đề tài ứng dụng enzyme trong phân tích

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG ENZYME TRONG PHÂN TÍCH Danh sách nhóm phân cơng cơng việc STT Họ tên Lê Thị Hồi Thương MSSV 2008110262 Trần Thảo Nguyên Lại Thị Nga 2008110196 2008110187 Nhiệm vụ Tổng hợp Kế hoạch làm việc STT Tuần Ngày 03/03/201 10 11 22/03/201 29/03/201 05/04/201 19/04/201 26/4/2014 Thời gian, địa điểm 12h, phòng A301 Cơng việc Phân chia nhiệm vụ Nguyên: trang 325-327 Thương: trang 328-331 Nga: trang 332-336 Mọi người tự dịch 8h, ghế đá phòng CNSHTV Chỉnh dịch Nguyên 8h, ghế đá phòng CNSHTV Chỉnh dịch Thương 7h30, ghế đá phòng Chỉnh dịch Nga CNSHTV Ơn thi 7h, ghế đá trước cửa thư Tổng hợp + Chỉnh sửa viện + dịch số chỗ chưa rõ 9h, khu C trường Thảo luận lại + định dạng word + đánh dấu chỗ làm ppt (nếu có) Mụ c lụ c Lời mở đầu Enzyme chất xúc tác sinh học khơng có ý nghĩa q trình chuyển hóa trao đổi chất sinh vật mà ứng dụng rộng rãi lĩnh vực đời sống thực phẩm, y học, bảo vệ môi trường… Ngày nay, với phát triển xã hội với hiểu biết định người ta không ngừng tạo sản phẩm bổ ích ti ện dụng phục vụ cho đời sống, việc ứng dụng công nghệ enzyme minh chứng cụ thể Trong tiểu luận này, nhóm xin trình bày đề tài « Ứng dụng enzyme phân tích » để hiểu rõ ứng dụng enzyme Bài viết nhiều sai sót, nhóm mong nhận đóng góp ý kiến để rút kinh nghiệm cho lần sau Ứng dụng enzyme phân tích Phần mơ tả ngun tắc sử dụng enzyme phép đo phân tích, người đọc quan tâm lĩnh vực muốn có nhìn sâu s ắc phần chuyên khảo đặc biệt Thông thường, enzyme đ ược sử dụng chất bổ trợ việc xác định nồng độ c ch ất, ch ất ức ch ế ho ặc enzyme hoạt động phản ứng miễn dịch enzyme Phản ứng theo dõi phép đo quang học (thay đổi độ hấp thu, huỳnh quang, phát quang sinh học, nephelometry, turbidimetry) b ằng cách phát điện hóa (amperometry, potentiometry) nhi ệt lượng phương pháp phóng xạ Phản ứng enzyme sử dụng hóa học lâm sàng phức hợp huyến nước tiểu tính chọn lọc cao enzyme cho chất tự nhiên Một số phản ứng enzyme nhìn thấy trực tiếp (thơng qua suy giảm chất sản phẩm) Ví dụ, việc phát ện hóa c H 2O2 (tại +600mV với Ag/AgCl) oxi hóa ferrocene phản ứng glucose oxidase: β-D-glucose + O2 δ-D-gluconolactone + H2O2 Tuy nhiên, hầu hết dạng phản ứng không liên quan đến xúc tác c enzyme khơng dễ dàng đo Trong trường hợp này, s ản phẩm phải chuyển sang dạng đo cách thực kết h ợp hai phản ứng (có nghĩa thực thêm phản ứng phụ kết hợp v ới phản ứng chính) sử dụng phản ứng với thị đặc trưng Trong phản ứng thị để định lượng chất ta chuyển sản phẩm phản ứng dạng đ ể dàng đo nhanh chóng xác Đ ể th ực hi ện ều m ột cách “tuyến tính” , thơng thường sử dụng lượng lớn enzyme thị mức độ bão hòa cosubstrates coenzyme enzyme thị Các enzyme thông dụng dehydrogenas peroxidase Ví dụ phản ứng dehydrogenas: Reduced subtrate + NAD(P)+ oxidized subtrate + NAD(P)H + H+ Sự hình thành coenzyme khử (NADH NADPH) cho phép đo độ hấp thụ bước sóng 340nm, nơi mà coenzyme oxy hóa khơng hấp thụ Ví dụ phản ứng peroxidase: Reduced dye + H2O2 oxidized dye + H2O Phản ứng thị peroxidase sử dụng cho phản ứng enzyme sản xuất H 2O2 chủ yếu oxidase Peroxidase dạng đặc trưng cho H 2O2, phản ứng với thuốc thử hữu có trạng thái khác Ở dạng khử làm màu thu ốc th đ ồng th ời hấp thụ mạnh dạng oxy hóa Phản ứng kết hợp glucose oxidase peroxidase sử dụng “dry chemistry” g ọi thu ốc th enzyme đ ể đo hàm lượng glucose 1.1 Xác định nồng độ chất Sử dụng enzyme xác định nồng độ chất thực hi ện theo hai phương pháp: (1) phương pháp cố định thời gian (điểm đầu ểm cu ối) phương pháp động học (đo tốc độ phản ứng) Phương pháp cố định thời gian (điểm đầu điểm cuối) Xét trường hợp đơn giản nhất, người ta đo chuyển hóa gần hồn tồn chất enzyme xúc thông qua gi ảm n ồng đ ộ c ch ất ho ặc tăng nồng độ sản phẩm hấp thụ ánh sáng bước sóng xác định Thời gian cần thiết để chuyển hóa hồn tồn 99% chất xúc tác mạnh mẽ enzyme phụ thuộc vào tốc độ phản ứng cực đại (Vmax) số Michaelis (Km) enzyme sử dụng Phương pháp cố định thời gian cần thực khoảng th ời gian tương đối dài để chất chuyển hóa hồn tồn gần hồn tồn Theo phương pháp này, sử dụng trường hợp định lượng chất mà sử dụng xác định hoạt độ xúc tác enzyme trạng thái bão hòa enzyme phải trì suốt thời gian phản ứng Xác định glucose với glucose oxidase: Glucose oxidase (GOD, E.C.1.1.3.4) đến enzyme phân tích sử dụng rộng r ãi giới Hàng triệu bệnh nhân tiểu đường sử dụng ngày chủ yếu công cụ cảm bi ến sinh học cầm tay Để phát đường phương pháp quang học, glucose bị oxy hóa glucose oxidase hình thành hydrogen peroxide: β –D-glucose + O2 δ-D-gluconolactone + H2O2 Tiếp theo, hydrogen peroxide oxy hoá chromogen (chất tạo màu oxy hóa hợp chất hữu cơ) để tạo thành thuốc nhuộm với xúc tác horseradish peroxidase (E.C.1.11.1.7): H2O2 + chromogen dye + H2O 2,2’-Azino-bis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzthiazolsulfonate) [30931-67-0] (ABTS) tetramethylbenzidine (TMB) sử dụng chromogen Xác định urea: Urea bị thủy phân enzyme urease (E.C 3.5.1.5) amoniac tạo cho enzyme glutamate dehydrogenase (E.C.1.4.1.3) tác động Urea + H2O NH3 + CO2 2-Ketoglutarate + 2NH4+ + 2NADH → 2L-Glutamate + 2NAD+ + 2H2O Phản ứng đánh giá phương pháp đo quang phổ thông qua giảm nồng độ NADH bước sóng 340 nm Xác định tốc độ phản ứng Hạn chế phương pháp cố định thời gian tốn nhiều thời gian kể từ trước phản ứng phản ứng hoàn thành Ngoài ra, phương pháp tốn nhiều thuốc thử để loại bỏ ảnh hưởng c thành phần không mong muốn huyết đo đ ộ hấp th ụ ánh sáng Những vấn đề khắc phục cách xác định n ồng độ ch ất thông qua tốc độ phản ứng enzyme Việc xác định tốc độ phản ứng enzyme nồng độ thực liên tục Như phương trình (6.1), giả sử tốc độ phản ứng đạt khoảng 10% ta xác định tốc độ phản ứng ban đầu Khi n ồng đ ộ chất ban đầu thấp (