NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ DỨA THỦY PHÂN BỘT THỊT XƯƠNG ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ SINH HỌC VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC CỦA PHÂN TRÊN CÂY CẢI NGỌT

Để giải quyết vấn đề đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme bromelain từ vỏ dứa thủy phân bột thịt xương sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo sát hiệu lực của chế p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SINH HỌC VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC CỦA PHÂN

TRÊN CÂY CẢI NGỌT

Sinh viên thực hiện : HỒ VĂN CƯỜNG

Niên khóa : 2005 - 2009

Tháng 08/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SINH HỌC VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC CỦA PHÂN

TRÊN CÂY CẢI NGỌT

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS LÝ HỒNG PHÁT HỒ VĂN CƯỜNG

KS NGUYỄN THANH BÌNH

Tháng 08/2009

LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ đã sinh con ra, nuôi dạy con khôn lớn để con

có được ngày hôm nay Cảm ơn anh chị và những người thân trong gia đình đã yêu thương, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt những năm qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 PGS.TS Hùng Thanh Hùng, ThS Lý Hồng Phát, KS Nguyễn Minh Quang,

KS Nguyễn Thanh Bình đã luôn theo sát hướng dẫn, chỉ bảo em trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

 Quý thầy cô, các anh chị ở Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài

 Chú Chương, chú Hạp, anh Hưng ở hợp tác xã Dịch Vụ sản xuất rau an toàn Trãng Dài, Thành Phố Biên Hòa, Đồng Nai đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

 Các bạn Trần Quốc Dũng, Đỗ Minh Giang, Trương Công Phát, Nguyễn Thế Phương, Nguyễn Hùng Vương đã luôn kề vai sát cánh cùng tôi thực hiện đề tài

 Xin gởi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K31 cùng bạn bè thân hữu đã động viên, giúp đỡ và luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc vui buồn

Chân thành cám ơn!

HỒ VĂN CƯỜNG

TÓM TẮT

Ngày nay nhu cầu về lương thực, thực phẩm ngày càng gia tăng, kéo theo đó là nhu cầu về lượng phân bón cũng tăng theo Người nông dân vẫn có tâm lý quen sử dụng các loại phân hóa học để tăng năng suất các loại nông sản, chính điều này làm đã cho đất ngày càng bị chay cứng đi, gây ô nhiễm môi trường và chất lượng nông sản cũng giảm sút Mặt khác, giá thành của phân hóa học rất cao nên cũng gây khó khăn

cho người nông dân khi sử dụng Để giải quyết vấn đề đó, chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu ứng dụng enzyme bromelain từ vỏ dứa thủy phân bột thịt xương sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo sát hiệu lực của chế phẩm trên cây cải ngọt”

Đề tài được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009 tại bộ môn Nông Hóa - Thổ Nhưỡng, khoa Nông Học; Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường thuộc Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và Hợp Tác Xã Dịch Vụ sản xuất rau an toàn Trãng Dài, Tp Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai Mục đích của đề tài là nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất phân hữu cơ sinh học dạng lỏng bằng cách sử dụng enzyme bromelain thủy phân bột thịt xương, sau đó thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên cây cải ngọt

Nội dung thực hiện của đề tài bao gồm: Xác định thành phần đạm, lân, kali của nguyên liệu bột thịt xương bằng phương pháp Kjeldahl, Meyer, máy quang kế ngọn lửa; khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như tỉ lệ enzyme : cơ chất, thời gian, nhiệt độ, sau đó xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ sinh học dạng lỏng và khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên cây cải ngọt

Kết quả trong phòng thí nghiệm cho thấy: sử dụng dịch chiết enzyme bromelain thủy phân bột thịt xương cho hiệu quả cao nhất ở tỉ lệ 3 enzyme bromelain : 1 bột thịt xương, nhiệt độ thủy phân tốt nhất là 400C và thời gian thủy phân hiệu quả nhất là 24 giờ

Kết quả thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên cây cải ngọt ngoài đồng ruộng cho thấy: nồng độ chế phẩm cho năng suất cây cải ngọt tốt nhất là 3% Khi so sánh hiệu quả với các sản phẩm khác trên thị trường thì chế phẩm hữu cơ sinh học cho năng suất cây cải ngọt cao hơn một số sản phẩm cùng loại trong nước nhưng còn kém hơn so với một số sản phẩm nhập khẩu từ Hoa Kỳ

SUMMARY

Today, the demand for food is increasing, this make the demand for fertilizers has also increased Farmers still familiar with the using of chemical fertilizers to increase productivity of agricultural products, this leading to the land has to be bad, polluting the environment and quality of agricultural products is declining On the other hand, the cost

of chemical fertilizers is very high, it also makes many difficulties for farmers to use it To solve the problem, we caried out the thesis: Research applications enzyme bromelain from pineapple shell hydrolysis bone and meat meal to produced biological organic fertilizers

and studying its effect on the Brassica chinensis”

The thesis was carried out at Agricultural Chemistry - soil, Agronomy Faculty; Research Institute of Biotechnology and Enviromental Technology, Nong Lam University, Ho Chi Minh city and Service co-operative vegetable production safety Trang Dai ward, Bien Hoa city, Dong Nai province from February to July, 2009

The purpose of this thesis is established production processes biological organic fertilizer by using the enzyme bromelain hydrolysis bone and meat meal, and then

studying its effect on the Brassica chinensis

The content of this thesis include: identifying the protein, phosphorus, potassium

of materials by Kjeldahl, Meyer, machine flame photometer method; finding factors which affecting to the hydrolysis as the ratio of enzyme and the substance, the time, the temperature, then building manufacturing process of biological organic fertilizer

and studing its effect on the Brassica chinensis

We got the results : the ratio of enzyme bromelain and meat bone meal give most effective is 3:1, the most suitable temperature of hydrolysis is 400C, the time of hydrolysis give the most effect is 24 hours On the farm, using the biological organic

fertilizer with 3% concentration give the highest productivity of Brassica chinensis

When comparing with others on the market show that: our product give productivity of

Brassica chinensis higher than several same products which was produced inside

country but lower than several products which was imported from the USA

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về bột thịt xương 3

2.1.1 Nguồn gốc bột thịt xương 3

2.1.2 Quy trình chế biến bột thịt xương 3

2.1.3 Ứng dụng 4

2.2 Tổng quan về enzyme Protease 5

2.2.1 Giới thiệu chung về protease 5

2.2.2 Phân loại protease 5

2.2.3 Protease thực vật 6

2.2.4 Giới thiệu về enzyme bromelain 7

2.2.4.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu 7

2.2.4.2 Đặc điểm enzyme bromelain 8

2.2.4.3 Tính chất enzyme bromelain 8

2.2.4.4 Ứng dụng enzyme bromelain 11

2.3 Giới thiệu phân hữu cơ sinh học 11

2.3.1 Định nghĩa 11

2.3.2 Tác dụng của phân hữu cơ sinh học 11

2.3.3 Phân bón lá 12

2.3.3.1 Phân bón lá là gì 12

2.3.3.2 Ưu điểm của phân bón lá 12

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 12

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 14

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 16

3.2 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 16

3.2.1 Vật liệu 16

3.2.2 Hóa chất 16

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 16

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Chuẩn bị nguồn nguyên liệu 16

3.3.2 Nội dung 1: Xác định thành phần nguyên liệu 17

3.3.3 Nội dung 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 17

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ tối ưu của cơ chất và enzyme 17

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian thủy phân tốt nhất 18

3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ thủy phân tốt nhất 18

3.3.4 Nội dung 3: Khảo sát hiệu quả của chế phẩm trên cây cải ngọt 19

3.3.4.1 Thí nghiệm 4: Khảo sát nồng độ sử dụng thíc hợp của chế phẩm 19

3.3.4.2 Thí nghiệm 5: So sánh hiệu quả của chế phẩm với một số sản phẩm khác 20

3.4 Xử lý số liệu 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Xác định thành phần nguyên liệu và hoạt tính enzyme 22

4.1.1 Thành Phần bột thịt xương 22

4.1.2 Hoạt tính dịch chiết enzyme bromelain 22

4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 23

4.2.1 Xác định tỷ lệ tối ưu của enzyme và cơ chất 23

4.2.2 Xác định thời gian thủy phân tốt nhất 24

4.2.3 Xác định nhiệt độ thủy phân tốt nhất 25

4.3 Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên cây cải ngọt 29

4.3.1 Khảo sát nồng độ sử dụng thích hợp của chế phẩm 29

4.3.2 So sánh hiệu quả chế phẩm với một số chế phẩm khác 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

NT Nghiệm thức

RCBD Randomized Completely Blok Design TLTB Trọng Lượng Trung Bình

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Hoạt tính phân giải cơ chất tự nhiên và tổng hợp của bromelain 9

Bảng 2.2 Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của bromelain thân 10 Bảng 4.1 Thành phần dinh dưỡng trong bột thịt xương 22

Bảng 4.2 pH và hoạt tính của dịch chiết bromelain 22

Bảng 4.3 N tổng số của dịch thủy phân ở các mức enzyme và cơ chất khác nhau .23

Bảng 4.4 N tổng số của dịch thủy phân ở các mức thời gian khác nhau .24

Bảng 4.5 N tổng số của dịch thủy phân ở các mức nhiệt độ khác nhau .25

Bảng 4.6 Hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu và sản phẩm sau thủy phân .27

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm lên chiều cao, số lá của cây cải ngọt 28

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm lên năng suất và dư lượng nitrate .29

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của các chế phẩm lên chiều cao, số lá của cây cải ngọt 30

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của các chế phẩm lên năng suất và dư lượng nitrate 31

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Bột thịt xương 3

Hình 2.2 Sơ đồ phát thảo quy trình chế biến phụ phẩm giết mổ 4

Hình 2.3 Quả dứa giống Queen .7

Hình 4.2 Sản phẩm sau thủy phân 27

Hình 4.3 Cây cải ngọt 31

Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm 4 19

Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm 5 20

Sơ đồ 4.1 Các bước thu nhận chế phẩm hữu cơ sinh học dạng lỏng 27

Trước tình hình đó, chúng ta cần sớm ứng dụng một số giải pháp bền vững cho nông nghiệp, trong đó phải chú trọng sử dụng phân hữu cơ, đặc biệt là phân hữu cơ sinh học Ở nước ta, việc sản xuất phân hữu cơ sinh học có rất nhiều thận lợi vì giá thành đầu tư rất thấp nhờ tận dụng các phế phẩm trong nông nghiệp cũng như các phụ phẩm của ngành chế biến thực phẩm, chăn nuôi nhờ vậy giá thành sản phẩm tạo ra cũng rất thấp Thực tế cho thấy, khi sử dụng các loại phân hữu cơ, ngoài việc cung cấp dinh dưỡng, cải thiện các đặc tính lý - hóa - sinh học của đất còn giúp phòng và trị bệnh trên cây trồng, giảm chi phí sản xuất, góp phần hướng tới xây dựng, phát triển một nền nông nghiệp an toàn và bền vững

Dựa trên hiện trạng thực tế và nhu cầu cấp thiết, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng enzyme bromelain từ vỏ dứa thủy phân bột thịt xương sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo sát hiệu lực của chế phẩm trên cây cải ngọt”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng quy trình sản xuất phân hữu cơ sinh học dạng lỏng từ bột thịt xương

có hiệu quả cao mà không phải sử dụng hoá chất

Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên đồng ruộng

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Xác định thành phần nguyên liệu bột thịt xương Mục đích là để so

sánh hàm lượng dinh dưỡng của các chỉ tiêu phân bón trong dịch thu được sau thủy phân với nguyên liệu ban đầu

Nội dung 2: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột thịt

xương bằng dịch chiết enzyme bromelain Mục đích là xây dựng quy trình sản xuất phân hữu cỏ sinh học dạng lỏng bằng cách thủy phân bột thịt xương

Nội dung 3: Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên đồng ruộng Mục đích là tìm

ra nồng độ chế phẩm cho hiệu quả cao nhất để đưa vào khuyến cáo trong sản xuất rau an toàn và sau đó so sánh hiệu quả của chế phẩm với một số sản phẩm trên thị trường

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bột thịt xương

2.1.1 Nguồn gốc bột thịt xương

Bột thịt xương được chế biến từ thân thịt gia súc, gia cầm không dùng làm thực phẩm cho người hoặc từ các phế phẩm khác nhau của lò mổ Thành phần dinh dưỡng của bột thịt xương thường không ổn định, phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu chế biến

Tỉ lệ protein trong bột thịt xương 30 - 35 %, khoáng 12 - 35 %, mỡ 8 – 15 % Giá trị sinh học protein bột xương cũng biến động và phụ thuộc vào tỷ lệ các mô liên kết trong nguyên liệu Tỉ lệ mô liên kết càng nhiều, giá trị sinh học của protein càng thấp (Nguyễn Văn Thưởng và Sumilin, 1992)

2.1.2 Quy trình chế biến bột thịt xương

Phụ phẩm sau khi được thu gom về sẽ được nghiền đến một kích thước ổn định rồi chuyển đến nồi nấu Nồi này có thể là dạng nồi nấu liên tục hoặc dạng nồi nấu theo từng mẻ Quá trình nấu thường là sử dụng hơi nước có nhiệt độ 240-2900F (khoảng 115-1450C) trong thời gian 40-90 phút tùy thuộc vào hệ thống máy móc và loại nguyên liệu Phần mỡ tan chảy sẽ được tách ra khỏi phần thịt và xương, đồng thời phần lớn lượng nước trong nguyên liệu được rút ra ngoài Điều quan trọng nhất là công đoạn nấu ở nhiệt độ cao này đã làm bất hoạt các loại vi khuẩn, virus, protozoa và

ký sinh trùng mỡ được tách khỏi nguyên liệu nấu bằng thiết bị ép xoắn bằng một nồi

Hình 2.1 Bột thịt xương

(http://www.ecvn.com/root/offerUpload.jpg;

http://novatechcorp.com/Images/Products/55_image1.jpg)

kín sau khi nấu và tách mỡ, phần còn lại bao gồm protein, khoáng và một phần mỡ còn sót lai sẽ được xử lý tiếp để làm giảm thấp hơn nữa độ ẩm của sản phẩm Sau đó sản phẩm dạng khô này được nghiền rồi chuyển sang kho bảo quản hoặc vận chuyển

đi nơi khác Bột protein thường được bảo quản trong các thùng chứa lớn hoặc trong tòa nhà kín (David L.Meeker, 2006; trích dẫn bởi Vũ Chí Cương và ctv, 2007)

Hình 2.2 Sơ đồ phác thảo qui trình chế biến phụ phẩm giết mổ (Hamilton, 2004) 2.1.3 Ứng dụng bột thịt xương

Bột thịt xương được dùng chủ yếu trong chế biến thức ăn chăn nuôi, đây là nguồn nguyên liệu thức ăn mang tính chiến lược vì nó có chứa protein và phốt pho với hàm lượng cao nhưng giá cả tương đối rẻ Theo số liệu thống kê, tình hình nhập khẩu bột thịt xương ở nước ta đạt khoảng 210 ngàn tấn/năm với giá trị khoảng 90 triệu USD Lượng bột thịt xương này được nhập về nhiều nhất từ Italia đạt khoảng 52 ngàn tấn với giá nhập khẩu trung bình 365 USD/tấn; tiếp đến Achentina đạt 32 ngàn tấn, giá nhập khẩu trung bình đạt 464 USD/tấn; Mỹ đạt trên 22 ngàn tấn với giá 656 USD/tấn (http://cnts.hua.edu.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=599&Itemid=261)

Ngoài ra, với hàm lượng chất dinh dưỡng cao và giá thành rẻ, nhiều nghiên cứu

đã ứng dụng bột thịt xương trong sản xuất phân bón hữu cơ phục vụ cho nông nghiệp Hiện nay, nhiều sản phẩm phân bón trên thị trường như Growmore, Humix,

Agrostim.v.v đều sử dụng nguyên liệu này trong quy trình sản xuất và chúng được xem là nguồn đạm chính cung cấp cho cây trồng

2.2 Tổng quan về enzyme Protease

2.2.1 Giới thiệu chung về Protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa) và động vật (gan, dạ dày bê) (http://svdanang.com/@pbk/showthread.php?t=17432)

2.2.2 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4), protease được phân chia thành hai loại là endopeptidase và exopeptidase

Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase

được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia

thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelain, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

2.2.3 Protease thực vật

Protease thực vật tập trung chủ yếu ở một số cây vùng nhiệt đới như đu đủ, dứa, cây sung, artichoke và đậu tương Tất cả protease thực vật đều cùng thuộc một nhóm enzyme chứa gốc –SH trong tâm hoạt động

a Enzyme papain từ mủ đu đủ: trung bình mỗi 1kg mủ đu đủ chứa khoảng 200g

papain thô, mỗi cây thu được khoảng 0,45 kg mủ Để giữ hoạt tính của protease, người

ta thường tiến hành thu nhận enzyme thô ngay tại nơi khai thác mủ đu đủ Papain có

MW 21.000 Da, dài 159 amino acid, có 3 cầu nối disulphide, cysteine có mặt trong tâm hoạt động, nguyên tử oxy tự do (H2O2, O2) và ion kim loại nặng (Hg2+, Fe3+ và

Cu2+) là tác nhân ức chế hoạt tính papain Ngược lại, lại hoạt hóa papain Enzyme

papain hoạt động ở pH tối ưu 6,5-7,8 trên cơ chất hemoglobin

b Enzyme ficin từ quả sung: Quả sung chứa hàm lượng protease khá cao tương ứng

khoảng 100-150 mg Tuy nhiên, do ficin không bền về nhiệt nên trong quá trình sấy phần lớn hoạt tính của nó bị mất Ficin là glycoprotein có MW 26.000 Da, tâm hoạt

động của nó giống papain, pH tối ưu đối với Casein là 6,7

c Enzyme bromelain từ dứa: Trong dứa có 2 dạng đồng phân protease bromelain

giống nhau Hiện bromelain kĩ thuật chủ yếu được thu nhận từ thân dứa (stem

bromelain) Trong nước dứa chứa hoạt tính bromelain cũng rất cao Bromelain sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, để chữa vết thương, để ổn định dịch lên men bia v.v Bromelain có MW 33.000 Da, là một loại glycoprotein, enzyme hoạt động ở

pH tối ưu đối với hemoglobin và casein là 6,0-8,0 với nhiệt độ tối ưu là 50-55OC

(Nguyễn Tiến Thắng, 2004)

2.2.4 Giới thiệu về enzyme bromelain

2.2.4.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu

Cây dứa (Ananas) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromecliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas Comusus

Dứa được trồng nhiều nhất ở các tỉnh phía Nam, chiếm 75,43 % tổng diện tích trồng dứa của cả nước, trong đó các tỉnh ĐBSCL chiếm 69,36 % diện tích dứa cả nước Những tỉnh có diện tích trồng dứa lớn nhất là Kiên Giang, Tiền Giang, Hậu Giang, Cà Mau, Bạc Liêu, Cần Thơ, Sóc Trăng, Thanh Hóa, Bắc Giang, Phú Thọ v.v Sản lượng hàng năm đạt khoảng 260.509 tấn, trong đó Miền Bắc 45.373 tấn, Miền Nam 215.136 tấn, riêng ĐBSCL có 204.031 tấn, chiếm 78,31 % sản lượng dứa cả nước Năng suất bình quân cả nước đạt 13,7 tấn/ha, trong đó Miền Bắc 10,5 tấn/ha, các tỉnh đồng bằng sông cửu long 15,2 tấn/ha)

Dứa được sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzyme và ngoài ra còn được sử dụng trong một số lĩnh vực khác như dược, mỹ

Hình 2.3 Quả dứa giống Queen

(http://www.tiengiangdost.gov.vn; http://images.google.com.vn/

imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3b/

Ananas_comosus_Victoria_P1190421.jpg &imgrefurl=http://common)

phẩm v.v Phần thân, chồi và lá sau khi thu hoạch quả và phần phụ phẩm sau khi chế biến có thể được sử dụng để chế biến thức ăn cho gia súc hoặc là nguồn thu nhận enzyme bromelain làm giấy sợi hoặc làm phân bón (xác bã trái ủ 1 năm có chứa khoảng 12,7 % N; 0,09 % P2O5;0,18 % K2O làm nguồn phân hữu cơ rất tốt) Sau khi ép lấy nước, bã trái dùng chế biến thức ăn gia súc (1 tấn trái cung cấp 30

kg thức ăn thô, thân cây dứa có chứa nhiều tinh bột là nguồn thức ăn tốt cho gia súc (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2000)

2.2.4.2 Đặc điểm enzyme bromelain

Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật, gọi chung là nhóm enzyme thực vật chứa nhóm –SH, có khả năng phân giải protein, đặc biệt là ở cây dứa (thân, chồi, trái, vỏ)

Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelain thân hay bromelain quả,

và bromelain thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa, bromelain có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau Bromelain chiếm 50 % protein trong quả dứa Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6 -

8, trọng lượng phân tử 33.000 Da (lớn gấp 1,5 lần so với papain) Thịt quả có hoạt tính enzyme bromelain kể từ ba tháng trước khi chín, trong đó hoạt tính enzyme cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín Khi trái chín, hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.4.3 Tính chất enzyme bromelain

Bromelain được chiết tách từ các phần khác nhau trên cây dứa và bromelin từ những nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau Bromelin không ổn định với nhiệt độ, do đó các hoạt động sinh

lý của nó sẽ giảm đi nếu như quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản không thích hợp (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

a Cấu tạo hóa học của bromelain

Bromelain là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chổ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử glucan gồm 3 manose, 2 glucoamin, 1 xylose và một fructose Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelain thân và bromelain quả thì tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác nhau Bromelain có thành phần

amino acid thay đổi trong khoảng 321 - 144 amino acid và bromelain quả là 283 - 161

amino acid Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là

valine và ở đầu cacbonhydrate là glycin, còn bromelain quả có amino acid ở đầu amin

là alanin (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

b Cấu trúc không gian của bromelain

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp

xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:

Ser - Val – Lys – Asn – Gln – Asn - Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp -

- Gly - Cys – Lys – Bromelain là một loại protease trong tâm hoạt động có chứa cystein và hai sợi

polypeptid liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu do có cách

sắp xếp phức tạp (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

c Tính chất vật lý bromelain

Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu

cơ Cũng như papain, bromelain hoạt động tốt nhất ở pH trung tính, nhiệt độ 700C Vì

tâm hoạt động của bromelain có chứa nhóm –SH nên dễ dàng bị ức chế bởi các chất oxi

hóa như H202, metyl bromua, ion kim loại.v.v và được hoạt hóa bởi các chất khử

(cystein, sunfit, bisunfit, cyanid) (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

d Hoạt tính của bromelain

Bromelin có 3 hoạt tính khác nhau: peptidaz, amidaz và esteraz Bromelain thân

có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp

Bảng 2.1 Hoạt tính phân giải cơ chất tự nhiên và cơ chất tổng hợp của bromelain

BAA: Benzoyl-L-Arginin amid

Hoạt tính phân giải (UI/mg)

Cơ Chất

Bromelin Thân

Bromelin quả xanh

Bromelin quả chín

BAA (Cơ chất tổng hợp) 3,7 9,1 7,2

Bảng 2.2 Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau * của bromelain thân

* : Ở nhiệt độ 5 0 C và pH 6,0; BAA: Benzoyl-L-Arginine amide; BAEE : Benzoyl-L-Arginine ethyl ester; BAEM : Benzoyl-L-Arginine methyl ester

Bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và bromelain quả chín So với BAA, hằng số xúc tác của bromelain thân trên BAEE cao hơn gấp 140 lần (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

e Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain

Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch

Ảnh hưởng của cơ chất lên hoạt tính enzyme bromelain: Trên những loại cơ

chất khác nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelin mạnh hơn papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelin tương tự như papain Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy giải của bromelin yếu hơn papain (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme bromelain: Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme Ở dịch chiết enzyme (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến

60oC thì bromelain vẫn còn hoạt tính nhưng bromelain tinh khiết thì nhạy với nhiệt độ cao.Quá trình sấy thăng hoa làm mất hoạt tính enzyme 27 % (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme bromelain: pH là yếu tố quan trọng

nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt Biên độ pH khá rộng từ 3–10, nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5 - 8 (tùy cơ chất) (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Cơ chất tổng hợp

Ảnh hưởng bởi các ion kim loại lên hoạt tính enzyme bromelain: Các ion kim loại có

ảnh hưởng đến hoạt tính của enzim do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ của muối Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn

có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.4.4 Ứng dụng của enzyme bromelain

Bromelain là một chất trợ tiêu hoá, vì nó hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột non Bromelain có tác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa bệnh viêm khớp (A F Walker và ctv, 2002), do đó, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain như chất làm giảm đau, kháng viêm và kháng sưng Bromelain như một tác nhân điều chỉnh miễn dịch, làm giảm lượng prostaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm (Christian R Engwerda và ctv, 2001) Ngoài ra, bromelain còn được sử dụng như một tác nhân làm mềm thịt (trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Điền, 2005)

2.3 Giới thiệu phân hữu cơ sinh học

2.3.1 Định nghĩa

Phân hữu cơ sinh học (HCSH) là loại phân được chế biến từ các nguyên liệu có nguồn gốc hữu cơ với quy trình chế biến được áp dụng bằng các tác nhân, hoặc bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học nhằm nâng cao chất lượng và hiệu lực của phân thương phẩm

Phân hữu cơ sinh học có dạng rắn và dạng lỏng, có loại dùng cho bón dưới đất và có loại dùng xịt trên lá (bón phân qua lá) Ngoài ra, phân hữu cơ sinh học phải đảm bảo các chỉ tiêu về an toàn vệ sinh thực phẩm và an toàn về môi trường (Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

2.3.2 Tác dụng của phân hữu cơ sinh học

Phân HCSH Cung cấp ngay lượng mùn hữu cơ cho đất để bổ sung lượng mùn đã bị khoáng hóa do các hoạt động của vi sinh vật; cung cấp các chất dinh dưỡng cho cây trồng, vừa là các dinh dưỡng dẫn xuất từ các nguyên liệu hữu cơ, vừa được tổng hợp hoặc chuyển hóa do sự hoạt động của các vi sinh vật cố định đạm, vi sinh vật chuyển hóa lân được cấy vào trong sản phẩm theo quy trình sản xuất Ngoài ra, mùn hữu cơ còn

có khả năng giữ lại chất dinh dưỡng nhờ làm tăng thêm dung tích hấp thu của đất, giảm thiểu sự rửa trôi ảnh hưởng đến môi trường, giảm thiểu sự mất dinh dưỡng dẫn đến giảm thiểu chi phí phân bón Việc tận dụng các nguyên liệu hữu cơ và áp dụng công nghệ sinh

học để chế biến làm phân bón sẽ đóng góp tích cực về việc giải quyết vấn nạn ô nhiễm môi trường do các phụ phẩm và chất thải gây ra (Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

2.3.3 Sơ lượt về phân bón lá

2.3.3.1 Phân bón lá là gì

Phân bón lá là loại chế phẩm dùng để cung cấp trực tiếp chất dinh dưỡng cho cây thông qua cách phun lên các phần trên bề mặt của cây (lá, cuống, hoa, trái) với mục đích nâng cao sự hấp thu dinh dưỡng qua các phần trên không của cây trồng (http://www.humixvn.com/ferrtilizer)

2.3.3.2 Ưu điểm của phân bón lá

Việc sử dụng phân bón lá có ưu điểm là chất dinh dưỡng được cung cấp cho cây nhanh hơn bón gốc, hiệu suất sử dụng dinh dưỡng cao hơn phân hóa học nhưng chi phí lại thấp hơn và ít ảnh hưởng đến môi trường và đất trồng.Theo số liệu đã được công bố, hiệu suất sử dụng chất dinh dưỡng qua lá đạt tới 95 %

Thời điểm phun phân bón lá tốt nhất là vào lúc khí khổng đang mở, ở nhiệt

độ dưới 30oC, trời không nắng, không mưa, không có gió khô; phân bón lá chỉ phát huy tác dụng khi cung cấp đủ nước, phân qua rễ Thời gian phun tốt nhất là vào lúc 9-10 giờ sáng và 2-3 giờ chiều về mùa đông, 7 - 8 giờ sáng hoặc 5 – 6 giờ chiều về mùa hè (http://www.arowana.com.vn/forum/f200/ky-thuat-nuoi-trong-va-cham-soc-cattleya -5428-15.html)

Sử dụng phân bón lá được xem là phương pháp bón phân bổ túc hoặc dùng chữa trị các bệnh sinh lý thực vật do sự xáo trộn hoặc thiếu chất dinh dưỡng, làm ảnh hưởng đến các chất kích thích tố trong cây, ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ của hệ thống rễ và

sự phát triển của cây Ngoài ra, phân bón lá dưới hình thức hỗn hợp chất lân còn giúp cho cây chịu đựng được một số vấn đề như hạn hán, bệnh tật và mật độ cây cao

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ lâu người dân đã biết sử dụng phân hữu cơ phục vụ cho sản xuất nông nghiệp Phần lớn phân hữu cơ có nguồn góc từ phế phẩm của ngành nông nghiệp, công nghiệp và có công nghệ sản xuất đơn giản nên chi phí đầu tư ban đầu rất thấp Việc sản xuất phân hữu cơ, một mặt vừa giúp cải thiện tình trạng ô nhiễm môi trường, mặt khác vừa giảm chi phí nông nghiệp do giảm được nguồn phân hóa học nhập khẩu khá đắt tiền Nguồn phụ phẩm trong nông nghiệp cũng như chất thải công nghiệp là rất

lớn, nếu biết tận dụng triệt để để phục vụ trở cho nền nông nghiệp nước nhà thì sẽ có ý nghĩa rất lớn và mang lại hiệu quả kinh tế cao

Ở Vĩnh Phúc, Công ty Cổ phần công nghệ sinh học đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ than bùn, phân thải chăn nuôi, phế thải nông nghiệp giúp tăng năng suất cây trồng và tạo ra sản phẩm nông nghiệp an toàn Loại phân bón này còn có tác dụng cải tạo đất, làm cho đất tơi xốp, bổ sung lượng lớn vi sinh vật hữu ích cho đất, giúp cây trồng hấp thụ tối đa chất dinh dưỡng, chống ô nhiễm môi trường, tạo ra sản phẩm nông nghiệp an toàn (http://www.vast.ac vn/index.asp?fcid=2&progid=21002&newsid=1858)

Ở nhiều tỉnh ven biển nước ta, ngư dân thường dùng các loại cá vụn, các phần bỏ

đi trong quá trình chế biến cá làm thực phẩm, phơi khô để làm phân bón hoặc trộn với than bùn để làm phân bón Theo Hiệp hội phân bón Việt Nam cá khô làm phân chứa 47,61 % chất đạm, 5,92 % chất béo, 2,78 % chất xơ, 39,08 % chất khoáng và 3,08 % muối khoáng, cho thấy bột cá làm phân bón có chứa thành phần chất đạm và chất khoáng rất cao, đặc biệt là có chứa nhiều loại axít amin như Lysine, Alanine, Arginine, Cystine, Glycine, Isoleucine, Proline, Threonine, Tryosine, Histidine v.v (http://agriviet.com/nd/ 1449-phan-huu-co-sinh-hoc-hc5-bot-ca-va-maxi-bot-ca/)

Trung tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Cộng Đồng Nông Thôn (thuộc Hội làm vườn Việt Nam) đã thử nghiệm sản xuất thành công một loại phân bón mới Trên cơ

sở phân lập, tuyển chọn các chủng sẵn có trong nước, nhóm nghiên cứu đã pha chế, tổng hợp được chế phẩm sinh học đa chủng BIOVAC dạng khô với thành phần nguyên liệu là cám gạo, cám ngô, đậu tương, mật mía, một số khoáng chất vi lượng, bột cá,

bột xương và các chủng men vi sinh Với chế phẩm BIOVAC (gồm các chủng Bacillas

Subtilus, Lactobaccillus Rhammossus, Bacillus Polymyxa v.v đề tài đã được một bước

quan trọng trong quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đa chủng, rút ngắn được 2/3 thời gian so với phương pháp ủ truyền thống của nông dân Đánh giá chất lượng phân, các số liệu phân tích của Trung tâm phân tích môi trường cho thấy thành phần dinh dưỡng cao nhất là mùn hoai mục chiếm 82-84 %, axít Humix chiếm 2,51 %, P205 tổng

số 0,28 % (dễ tan 0,13 %), K20 tổng số chiếm 0,06 %, nitơ tổng số chiếm 0,5 % (http://vst.vista.gov.vn/home/item_view?objectPath=home/database/an_pham_dien_tu/nong_thon_doi_moi/2004/2004_00011/MItem.2004-08-06.4819/MArticle.2004-08-06.5546)

Nguyễn Xuân Hiền (2003) đã nghiên cứu mô hình sản xuất phân hữu cơ từ vỏ, hột nhãn Kết quả Thử nghiệm của Trung tâm kỹ thuật đo lường chất lượng III đối với thành phần bột nhãn cho kết quả rất khả quan: Hàm lượng nitơ 1,3 %, P2O5 0,5 %, K20 0,9 % và hàm lượng chất hữu cơ lên tới 75,8 % (http://www.bentre.gov.vn/index.php? option=com_content&task=view&id=2721&Itemid=88)

Năm 2005, Dương Văn Viễn và Võ Thị Gương đã hợp tác với một số nhà khoa học ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học cùng với sự hỗ trợ của Dự án Vườn ươm công nghệ và Công ty Phân bón Hóa chất Cần Thơ đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu, sản xuất phân hữu cơ vi sinh từ

bã bùn mía” Từ bã bùn mía; xác mía, nhóm nghiên cứu xử lý thành phân hữu cơ và cấy một số vi sinh vật có ích tạo thành phân hữu cơ vi sinh, có khả năng phòng trừ bệnh sinh học và hỗ trợ dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo độ phì nhiêu của đất (http://vndgkhktnn.vietnamgateway.org/news.php?newsid=50610083256)

Nguyễn Thị Nhi (2008), Đai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu

sử dụng enzyme bromelain từ thân dứa thủy phân bánh dầu đậu nành để sản xuất phân hữu

cơ sinh học Chế phẩm tạo thành ó hàm lượng chất dinh dưỡng tương đối cao, sử dụng rất

an toàn trên cây cải và cho năng suất không thua gì các chế phẩm khác trên thị trường

Hiện nay, viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa, Viện khoa Học Công Nghệ Miền Nam, viện nghiên cứu Cao Su, viện nghiên cứu Nông Lâm Nghiệp, Tây Nguyên, nhiều trung tâm khoa học, khuyến nông đã và đang nghiên cứu ứng dụng và phát triển phân hữu cơ sinh học, nhiều công ty phân bón trong nước như công ty Thiên Sinh, công ty Thiên Nông đã sản xuất phân hữu cơ vi sinh, hữu cơ sinh học, sinh hóa trên nền than bùn phục vụ cho nhiều đối tượng cây trồng với sản lượng hàng ngàn tấn/năm

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1995, Iizuka và ctv đã nghiên cứu phương pháp sản xuất phân bón hữu cơ bằng cách sử dụng đầu cá ngừ làm nguyên liệu thô, trong nghiên cứu này Iizuka đã sử dụng enzyme từ vi khuẩn và thử nghiệm bổ sung phân hữu cơ này trong môi trường nuôi hạt phấn cây trà Kết quả thí nghiệm cho thấy phân này đã làm tăng tốc độ tăng trưởng 180% so với hạt phấn cây trà trồng trong môi trường nuôi cấy đối chứng (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nhi, 2008)

Connell (2006) đã nghiên cứu việc chuyển đổi các chất thải hữu cơ từ cá và các loại thực vật ở biển và động vật thành dạng bột ổn định mà không sử dụng nhiệt độ

cao Chất thải từ cá tươi được nghiền và sau đó được thủy phân để tạo thành một dịch thủy phân Dịch thủy phân được ổn định bằng cách thêm acid và được đun để tách dầu

mỡ và nước để tạo thành một bánh sản phẩm Bánh này được chuyển sang một máy trộn để trộn dinh dưỡng nhằm tạo thành một sản phẩm thô Sản phẩm thô này được sấy khô trong một máy sấy khô vận tốc cao (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Màng, 2008)

Lee và Lian (2006) đã xây dựng quy trình sản xuất sinh học dịch thủy phân từ các phụ phẩm trong quá trình chế biến mực để làm phân bón hữu cơ mà không sử dụng hóa chất mà chỉ sử dụng enzyme nội sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nhi, 2008)

Việc sử dụng thường xuyên phân hoá học sẽ làm chai hoá đất, làm đất bị suy kiệt dinh dưỡng và về lâu dài sẽ gây hiện tượng thoái hoá đất làm cho đất không còn khả năng cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Vì vậy sử dụng nguồn phân hữu cơ không những khắc phục được những mặt trái của phân vô cơ mà còn góp phần cải tạo đất, làm tăng độ phì của đất và tạo điều kiện thuận lợi cho hệ vi sinh vật đất phát triển Do đó việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng phân hữu cơ một cách hợp lý và khoa học là việc làm cần thiết, vừa đảm bảo vệ sinh môi trường nông thôn vừa nâng cao năng suất, chất lượng các loại sản phẩm cây trồng, hạn chế việc sử dụng phân phân hoá học Nhận thức được tình hình đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sản xuất phân hữu cơ dựa vào nguồn nguyên liệu sẵn có là vỏ dứa và bột thịt xương Đây là nguồn nguyên liệu rất dồi dào và giá thành rẻ, hướng nghiên cứu này không những nhằm giải quyết vấn đề về nhu cầu phân bón mà còn giảm bớt tình trạng ô nhiễm môi trường đang diễn ra trầm trọng như hiện nay

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2009 - 7/2009 tại Viện Nghiên Cứu Công nghệ sinh học - Môi trường; Bộ môn Nông Hóa – Thổ Nhưỡng Khoa Nông Học, trường ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh và Hợp Tác Xã Dịch Vụ sản xuất rau an toàn, Phường Trãng Dài, Tp Biên Hoà, Tỉnh Đồng Nai

3.2 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

Hóa chất dùng xác định P2O5 dễ tiêu: P–Nitrophenol 0,25%, NaOH 10%,

Amoniummolypdate, acid ascorbic, chuẩn Phosphor 2ppm Hóa chất dùng xác định đạm NO3-: Acid phenoldisulfonic, NaOH 10%, chuẩn NO3- 100ppm Hóa chất dùng xác định đạm NH4+: Seignette 50%, dung dịch Nessler (HgCl2 + KI), dung dịch chuẩn

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm

Cách thu dịch enzyme bromelain thô như sau: Vỏ dứa được rửa sạch, cắt nhỏ và

nghiền bằng máy tạo thành dịch đồng thể, lọc bằng vải và vặn, ép lấy dịch chiết thô

Ly tâm dịch chiết thô này ở 4.000 vòng/phút, 4oC, 30 phút Sau khi ly tâm, thu lấy phần dịch trong, sau đó đem bảo quản ở tủ lạnh

3.3.2 Nội dung 1 Xác định các thành phần của nguyên liệu

Mục đích: Để so sánh hàm lượng dinh dưỡng của các chỉ tiêu phân bón trong

dịch thu được sau thủy phân với nguyên liệu ban đầu

Các thành phần theo dõi: Đạm tổng số được xác định bằng phương pháp

kjeldahl; lân tổng số được xác định bằng phương pháp Meyer; kali tổng số được xác định bằng phương pháp quang kế ngọn lửa; đạm amin được xác định bằng phương pháp formol

3.3.3 Nội dung 2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột thịt bằng dịch enzyme bromelain thô

Mục đích: Xây dựng qui trình thu nhận phân bón lá hữu cơ sinh học dạng lỏng bằng cách thủy phân bột thịt xương

3.3.3.1 Thí nghiệm 1 Xác định tỉ lệ tối ưu của cơ chất và lượng enzyme bromelain từ

vỏ dứa bổ sung vào quá trình thủy phân

a Mục đích thí nghiệm chọn tỉ lệ enzyme sử dụng có hiệu quả cao nhất trong quá

trình thủy phân

b Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên (CRD) và lặp lại 3 lần theo 6 nghiệm thúc, trong đó lượng cơ chất bột thịt xương được cố định là 10 g và lượng enzyme bromelain bổ sung tăng dần: 10 ml,

20 ml, 30 ml, 40 ml, 50ml, 60 ml

1 cơ chất (10 g bột thịt xương) : 1 bromelain (10ml)

1 cơ chất (10g bột thịt xương) : 2 bromelain (20ml)

1 cơ chất (10g bột thịt xương) : 3 bromelain (30ml)

1 cơ chất (10g bột thịt xương) : 4 bromelain (40ml)

1 cơ chất (10g bột thịt xương) : 5 bromelain (50ml)

1 cơ chất (10g bột thịt xương) : 6 bromelain (60ml)

c Cách tiến hành thí nghiệm Cân 10 g bột thịt xương cho vào bình tam giác, cho

lượng enzyme bromelain vào đúng tỉ lệ đã bố trí ở trên Tiến hành thủy phân ở điều kiện 500C trong 24 giờ trong máy lắc điều hòa nhiệt độ Đến thời gian đã cố định kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy trong 30

phút, để nguội và ly tâm 4.000 vòng/phút trong thời gian 20 phút Sau cùng là hút dịch trong ở trên để phân tích các chỉ tiêu phân bón Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng đạm tổng số (xác định theo phương pháp Kjeldahl)

3.3.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân

a Mục đích thí nghiệm Xác định lượng thời gian cho hiệu quả thủy phân cao nhất

b Bố trí thí nghiệm Đây là thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên (CRD) và lặp lại 3 lần với các nghiệm thức có thời gian thủy phân là 6 giờ;

10 giờ; 15 giờ; 20 giờ; 24 giờ và 30 giờ

c Cách tiến hành thí nghiệm Cân 10 g bột thịt xương cho vào bình tam giác,

bổ sung enzyme bromelain vào đúng tỷ lệ được chọn ở thí nghiệm 1 Tiến hành thủy phân với các mốc thời gian như trên, ở điều kiện 500C trong máy lắc điều hòa nhiệt độ Đến thời gian đã cố định của các nghiệm thức kết thúc quá trình thủy phân Đem bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy trong 30 phút, để nguội và ly tâm 4.000 vòng/phút trong thời gian 20 phút Sau cùng là hút dịch trong ở trên để phân tích các chỉ tiêu phân bón Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng đạm tổng số (được xác định theo phương pháp Kjeldahl)

3.3.3.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên quá trình thủy phân

a Mục đích thí nghiệm Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để đạt hiệu quả

thủy phân cao nhất

b Bố trí thí nghiệm Đây là thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên (CRD) và lặp lại 3 lần với các nghiệm thức có nhiệt độ thủy phân là 380C;

400C; 420C; 450C; 480C; 500C; 520C và 550C

c Cách tiến hành thí nghiệm Cân 10 g bột thịt xương cho vào bình tam giác, bổ

sung enzyme bromelain vào đúng tỉ lệ được chọn ở thí nghiệm 1, tiến hành thủy phân ở điều kiện nhiệt độ đã được bố trí với các mức độ như trên trong máy lắc điều hòa nhiệt độ với khoảng thời gian được chọn từ thí nghiệm 2 Đến thời gian

đã cố định của các nghiệm thức kết thúc quá trình thủy phân Đem bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy trong 30 phút, để nguội và ly tâm 4.000 vòng/phút trong 20 phút Sau cùng là hút dịch trong ở trên để phân tích các chỉ tiêu phân bón Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng đạm tổng số (được xác định theo phương pháp Kjeldahl)

3.3.4 Nội dung 3 Khảo nghiệm hiệu quả chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng trên cây cải ngọt

3.3.4.1 Thí nghiệm 4 Khảo sát nồng độ sử dụng thích hợp của chế phẩm phân hữu cơ

sinh học dạng lỏng trên cây cải ngọt

a Mục đích thí nhiệm Chọn ra nồng độ sử dụng thích hợp đưa vào khuyến cáo sử

dụng trong sản xuất rau an toàn

b Bố trí thí nghiệm Đây là thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên

(RCBD), lặp lại 3 lần theo các nghiệm thức có nồng độ chế phẩm là 1 %, 3 %,5% và 7 %

L0: Đối chứng phun nước

chế phẩm tại HTX Dịch Vụ rau an toàn, Đồng Nai

c Cách tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ trên, với diện tích mỗi

ô thí nghiệm là 5 m2, tổng diện tích của thí nghiệm là 75 m2; đất được xới đều, sau đó bón lót thêm 5 kg phân chuồng hoai và 100g NPK/ô; khoảng cách giữa các hàng là 0,15 m

và giữa các cây là 0,15 m; Chiều rộng luống 1 m, cao 20 cm, rãnh luống rộng 30 cm; phun phân ở các thời điểm 3 ngày và 10 ngày sau trồng; tiến hành theo dõi 10 cây/ô

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Trọng lượng tươi (g): Loại bỏ đất, lá hư cắt rễ, sau đó đem cân

- Số lá trên cây (lá): Đếm số lá trên cây (không tính những lá quá nhỏ)

- Chiều cao cây (cm): Đo từ gốc đến lá dài nhất

- Dư lượng NO3- (mg/kg): Xác định bằng phương pháp Grandvan - Liaz

LLL1

LLL2 LLL3

30 cm ↨

1 m

- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) = (trọng lượng trung bình của cây (g) x số cây/ha)

- Năng suất thực thu (tấn/ha) = (trọng lượng cây của ô thu hoạch x 10.000)/diện tích của mỗi ô

3.3.4.2 Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu quả của chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng

lỏng với các sản phẩm thương mại trên thị trường trên cây cải ngọt

a Mục đích thí nghiệm: So sánh hiệu quả về mặt năng suất và tính an toàn của chế

phẩm phân hữu cơ sinh học với các sản phẩm trên thị trường

b Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu

nhiên (RCBD), 3 lần lặp lại

Nghiệm thức I0: Đối chứng phun nước

Nghiệm thức I1: Phun chế phẩm phân HCSH (Nồng độ chọn từ thí nghiệm 4)

Nghiệm thức I2: Phun phân Growmore (Phun theo hướng dẫn sử dụng)

Nghiệm thức I3: Phun phân Agrostim (Phun theo hướng dẫn sử dụng )

Nghiệm thức I4: Phun Bolas (phun theo hướng dẫn sử dụng)

Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả các loại

chế phẩm tại HTX Dịch Vụ rau an toàn, Đồng Nai

b Cách tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ trên, với diện

tích mỗi ô thí nghiệm là 5 m2, tổng diện tích của thí nghiệm là 75 m2; đất được xới đều, sau đó bón lót thêm 5 kg phân chuồng hoai và 100 g NPK/ô; khoảng cách giữa các hàng là 0,15 m và giữa các cây là 0,15 m; Chiều rộng luống 1 m, cao 20 cm, rãnh luống rộng 30 cm; phun phân ở các thời điểm 3 ngày và 10 ngày sau trồng; tiến hành theo dõi 10 cây/ô

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Trọng lượng tươi (g): Loại bỏ đất, lá hư cắt rễ, sau đó đem cân

- Số lá trên cây (lá): Đếm số lá trên cây (không tính những lá quá nhỏ)

LLL1

LLL2 LLL3

30 cm ↨

1 m

- Chiều cao cây (cm): Đo từ gốc đến lá dài nhất

- Dư lượng NO3- (mg/kg): Xác định bằng phương pháp Grandvan - Liaz

- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) = (trọng lượng trung bình của cây (g) x số cây/ha)

- Năng suất thực thu (tấn/ha) = (trọng lượng cây của ô thu hoạch x 10.000)/diện tích của mỗi ô

3.4 Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý ANOVA bằng phần mềm MSTATC 1.2 (1991), Các đồ thị được vẽ bằng phần mềm Excel 2007

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định các thành phần của nguyên liệu và hoạt tính enzyme

4.1.1 Thành phần của bột thịt xương

Viêc xác định thành phần cơ chất luôn đóng một vai trò quan, nó quyết định nguồn nguyên liệu này có thích hợp để sử dụng vào mục đích nghiên cứu hay không Vói cơ chất là bột thịt xương, có thành phần luôn biến đổi do phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu chế biến, nhưng nhìn chung đây là nguồn cơ chất có hàm lượng dinh dưỡng cao do được chế biến từ phụ phẩm của ngành giết mổ động vật (bảng 4.1)

4.1.2 Hoạt tính của dịch chiết enzyme bromelain thô

Sau khi ly trích dịch bromelain, thể tích dịch enzyme thu được là 0,56 lít/kg vỏ dứa Như vậy, lượng dịch enzyme thu được là tương đối cao so với trọng lượng tươi, điều này cho thấy vỏ dứa là nguồn nguyên liệu rất có tiềm năng để sử dụng trong sản xuất phân hữu cơ sinh học Dịch bromelain này sau đó được xác định pH và hoạt tính (bằng phương pháp Anson)

Bảng 4.2 pH và hoạt tính của dịch chiết enzyme bromelain

Enzyme bromelain có 3 hoạt tính xúc tác khác nhau là peptidase, amidase và esterase và có khả năng thủy phân khá mạnh (tương đương với papain từ mủ đu đủ) nên rất thích hợp để sử dụng bromelain trong sản xuất phân hữu cơ sinh học Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ sử dụng enzyme dạng lỏng để tiến hành thủy phân vì việc chuyển enzyme từ dạng lỏng sang dạng rắn phải tốn nhiều chi phí và mất nhiều thời gian Hơn nữa, việc tinh sạch enzyme cũng làm mất một phần hoạt tính nên sẽ không có lợi khi sử dụng Việc dùng enzyme dạng lỏng còn có ưu điểm nữa là trong dịch bromelain có chứa một lượng các chất dinh dưỡng, khi tiến hành thủy phân sẽ bổ sung vào chế phẩm, góp phần làm tăng thêm giá trị của chế phẩm

4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột thịt xương bằng dịch enzyme bromelain thô

4.2.1 Xác định tỉ lệ tối ưu của cơ chất và lượng enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân

Việc xác định tỉ lệ enzyme bổ sung vào cơ chất một cách hợp lý rất có ý nghĩa

trong việc thủy phân nhằm làm cho quá trình thủy phân đạt hiệu quả cao nhất, hạn chế lãng phí nguồn enzyme và cơ chất, và đây là việc đầu tiên phải làm trong việc xây

dựng quy trình thủy làm phân bón

Bảng 4.3 Hàm lượng đạm tổng số và dịch thu được ở các mức tỉ lệ cơ chất

Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy hàm lượng đạm tổng số của các nghiệm thức có

sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê Với một lượng cơ chất như nhau, khi tỉ

lệ enzyme bổ sung tăng lên thì lượng dịch thu được cũng tăng theo, đồng thời hàm lượng đạm giảm dần Điều này có thể là do enzyme bromelain ở dạng lỏng có chứa nước, khi lượng bromelain bổ sung vào tăng dần thì lượng nước cho vào cũng tăng theo, chính lượng nước này làm cho thể tích dịch sau thủy phân tăng lên làm loãng dịch thủy phân, vì vậy hàm lượng đạm thu được sẽ giảm dần Dịch thu càng cao thì hàm lượng đạm càng thấp, điều này thể hiện qua hàm lượng đạm tổng số của các nghiệm thức ngày càng giảm dần

Lượng dịch thu được và hàm lượng đạm tổng số là cơ sở để chọn ra nghiệm thức cho hiệu quả cao nhất Ở tỉ lệ 1:1 thì hàm lượng đạm thu được cao nhất nhưng lượng dịch thu được rất thấp Hơn nữa, bột thịt xương ở dạng khô nên hút rất nhiều nước (hệ số khô kiệt bột thịt xương là 1,05), khi bổ sung enzyme với tỉ

lệ 1:1 thì lượng nước cho vào cũng thấp Lượng nước có tác dụng làm dung môi xúc tác cho phản xứng xảy ra nên khi bổ sung không đủ sẽ gây khó khăn cho việc tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất và làm quá trình thủy phân xảy ra không hoàn toàn Với tỉ lệ này nếu áp dụng ở quy mô công nghiệp sẽ không cho hiệu quả cao

và gây lãng phí nguồn cơ chất Ở tỉ lệ 1:2 và 1:3 cho kết quả đạm tổng số tương đối cao và không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê, nhưng thể tích dịch thu ở tỉ

lệ 1:3 cao hơn gần gấp đôi nên xét về tính hiệu quả sẽ có lợi hơn Mặt khác, chi phí cho nguồn cơ chất luôn cao hơn so với nguồn enzyme nên cần tính toán sao cho sử dụng lượng cơ chất thấp mà vẫn có hiệu quả Việc bổ sung enzyme bromelain vào cơ chất với tỉ lệ cao hơn không mang lại hiệu quả mà còn làm tiêu tốn nhiều enzyme, không có lợi về mặt kinh tế Vì vậy chúng tôi chọn tỉ lệ 1:3 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.2.2 Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Mỗi phản ứng thủy phân đều có một thời gian tối ưu, việc xác định thời gian tối ưu cho quá trình thủy phân luôn đóng một vai trò hết sức quan trọng, quyết định đến hiệu quả thủy phân Với thời gian thích hợp thì enzyme hoạt động tốt nhất làm phản ứng xảy ra triệt để hơn và lượng sản phẩm tạo ra là cao nhất, mặt khác cũng tránh được hoạt động của vi sinh vật gây hại làm giảm chất lượng của sản phẩm nếu như để quá lâu

Bảng 4.4 Hàm lượng đạm tổng số của dịch sau thủy phân

ở các mức thời gian khác nhau

Thời gian (giờ) N tổng số (%)

Trong cùng một hàng, các số có cùng chữ cái giống nhau thì

khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P < 0,05

Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy hàm lượng đạm tổng số của các nghiệm thức

có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê Khi thời gian thủy phân càng dài thì hàm lượng đạm cũng tăng và đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức 24 giờ và 30 giờ Thời gian thủy phân từ 24 giờ trở về sau thì hàm lượng đạm có tăng nhưng rất thấp và không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê Điều này có thể giải thích như sau: lúc đầu hàm lượng đạm tăng nhanh là do enzyme cần thời gian tiếp xúc với cơ chất để phản ứng xảy ra, sau một thời gian lượng cơ chất giảm dần nên mức độ enzyme tiếp xúc với cơ chất sẽ thấp hơn làm phản ứng xảy ra chậm lại Theo kết quả trên thì thời gian thủy phân 24 giờ sẽ cho hiệu quả cao nhất, sau 24 giờ hàm lượng đạm có tăng nhưng rất thấp (0,01%) Việc chọn thời gian thủy phân 24 giờ còn có thuận lợi là thời gian thủy phân ngắn hơn so với nghiệm thức

có thời gian thủy phân 30 giờ nên có thể rút ngắn được quy trình thủy phân, điều này rất có ý nghĩa về mặt kinh tế Vì vậy chúng tôi chọn thời gian thủy phân là 1 ngày để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Bên cạnh pH thì nhiệt độ là một yếu tố rất quan trọng góp phần quyết định để quá trình thủy phân xảy ra hoàn toàn, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme nên sẽ ảnh hưởng đến quá trình xúc tác Vì vậy, việc tìm ra nhiệt độ tối ưu là hết sức cần thiết cho mỗi phản ứng thủy phân

Bảng 4.5 Hàm lượng đạm tổng số của dịch sau thủy phân

Trong cùng một hàng, các số có cùng chữ cái giống nhau thì khác

biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P <0,05

Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy hàm lượng đạm tổng số của các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê Ở các mức nhiệt độ khác nhau thì enzyme có hoạt tính xúc tác khác nhau Điều này cũng cho thấy enzyme bromelain không ổn định theo nhiệt độ, ở nhiệt độ 400C enzyme bromelain cho kết quả thủy phân cao nhất Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhi, 2008 Nguyễn Thị Nhi đã kết luận rằng, nhiệt độ tối ưu để thủy phân bánh dầu đậu nành bằng dịch bromelain thô sản xuất phân hữu cơ sinh học là 400C Bên cạnh nhiệt độ thì pH cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thủy phân Trong nghiên cứu này, chúng tôi không khảo sát ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân vì theo qui định của Chương trình Hữu cơ quốc gia Hoa Kỳ (National Organic Program), việc sản xuất phân bón hữu cơ sinh học không được bổ sung bất cứ hóa chất nào trong quy trình sản xuất Do đó, trong quá trình thử nghiệm, chúng tôi không điều chỉnh pH để có thể đáp ứng đầy đủ và thỏa mãn các yêu cầu về tính an toàn của phân bón lá hữu cơ sinh học mặc dù chất lượng phân bón có thể bị giảm Vì vậy nhiệt độ chúng tôi chọn để tiến hành thủy phân là

400C và không điều chỉnh pH

Sau khi đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột thịt xương bằng dịch chiết bomelain thô, chúng tôi tiến hành sản xuất phân hữu cơ sinh học

ở quy mô phòng thí nghiệm với mức tỷ lệ, thời gian và nhiệt độ như đã xác định ở trên (tỉ lệ cơ chất: enzyme là 1:3; thời gian thủy phân 24 giờ; nhiệt độ 400C )

Chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng

Sơ đồ 4.1 Các bước thu nhận chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng

Hình 4.2 Sản phẩm sau thủy phân a: Bã rắn; b: Dịch lỏng

(Ảnh chụp tại Trung Tâm Phân Tích)

Với quy trình sản xuất phân hữu cơ như sơ đồ 4.1 trên,chúng tôi thu được dịch thủy phân và sau đó tiến hành theo dõi các thành phần về đạm, lân, kali, kết quả thu được sẽ đem so sánh với thành phần của cơ chất ban đầu (bảng 4.6)

Bảng 4.6 Hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu ban đầu và sản phẩm sau thủy phân

Các số liệu trong bảng là kết quả ba lần lặp lại và tính trên trọng lượng chất khô.

Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy hàm lượng dinh dưỡng của dịch sau thủy phân

tương đối cao: thành phần đạm, lân, kali ổn định (tỉ lệ N:P:K là 1,31:2,08:0,59); đạm

amin và NH4+ khá cao, đây là loại đạm mà cây có thể sử dụng trực tiếp nên rất thuận

lợi cho cây sử dụng Hàm lượng đạm tổng số ở dịch thu được (1,29 %) thấp hơn mức

khảo sát ban đầu (1,47 %), nguyên nhân là do khi thủy phân với quy mô lớn thì việc

tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất khó khăn hơn nên hiệu suất thủy phân sẽ giảm và

lượng đạm thất thoát sẽ nhiều hơn

Hàm lượng lân trong dịch thu được thấp hơn rất nhiều so với nguồn cơ chất

ban đầu, nguyên nhân là do lân có nhiều trong xương mà bromelain là một

protease, nó chỉ thủy phân tốt các liên kết peptide trên những cơ chất giàu đạm mà

thôi, điều này thể hiện qua hàm lượng lân còn lại trong bã rắn rất cao Lượng kali

thu được cũng tương đối cao, một phần là do quá trình thủy phân cơ chất tạo ra,

một phần là do kali có sẵn trong dịch enzyme (0,59 %) bổ sung vào, điều này

cũng là một thuận lợi trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm mà không cần bổ

sung thêm kali từ nguồn nguyên liệu khác

Việc sử dụng enzyme bromelain thủy phân bột thịt xương cho kết quả tương đối

cao nhưng chưa thật sự đạt yêu cầu vì hàm lượng các chất còn lại trong bã rắn còn rất

nhiều Sử dụng enzyme dạng lỏng có nhược điểm là rất khó điều chỉnh được lượng

enzyme và lượng nước bổ sung nên cũng gây khó khăn cho cho việc tính toán sử dụng

lượng enzyme phù hợp với quá trình thủy phân Dịch bromelain có môi trường axit

(pH=3,95) nên sau khi thủy phân thu được dịch có pH khá thấp (4,4), đây cũng là một

giới hạn của chế phẩm Tuy nhiên, chế phẩm dùng để phun trực tiếp lên cây nên ảnh

hưởng của pH là không lớn lắm, cây có thể.hấp thu chất dinh dưỡng qua lá và ít ảnh hưởng đến pH đất

4.3 Khảo nghiệm hiệu quả chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng trên cây cải ngọt

4.3.1 Khảo sát nồng độ sử dụng thích hợp của chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng trên cây cải ngọt

Sau khi xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân, chúng tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất phân hữu cơ sinh học và tiến khảo nghiệm hiệu lực của chế phẩm nhằm tìm ra nồng độ sử dụng cho hiệu quả cao nhất về mặt năng suất, tính an toàn của chế phẩm trên cây cải ngọt tại HTX Dịch Vụ sản xuất rau an toàn Trãng Dài, Thành phố Biên Hòa, Tỉnh Đồng Nai (bảng 4.7 và 4.8)

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm lên các chiều cao và số lá của cây cải ngọt

ở các nồng độ khác nhau của chế phẩm, sự khác biệt về số lá của cây không ý nghĩa

về mặt thống kê, điều này chứng tỏ chế phẩm không gây ra sự khác biệt về số lá, nhưng xét về chiều cao cây thì có sự khác biệt rất rõ rệt Ở nghiệm thức L4 (7 %) cho chiều cao cây cao nhất, sự khác biệt này rất có ý nghĩa so với nghiệm thức I0 (đối chứng) và L1(1 %), tuy nhiên không có sự khác biệt so với nghiệm thức L2 (3 %) và L3 (5 %) Điều này cho thấy khi phun với nồng độ cao (7 %) vẫn không có hiệu quả