91), C-1 (δC 62.94); H3β (δH 3.76)/ C-1 (δC 62.94), C-2 (δC 75.7), C-1’ (δC 109.91); H1α (δH 3.66)/ C-3 (δC 64.55), C-2 (δC 75.7); H1β (δH 3.59)/ C3 (δC 64.55), C-2 (δC 75.7) Ngồi thấy tương tác proton methylene vòng cyclohexane với carbon vòng Trên phổ NOESY thấy rõ tín hiệu tương tác proton gần không gian gồm tương tác H-2 (δH 4.24 – 4.20) với H3α (δH 4.04) H1β (δH 3.59), H3α (δH 4.04) với H3β (3.76); H1α (δH 3.66) với H1β (δH 3.59) Từ liệu phổ NMR chiều, chiều, phổ MS so sánh với tài liệu [161] cho phép khẳng định chất SL7 (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2yl) methanol Cấu hình tuyệt đối SL7 xác định (S) so sánh giá trị [α]D chất SL7 với tài liệu tham khảo khảo [161] Chất (S)-(1,4dioxaspiro [4.5]decan-2-yl)methanol có [α]D = - 4.2 (c 1.0, CHCl3), chất SL7 có [α]D = - 3.8 (c 1.0, MeOH) Chất SL7 dùng làm phụ gia cho nhiên liệu động [160] Ngoài theo tài liệu [161], SL7 sản phẩm phản ứng cyclohexanone glycerol Từ chất SL7 tổng hợp (R)-2,3-O-cyclohexylidene-D-glyceraldehyde, chất có hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh trung ương, có tác dụng điều trị bệnh trí nhớ Alzheimer (năm 2017) Chất SL7 lần phân lập từ thiên nhiên KẾT LUẬN Luận án đóng góp hiểu biết thành phần hóa học hoạt tính sinh học ba lồi: Hếp, Cóc đỏ Cỏ chơng Tổng cộng 28 hợp chất phân lập, có hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên Cấu trúc chất xác định việc phân tích kết hợp phổ IR, MS, HR-ESI-MS, NMR chiều, hai chiều so sánh với tài liệu Từ loài Hếp phân lập hợp chất có hợp chất lần phân lập từ loài gồm glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Zoctadecadienoate) (ST1), stigmasterol (ST3), n-tritriacontane (ST5), n-tetracosane (ST6), β-sitosterol (ST7), acid ursolic (ST8), daucosterol (ST9) hợp chất triterpenoid phân lập trước α- amyrin (ST2) myricadiol (ST4) 22 Từ lồi Cóc đỏ phân lập 12 hợp chất có hỗn hợp βsitosterol:stigmasterol (1:1) (CĐ1), dẫn xuất acetyl hóa 1,3-di-O-acetyl-2methyl-5-tridecylbenzene (CĐ2a), hexa-O-acetyl-D-mannitol (CĐ8a) hợp chất lần phân lập từ loài Cóc đỏ 1,3-dihydroxy-2-methyl-5tridecylbenzene (CĐ2), 1,3-dihydroxy-5-nonadecylbenzene (CĐ3), quercetin (CĐ4), β-sitosterol glycoside (CĐ5), astragalin (CĐ6), 1-O-acetyl-D-mannitol (CĐ7), D-mannitol (CĐ8), 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl-2’,3’,4’,6’tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (CĐ9); 1,3,4,5-tetra-O-acetylfructopyranose (CĐ10) Hợp chất 1-O-acetyl-D-mannitol (CĐ7) tìm thấy xạ khuẩn, chất lần phân lập từ thực vật Thành phần dịch chiết methanol cành Cóc đỏ đường D-mannitol (CĐ8) với hàm lượng cao (15.92 %), nguồn nguyên liệu tự nhiên để sản xuất đường thay cho bệnh nhân tiểu đường thuốc trị bệnh tăng nhãn áp Từ lồi Cỏ chơng phân lập 11 chất có chất lần phân lập từ thiên nhiên neomotienone (SL1) (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2-yl)methanol (SL7) với hợp chất lần phân lập từ lồi Cỏ chơng glycerol 1,2-di-(9Z,12Z-octadecadienoate)-3-dodecanoate (SL2), hexacosanyl-1-acetate (SL3), β-sitosterol (SL4), stigmasterol (SL5), daucosterol (SL6), n-butyl-D-frucrofuranoside (SL8); thymidine (SL9), 2,4-dimethoxyphenyl-1β-D-glucoside (SL10) sản phẩm acetyl hóa 2,4-dimethoxyphenyl-1-(2,3,4,6tetra-O-acetyl-β-D-glucopyran-oside) (SL10a) Luận án thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư (HepG2, MCF7, KB, Lu) loại cao chiết hợp chất từ loài Cỏ chông Hếp Kết cho thấy cao chiết hợp chất có hoạt tính yếu khơng có hoạt tính Luận án thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa kháng vi sinh vật kiểm định 12 loại cao chiết từ loài Cỏ chơng Cóc đỏ với hợp chất từ lồi Cỏ chơng Kết cho thấy cao chiết hợp chất có hoạt tính yếu khơng có hoạt tính 23 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Duong Van Anh, Pham Thi Huyen, Tran Van Sung, Do xuan Cam, Tran Thi Phuong Thao, The first phytochemical investigation of Scaevola taccada, a mangove plant collected in Ly Son island, Quang Ngai, Viet Nam, Tạp chí Hóa học, 2014, 52 (5), 659- 660 Pham Thi Huyen, Duong Van Anh, Do xuan Cam, Nguyen The Anh, Tran Van Loc, Tran Van Sung, Tran Thi Phuong Thao, Triterpens and phytosterols from Scaevola taccada collected in Ly Son island, Quang Ngai province, Viet Nam, Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (2), 235 - 239 Phạm Thị Huyền, Đào Đức Thiện, Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung, Trần Thị Phương Thảo, Thành phần hóa học Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) thu hái tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam, Tạp chí Hóa học, 2017, 55 (3), 281 Pham Thi Huyen, Tran Van Loc, Tran Van Sung, Tran Thi Phuong Thao, Chemical constituents of Spinifex littoreus collected in the coast of Quang Nam province, Viet Nam, Chemistry of Natural Compounds (đã chấp nhận đăng) 24 ... lập từ loài kể Đề tài: Nghiên cứu thành phần hố học thăm dò hoạt tính sinh học ba lồi thực vật ngập mặn vùng ven biển Việt Nam: Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) Cóc đỏ (Lumnitzera. .. trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú từ loài ngập mặn ven biển người dân sử dụng làm thuốc chưa nghiên cứu nhiều mặt hóa học hoạt tính sinh học, chúng tơi lựa chọn lồi vùng ngập mặn lồi Cỏ chơng... thác sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ loài ngập mặn Tuy nhiên Việt Nam cơng trình nghiên cứu thăm dò hoạt tính sinh học thành phần hóa học loài ngập mặn ứng dụng dân gian để làm thuốc