ứng dụng enzyme trong sản xuất phân hữu cơ sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG - - CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỀ TÀI ỨNG DỤNG ENZYME TRONG SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ SINH HỌC GVHD: Đỗ Thị Hiền TP HCM, tháng năm 2017 MỤC LỤC Mở đầu Hiện nay, phát triển nông nghiệp nước ta vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học loại nông dược nhằm mục đích khai thác, chạy theo suất sản lượng Nhu cầu phân bón năm nước ta từ 7.5 – triệu tấn, nhập đến 50% Việc sử dụng ngày nhiều phân hóa học làm cho đất đai ngày thoái hóa, dinh dưỡng bị cân đối, cân hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật đất bị phá hủy, tồn dư chất độc hại đất ngày cao, nguồn bệnh tích lũy đất nhiều dẫn đến phát sinh số dịch hại không dự báo trước Chính vậy, xu hướng quay trở lại nông nghiệp hữu với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học, phân bón hữu canh tác trồng xu hướng chung Việt Nam nói riêng giới nói chung Việc sử dụng phân bón hữu (hữu truyền, hữu sinh học, hữu cơ-khoáng, hữu vi sinh) giải vấn đề thoái hóa đất, tránh ô nhiễm môi trường mà mang lại suất kinh tế cao cho kinh tế nông nghiệp Phân hữu sinh học 2.1 Khái niệm phân hữu sinh học Phân hữu sinh học loại phân bón sử dụng trình lên men vi sinh vật để hoạt hóa than bùn (rác thải) trộn với phân bón hóa học (N, P, K), nguyên tố vi lượng, trung lượng chất điều hòa kích thích tăng trưởng cho trồng 2.2 Ưu nhược điểm phân hữu sinh học Ưu điểm - Giảm thiểu ô nhiễm - Diệt mầm bệnh nguy hiểm trình phân hủy sinh học, nhiệt độ có lên đến 70-80 oC làm tiêu hủy trứng, ấu trùng, nấm bệnh chất thải Phân sau ủ sử dụng an toàn phân tươi - Tăng độ ẩm cần thiết cho đất trồng, giảm thiểu rửa trôi khoáng chất thành phần vô không hòa tan phân Nhược điểm - Phần lớn vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn, đặc biệt ủ phân hữu không đồng thời gian, phương pháp, lượng ủ… Một số mầm bệnh tồn gây nguy hiểm cho người dùng - Thành phần phân ủ thường không ổn định chất lượng thành phần nguyên liệu đưa vào không đồng - Phải tốn thêm công ủ diện tích, việc ủ phân thường dạng thủ công lộ thiên tạo phản cảm mỹ quan phát tán mùi hôi 2.3 Nguyên liệu sản xuất phân hữu Nhóm phân động vật bao gồm phân gà, vịt, lợn, trâu bò, phân dơi v.v loại phân có hàm lượng dinh dưỡng cao phong phú Ngoài chất dinh dưỡng đa lượng đạm (N), lân (P2O5), kali (K2O) có chất canxi (Ca), magie (Mg), lưu huỳnh (S), silic (SiO2) (chất trung lượng) chất vi lượng đồng (Cu), kẽm (Zn), Mangan (Mn), sắt (Fe), Bo (B), Molipden (Mo), Coban (Co) Đây loại phân bón quý có thành phần hàm lượng dinh dưỡng cân đối đầy đủ Bằng công nghệ vi sinh tạo loại phân bón hữu tốt an toàn cho trồng môi trường đất Nhóm phụ phế phẩm nông nghiệp rơm rạ, vỏ trấu, thân lạc, đỗ, ngô, bã mía, vỏ cà phê, bã ép dầu đậu tương, đậu lạc (đậu phụng), bã thải sau trồng nấm, v.v… Các phụ phế phẩm có hàm lượng dinh dưỡng phong phú, dinh dưỡng dạng dễ tiêu trồng sử dụng dễ dàng Công nghệ xử lý nguyên liệu thành phân bón đơn giản, hướng dẫn cho nông dân ứng dụng cách dễ dàng Nhóm phân xanh bèo hoa dâu, lục bình (bèo tây), cốt khí, cúc quỳ (quỳ dại), điền thanh, vông, đậu mèo đen xanh (mucuna), koodzu, muồng loại có khả nhân sinh khối mạnh, hàm lượng dinh dưỡng cao, đạm dạng dễ tiêu trồng sử dụng dễ dàng Nhóm rong tảo biển, khai thác xử lý thành phân bón sinh học đơn giản hiệu Nhóm nguyên liệu với trữ lượng lớn thành phần dinh dưỡng đầy đủ, chủ yếu cung cấp đạm, lân, canxi chất vi lượng acid amin, chất kích thích sinh trưởng thực vật Nhóm vật liệu trầm tích, hóa thạch: Apatit, phosphorit, dolomite, zeolite., cacbonate canxi, cacbonate magie, silicate Các vật liệu chứa chất dinh dưỡng dạng khó tiêu, cần nghiền nhỏ bón cho trồng cải tạo đất dạng khoáng chất bổ sung, chất có hiệu lực tồn dư lâu dài, có vai trò cải tạo đất tốt Than bùn: Một loại trầm tích khác liệt vào dạng tài nguyên phong phú, nằm rãi rác nhiều vùng Trong phạm vi tỉnh miền Nam, kể đến vỉa than bùn ởrừng U Minh Thượng, U Minh Hạ (Kiên Giang), Đồng Tháp, Tây Ninh, Đồng Nai, Lâm Đồng tỉnh Tây Nguyên Than bùn có chứa hàm lượng hữu 35-57%, đặc biệt hàm lượng axit humíc, axít fulvic humin Vì hàm lượng N, P vào loại khá, kali Nhóm vỏ loài nhuyễn thể vỏ sò, nghêu, ốc vv cung cấp khoáng trung, vi lượng canxi, magie, lưu huỳnh, kẽm, sắt Các loại nguyên liệu chế biến đơn giản, nghiền sống nung lên nghiền nhỏ bón trực tiếp cho trồng Nhóm vỏ loài giáp xác: tôm, cua, ghẹ nhóm nguyên liệu việc cung cấp chất khoáng canxi, magie, kẽm, sắt, coban, cung cấp chất quan trọng chitosan Chất có vai trò chất kích kháng cho trồng, đồng thời hoạt chất sinh học hữu ích việc bảo vệ trồng chống lại số bệnh nấm, vi khuẩn, chí tăng tính kháng giúp trồng hạn chế xâm nhập phá hại virus gây bệnh Nhóm tro: tận dụng loại tro bếp tro sau đốt tàn dư thực vật để làm nguyên liệu cung cấp kali, silic 10 Nhóm mật rỉ đường: cung cấp dưỡng chất cho vi sinh vật phát triển, nhân mật sốcủa chúng quần thể để phân hủy chất hữu cơthành khoáng chất đơn giản dễ tiêu 11 Nhóm phân trùn: việc nuôi trùn để sản xuất thực phẩm giàu đạm cung cấp cho người, làm thức ăn gia súc, gia cầm tạo khối lượng sản phẩm phụ lớn phân trùn giàu dinh dưỡng hoàn toàn tự nhiên thân thiện với môi trường 12 Nhóm phụ phế phẩm lò giết mổ gia súc, gia cầm chế biến thủy sản: nhóm phụ phế phẩm phong phú đa dạng xương, lông, da, máu, đầu cá, xương cá, vây, ruột cá, nguyên liệu xử lý phương pháp lên men thủy phân với chủng vi sinh vật chức chuyên biệt để phân hủy protein, lipit thành amino acid có cấu trúc phân tử đơn giản mono-amino acid giúp trồng hấp thu dễ dàng, hấp thu qua Ngoài xác bã trình lên men tận thu cho vào ủ phân với nguyên liệu khác phụ phế phẩm nông nghiệp, phân xanh, nguyên liệu có nguồn gốc trầm tích, hóa thạch 2.4 Quy trình tổng quát sản xuất phân hữu sinh học Nguồn enzyme Nguyên liệu hữu (than bùn, chế phụ phẩm nông nghiệ Dinh dưỡng Phối trộn Xử lý sơ bộ, điều chỉnh độ ẩm, pH Đảo trộn Ủ Kiểm tra chất lượng Phân bón hữu sinh học Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sản xuất phân bón hữu giàu protein từ phế phẩm cá Labeo rohita nấm đột biến Aspergillus niger AB100 3.1 Tổng quan Vảy cá – phế phẩm ngành công nghiệp chế biến cá, thủy phân enzyme protease Aspergillus niger AB100 để sản xuất protein hòa tan, sử dụng làm phân bón hữu Các chất dinh dưỡng vô tối ưu tìm thấy là: MgSO 0.75%; K2HPO4 0.2%; Và KCl 0.075% A niger AB100 có FeSO4.7H2O (5 μg/ml) ZnSO4.7H2O (15 μg/ml) cho sản lượng protease cao Nồng độ tối ưu cho chất dinh dưỡng có hiệu kinh tế để sản xuất protease là: bã Bột đậu nành 0.2%; Peptone 0.3%; Ngô-rượu mạnh 0.2% Tăng trưởng sinh khối không liên quan đến tỉ lệ sản xuất enzyme hòa tan protein sản xuất protease cho thấy mối tương quan tốt với thủy phân tạo protein hòa tan Với tiến nhanh chóng xã hội, nhu cầu thực phẩm protein có chi phí thấp dần tăng lên Các sản phẩm chất thải từ ngành công nghiệp thực phẩm có nguyên liệu thô đề tài cho nhà nhà nghiên cứu khám phá nguồn protein phi thường Các nghiên cứu thực để sử dụng chất thải ngành công nghiệp chế biến thực phẩm nông nghiệp, gia cầm, thịt cá để thu nhận protein Hàng năm 100 triệu cá thu hoạch toàn giới, khoảng nửa số lượng đánh bắt loại bỏ rác thải chế biến Từ năm 1987 đến năm 1996, tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản là: Thế giới 148%; Ấn Độ 126% Trong trường hợp Labeo rohita – cá trôi Ấn Độ (chiếm 23,9% tổng sản lượng cá Ấn Độ) có 131% tăng sản xuất Ở loài này, kg cá tiêu thụ, 60g có chứa protein chủ yếu dạng collagen chất icthylpeden có Ca, Mg P với vết Na S10 bị lãng phí Một số quy trình khai thác thủy phân enzyme nghiên cứu để thu nhận protein từ cá Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thu nhận vi khuẩn protein từ cá Protease vi khuẩn thủy phân protein từ thực vật, cá động vật để thủy phân tiểu trình peptide xác định rõ ràng, chẳng hạn protease Bacillus amyloliquefaciens tạo protein hydrolysat giàu đạm methionine từ protein đậu xanh, protease alkaline Bacillus subtilis tạo protein tập trung từ lông vũ thải từ gia cầm, protease alkaline keratinolytic sử dụng công nghệ thức ăn cho sản xuất peptide từ chất thải keratin , Aspergillus niger Trichophyton simii sản xuất protein hòa tan từ chất thải da protease đột biến A niger Nghiên cứu trình bày hiệu chất dinh dưỡng khác chi phí, yêu cầu kim loại chất dinh dưỡng vô thiết yếu dòng đột biến A niger AB100 cho sản lượng protease cao sản xuất protein hòa tan từ phế phẩm cá 3.2 Vật liệu phương pháp 3.2.1 Vi sinh vật Loài A niger phân lập từ vùng Bắc-Bengal dùng ethylene-imine tia X (35 KV & 10 Ma) để tạo dòng đột biến A niger AB100 Giống đột biến nuôi cấy 15 hệ thạch agar Czapek dox Trong trình thí nghiệm, nuôi cấy chuyển đến môi trường agar trung bình mạch nha nấm men ủ 28°C ngày để có đủ bào tử Hệ thống huyền phù Spore thu cách rửa trượt 10 ml nước cất vô trùng lọc kết bào tử bào tử qua vài lớp cotton Mật độ điều chỉnh đến 1,4 x 107 bào tử/ml Dung dịch (5 ml) sử dụng mẫu cấy trình lên men 3.2.2 Chế biến cá Trong nghiên cứu này, vẩy cá L.rohita thu gom từ chợ rửa nước khử ion, sấy khô máy sấy học 12 100°C Sau đó, sau bổ sung lượng nước cất cần thiết (1g/ml nước), hấp chín 30 phút trước lên men Điều cần thiết biến tính cấu trúc collagen giúp hấp thu độ ẩm cải thiện khuếch tán enzyme bề mặt quy mô để tăng tính nhạy cảm cho trình thủy phân Sau hấp, vẩy làm khô máy sấy học sau nghiền nhỏ thành bột Vẩy nghiền (2,5 g) sử dụng thí nghiệm lên men 3.2.3 Điều kiện nuôi cấy Việc lên men nuôi cấy bề mặt tiến hành cách sử dụng bình tam giác 150 ml chứa 30 ml môi trường lên men (FM) bao gồm: glucose 0.05; Urê 0.025; MgSO 4.7H2O 0.01; KH2PO4, 0.01g/ml; vẩy cá chế biến 2.5 g; pH 4.0 Môi trường cấy ủ 28oC (± 0.5oC buồng ủ BOD) 14 ngày Dung dịch vô trùng MgSO 4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, KCl CaCl2 thêm riêng vào môi trường vô trùng giữ tất yếu tố liên tục ngoại trừ hiệu ứng điều tra Các dung dịch vô trùng kim loại vi lượng thêm vào riêng biệt với dung dịch glucose, urê, MgSO4.7H2O K2HPO4 Các hóa chất thu từ Qualigen Excelar phân loại tinh chế thêm từ nguyên tố vi lượng phương pháp chiết chloroform Trong phương pháp này, dung dịch nước cần thiết dung dịch trộn với 0,1 g 8-hydroxyquinone chloroform phễu tách, lần pH 5.2, sau pH 7.2 Các tạp chất hòa tan chloroform chiết Quá trình lặp lại hai pH khác Các dung dịch làm chloroform tự cách đun nóng bồn nước khử trùng riêng Các chất dinh dưỡng phức hợp thêm vào dung dịch vô trùng dựa hàm lượng chất rắn 3.2.4 Xác định hàm lượng Nitơ Hàm lượng Nitơ vẩy cá đo trước sau lên men phương pháp tiêu hoá micro-kjeldahl sửa đổi Tỷ lệ Nitơ hòa tan tính toán so sánh giá trị Nitơ quy mô bị suy thoái không bị suy thoái Hàm lượng chất đạm đạt cách nhân hàm lượng nitơ với hệ số 6,25 3.2.5 Thử nghiệm Enzyme Sau lên men, sợi nấm tách khỏi FM cách lọc qua Whatman no giấy lọc 0,5 ml dung dịch lọc pha loãng 1:10 dùng để xác định hoạt tính protease Hoạt tính enzym xác định quang phổ quang học cách sử dụng casein làm chất Một đơn vị hoạt động enzyme định nghĩa lượng enzyme giải phóng μ mole tyrosine/ml/phút điều kiện xác định 3.2.6 Ước tính Protein khối lượng sợi nấm khô Protein ước lượng phương pháp Lowry sử dụng chất thử Folin-ciacalteau albumin huyết bò theo tiêu chuẩn Các sợi nấm, tách từ rượu lên men cách lọc, rửa nước cất lọc lại lần qua phễu Buchner, sấy khô lò 24 80ºC 10 3.2.7 Phân tích thống kê Phân tích thống kê tất liệu thực theo phân phối t-student Mức độ quan trọng kiểm tra two-tail test xác định từ bảng với giá trị quan trọng t Số mẫu 6,0 (n = 6) Nồng độ MgSO4.7H2 O % 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 2.00 Độ hòa tan Trọng lượng Protein Hoạt độ protein khô nấm hòa tan Enzymea cá* g/100 ml FM units/ml/ % g/l 36.0 ± 3.00 5.10 1014.00 0.603 3.20 9.50 1280.00 40.7 ± 3.20 7.90 1186.00 0.266 3.25 7.00 1140.00 39.0 ± 3.30 5.20 1020.00 0.569 3.30 3.30 0910.00 38.0 ± 0.443 36.1 ± 0.326 33.9 ± 0.418 * = Value are expressed as mean ± standard error, n = a = protease activity was significantly different from each other (p < 0.001) Bảng 1: Ảnh hưởng MgSO4 7H2O 11 Hình 1: Ảnh hưởng KH2PO4 K2HPO4 Hình 2a: Ảnh hưởng NaCl 12 Hình 2b: Ảnh hưởng KCl Hình 2c: Ảnh hưởng CaCl2 3.3 Kết thảo luận 3.3.1 Ảnh hưởng MgSO4.7H2O Sự phát triển A Niger tỉ lệ thuận với hàm lượng Mg môi trường, có sulfat Nồng độ khác MgSO4.7H2O (0.5, 0.75, 1.0, 1.25 & 1.5%) kiểm tra 0.75% (Bảng 1) cho thấy sản sinh protease cao mức độ hòa tan dung dịch, có ý nghĩa (p