Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma Longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

HVCH: NGHIÊM VĂN ĐỨC

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:

NGHIÊN CỨU NẤM NỘI SINH TRONG CÂY NGHỆ

VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ CÁC HỢP CHẤT

THIÊN NHIÊN TỪ NẤM NỘI SINH

LUẬN VĂN: THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

HVCH: NGHIÊM VĂN ĐỨC

NGHIÊN CỨU NẤM NỘI SINH TRONG CÂY NGHỆ

VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ CÁC HỢP CHẤT

THIÊN NHIÊN TỪ NẤM NỘI SINH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hóa sinh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS.Dương Ngọc Tú, Trưởng phòng Sinh dược - Viện Hóa học, Phó giám đốc kiêm điều phối viên Trung tâm Xuất sắc liên ngành về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vương quốc Anh Thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp tại phòng Sinh dược, phòng Nghiên cứu các Hợp chất tự nhiên, Viện Hóa học và đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu Đặc biệt

là PGS.TS.Nguyễn Thị Hoàng Anh người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi từng bước từ khi mới bắt đầu nghiên cứu về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên, cũng như giúp đỡ, và cho tôi những lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng tôi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên

Nghiêm Văn Đức

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT………iii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU iv

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nấm nội sinh 4

1.1.1 Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật 4

1.1.2 Phân lập nấm nội sinh: 5

1.2 Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh: 6

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trên thế giới: 6

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trong nước: 12

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc 16

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp thu hái mẫu thực vật 16

2.2.2 Phương pháp phân lập nấm nội sinh trong thực vật 16

2.2.3 Phương pháp bảo quản nấm 17

2.2.4 Phương pháp phân loại dựa vào quan sát hình thái 18

2.2.5 Phương pháp sinh khối nấm nội sinh 19

2.2.6 Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên 20

2.2.7 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 21

2.2.8 Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm của các hợp chất sinh học. 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả phân lập và sinh khối nấm nội sinh 24

3.1.1 Kết quả thu hái và xử lý mẫu thí nghiệm 24

3.1.2 Kết quả phân lập nấm nội sinh 25

3.1.3 Kết quả định danh một số chủng nấm nội sinh 33

3.1.4 Kết quả sinh khối nấm nội sinh: 35

3.2 Kết quả ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu nấm nội sinh. 36

3.2.1 Kết quả ngâm chiết mẫu nấm B1 và C, sinh khối 36

3.2.2 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm B.cinera của các dịch chiết 38

3.2.3 Kết quả phân lập chất từ nấm Fusarium sp (B1) 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

AChE Acetylcholinesterase Enzyme thủy phân

acetylcholinesterase

TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng

CC Column chromatography Sắc ký cột

HPLC High-performance liquid

chromatography

sắc ký lỏng hiệu năng cao

GC/MS Gas Chromatography Mass

Spectometry

Sắc ký khí ghép khối phổ

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

Sơ đồ 3.1: Qui trình ngâm chiết mẫu nấm đã sinh khối 37

Sơ đồ 3.2: Qui trình phân lập các hợp chất từ nấm Fusarium sp (B1) 40

Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế nấm Botrytis cinera của các dịch chiết nấm 38 Bảng 3.2: Thông tin các hợp chất 1-12 41 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR và HSQC của chất 14 (DMSO, 500 và 125 MHz) 47

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 3.1: Hình ảnh mẫu nghệ vàng (Curcuma longa) 24

Hình 3.2: Thu hái mẫu nghệ vàng 24

Hình 3.3: Khử trùng các mẫu nghệ trong phân lập nấm nội sinh 25

Hình 3.4: Mẫu đối trứng (kiểm tra công thức khử trùng) 25

Hình 3.5: Mẫu thí nghiệm (mẫu lá, củ nuôi cấy phân lập nấm nội sinh) 26 Hình 3.6: Chủng nấm A 27

Hình 3.7: Chủng nấm B1 27

Hình 3.8: Chủng nấm B2 28

Hình 3.9: Chủng nấm C 28

Hình 3.10: Chủng nấm D 28

Hình 3.11: Chủng nấm E 29

Hình 3.12: Chủng nấm F 29

Hình 3.13: Chủng nấm G 29

Hình 3.14: Chủng nấm H 30

Hình 3.15: Chủng nấm I 30

Hình 3.16: Chủng nấm J 30

Hình 3.17: Chủng nấm K 31

Hình 3.18: Chủng nấm L 31

Hình 3.19: Chủng nấm M 31

Hình 3.20: Chủng nấm Ng1 32

Hình 3.21: Chủng nấm Ng2 32

Hình 3.22: Chủng nấm Ng3 32

Hình 3.23: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng C, bar 20 µm 33

Hình 3.24: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng B1, bar 10 µm 34

Hình 3.25: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NG01, bar 20 µm 35 Hình 3.26: Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng NG03, bar 20 µm 35

Hình 3.27: Kết quả sinh khối chủng nấm Fusarium sp (B1) 36

Hình 3.28: Ngâm chiết mẫu sinh khối chủng nấm 37

Hình 3.29: Hình ảnh thử hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các cặn chiết 39

Hình 3.30: Phổ sắc ký đồ của mẫu NB1M4 44

Hình 3.31: Phổ 1H chất 14 48

Hình 3.32: Phổ C13CPD chất 14 49

Hình 3.33: Phổ HSQC chất 14 50

MỞ ĐẦU Nấm nội sinh là những vi sinh vật sống trong tế bào cây mà không gây

ra bất kì tác động tiêu cực nào Trong nhiều trường hợp, nấm nội sinh có chức năng bảo vệ cây chống lại các loài gây bệnh bên ngoài Có hai cơ chế liên quan đến khả năng bảo vệ cây này, hoặc các loài nấm nội sinh trực tiếp sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất để tấn công các loài ngoại lai xâm nhập, hoặc chúng sẽ kích thích cơ chế phòng vệ của cây chủ Nấm nội sinh còn có thể kích thích tăng trưởng cây bằng cách sản xuất ra hormone thực vật, tổng hợp siderophore, cố định nito, hòa tan các chất khoáng, ức chế ethylene, hoặc trợ giúp quá trình phytoremediation Nấm nội sinh có thể được truyền đi từ thế hệ này sang thế hệ khác thông qua mô cây, hạt, hoặc các phương thức truyền giống thực vật khác Trong số hơn 300 ngàn loài cây thực vật bậc cao, mỗi cây là vật chủ của một hoặc nhiều loài nấm nội sinh Tương tác giữa nấm nội sinh và cây chủ tương ứng liên quan đến quá trình đồng sản xuất các phân

tử có hoạt tính sinh học, tuy nhiên người ta vẫn chưa hiểu hết được bản chất

sự tương tác này Điều quan trọng là bản chất mối quan hệ cộng sinh xác định rằng các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh đều không hại đến tế bào cây và không gây độc, do đó việc ứng dụng chúng trong y tế, chữa trị bệnh cho con người có tiềm năng rất cao

Hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên có

hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dược học dùng để làm thuốc Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu trên thế giới đối với các chất có hoạt tính sinh dược Những loài nấm nội sinh sống cộng sinh bên trong tế bào thực vật, chúng hiện nay đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm Những nghiên cứu

về nấm nội sinh có nguồn gốc từ biển đã tìm thấy hơn 270 các hợp chất mới

từ những năm 1990 tới giữa năm 2002 (2/3 trong số đó là từ tảo biển và cây

ngập mặn) Chỉ trong khoảng 5 năm từ 2002 tới 2006, đã tìm ra hơn 330 các hợp chất mới (là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm nội sinh) Các hợp chất trao đổi chất bậc hai do vi sinh vật sống sản sinh ra là con đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế ngày càng tăng vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc, và tính mới Các loài nấm sống nội sinh trong tế bào cây có thể sản sinh các hợp chất tương tự, hoặc cùng một loại hợp chất sản xuất bởi cây chủ Cũng có trường hợp nấm có thể sản sinh ra các chất mà người ta không chiết ra được từ cây Thông qua quá trình lên men vi sinh ở quy mô lớn, các loài nấm nội sinh có thể sản xuất một số lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học với giá thành rẻ để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất dược phẩm Điều quan trọng nữa là khi sử dụng vi sinh vật nội sinh sẽ tránh được việc khai thác cạn kiệt nguồn tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài cây, gây hậu quả xấu tới môi trường tự nhiên

Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân

rễ nghệ vàng chứa tinh dầu, ngoài ra còn có chất curcumin Theo y học cổ truyền, nghệ vàng được phân làm hai vị thuốc Thân rễ to được gọi là khương hoàng, các củ nhỏ mọc ra từ thân rễ được gọi là uất kim Uất kim thường có màu đỏ hơn Nghệ không chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm thuốc, có nhiều loại nghệ nhưng công dụng nhất là loại nghệ vàng Nghệ vàng có vị đắng cay, có mùi thơm hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống Nghệ vàng dùng để chữa các bệnh: kinh nguyệt không đều, viêm loét dạ dày, ung nhọt, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thư, HIV, tiểu đường, Alzheimer, viêm gan B, C, kháng nấm, chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [1]

Hoạt chất Curcumin trong c Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin

là thành phần chính của Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa

học là (1E,6E)-1,7-bis dione Curcumin có dạng bột màu vàng được mệnh danh như một loại thần dược có khả năng phòng chống và chữa được rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu ở khối u, giúp tăng cường miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus

(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhưng đối tượng nấm nội ký sinh trong cây nghệ thì vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu Vì vậy phân lập nấm nội ký sinh từ cây nghệ là một hướng mới trong nghiên cứu khoa học nói chung và trong lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên nói riêng Để tìm hiểu về những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) và

các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh” Mục tiêu chính của đề tài là tìm

ra các chủng nấm nội sinh trong cây nghệ và nghiên cứu thành phần hóa học của chúng Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ nấm nội sinh

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm nội sinh

1.1.1 Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật

Nấm nội sinh (Endophytes fungal, Endophytic fungi) là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [32] Endophytes cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones [10], tổng hợp siderophores [21], cố định đạm [23], hay qua hỗ trợ phytoremediation [24] Endophytes có thể được truyền từ một thế hệ kế tiếp thông qua các mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [9] Nghiên cứu đã cho thấy rằng các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn endophytic có chống vi khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [26]

Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh, nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây Sự tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng nấm nội sinh hữu ích Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [7,32]

Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ

Ở một số loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu được độc tính của nhôm trong nguồn nước, trong môi trường sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm

tự nhiên được sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra

rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra [7]

1.1.2 Phân lập nấm nội sinh:

Trên thế giới có khoảng 300 nghìn loài thực vật Đó là một số lượng quá lớn mà ta không thể thử nghiệm hết cũng như không thể chọn lựa một cách ngẫu hứng khi đưa vào nghiên cứu Do đó, việc chọn thực vật để phân lập nấm nội sinh cũng cần phải dựa trên những đối tượng cây có đặc điểm sinh học Một số nguyên tắc cơ bản sau đây thường được áp dụng:

Với thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường, môi trường bất thường và các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần có yếu tố đặc biệt nào đó giúp cây có khả năng chống chịu cao Và người

ta mong đợi nhân tố đó chính là các nấm nội sinh có ích Ví dụ: Rhyncholacis

penicillata là một loài cây sống dưới nước ở Tây Nam Venezuela, nơi mà môi

trường nước rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập bởi tác dụng nước cuốn, mảnh vụn, đá sỏi…làm cho cây bị tổn thương Từ đó các nấm gây bệnh thực vật có thể xâm nhập, nhưng cây vẫn khỏe mạnh, vì cây được sự bảo vệ bởi các nấm

nội sinh có trong cây Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng Serratia

marcescens được phân lập từ cây R penicillata có khả năng sản xuất ra

oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới [30]

Một số loài thực vật dược liệu dân gian đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này sang đời khác để chữa lành vết thương, kháng

nấm, kháng khuẩn…ví dụ như, Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã

được dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thương, sát trùng Từ cây này đã

phân lập được chủng Streptomyces sp NRRL 30562 sản xuất kháng sinh phổ

rộng munumbicin, kháng được nấm gây bệnh thực vật, vi khuẩn và Plasmodium [11]

Các thực vật có tính đặc thù về sinh thái: tuổi thọ cao bất thường, phát triển trong các vùng có biến đổi sinh học lớn, hay sống trong khu vực đất đai

cổ xưa…cũng là những đối tượng nghiên cứu rất lý tưởng để cung cấp các nấm nội sinh mới lạ

Nấm nội sinh có mặt ở khắp nơi trong thế giới thực vật, số lượng của chúng tìm thấy thay đổi tùy thuộc vào bộ phận cây, chủng loại cây và môi trường sống của nó Đã có nhiều kĩ thuật phân lập nấm nội sinh được đề nghị bởi nhiều tác giả khác nhau Nhưng tất cả các quy trình phân lập đều dựa trên

cơ sở chung nhất đó là: giải quyết tốt giai đoạn xử lý bề mặt, diệt các sinh vật ngoại nhiễm bằng chất sát trùng hoặc các phương pháp sát trùng Sau đó tạo điều kiện không nhiễm để chỉ thu nhận các nấm nội sinh phát triển từ nội mô thực vật Tiếp theo chọn nuôi cấy trên môi trường thích hợp và thử hoạt tính sinh học [30,32]

1.2 Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh:

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trên thế giới:

Năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh Trên thế giới đã biết được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên (Berdy, 1984)

Theo đó, từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên được phân lập từ cây Taxus brevifolia, nấm này sản xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi

phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự như

paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana) Một số nhà khoa

học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất được sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nấm nội sinh tổng hợp Chi

thông đỏ (Taxus) luôn là 1 nguồn giàu nấm nội sinh [28,29]

Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ Có thể nói

các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ Những nấm

đã được biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis

microspora Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, người ta

cũng đã phát hiện được sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập

từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp.,

Pestalotiopsis sp và Truncatella sp [28,29]

Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn

nội sinh Streptomyces sp chủng NRRL 30562 được phân lập từ cây Kennedia

nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram

(+) như Bacillus anthracis, M tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác Streptomyces sp chủng NRRL 30562 phát triển trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P falciparum với LD50=7-10ng/ml

[11]

Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng nấm nội sinh cũng được công nhận là nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học Một vật chủ có thể phân lập được rất nhiều các chủng nấm nội sinh khác nhau [33]

Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng nấm nội sinh

Cryptospriopsis quercina được phân lập từ cây Tripterigeum wilfordii, nấm

này có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin Trong đó, cryptocandin kháng

một số nấm gây bệnh cho người như Candida albicans, Trichophyton sp và chống một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis

cinerea Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số nấm gây

bệnh thực vật [30] Cùng năm 2003, Taechowisan và cộng sự đã nghiên cứu

về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia

galanga [32]

Năm 2005, Raviraja đã phân lập được mười tám loài nấm nội sinh được phân lập từ vỏ cây, thân và lá phân đoạn của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats

của Ấn Độ: Curvularia clavata, C lunata, C Pallescens, Fusarium

oxysporum Nấm nội sinh đã được tìm thấy nhiều nhất trong các đoạn lá, chứ

không phải là phân khúc thân cây và vỏ cây Phần lớn các loài nấm nội sinh

đã được tìm thấy trong cây Callicarpa tomentosa thuộc chi Tử châu, họ Hoa môi (11 loài), trong khi cây Lobelia nicotinifolia thuộc phân họ Lỗ bình, họ

Hoa chuông (5 loài) [22]

Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ

Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế

enzyme acetylcholinesterase, và được dùng trong điều trị bệnh Alzheimer [20]

Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ

Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất

(9-methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thư [19]

Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về

endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa) Các chất dinh dưỡng trong thân

rễ của cây nghệ là môi trường sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy tăng trưởng Trong

nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp được phân lập từ thân

rễ củ nghệ và cả hai chủng đã được tìm thấy có khả năng để sản xuất Indole 3 acetic acid qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - high-performance liquid chromatography) [8]

Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium

oxysporum phân lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B

dùng để điều trị bệnh tim mạch [12]

Năm 2014, Lena Hammerschmidt và cộng sự của Viện Sinh dược và Công nghệ Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, Cộng hòa Liên bang Đức phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết của

nấm nội ký sinh Acremonium strictum Gams, phân lập từ cây Đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) thu hái tại Việt Nam Trong đó có 5 dẫn xuất

polyketide mới 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone (2), bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5) và 7 hợp chất đã biết (6-12) Các hợp chất 6, 7 và 9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với hai dòng tế bào ung thư ở người là ung thư biểu mô buồng trứng nhạy cảm với cisplatin (A2780) và dòng kháng cisplatin (A2780 CisR), trong khi chỉ có chất 9 biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với

Staphylococcus aureus với giá trị MIC 14,3 µM [13]

Các hợp chất có hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men nấm nội sinh

1 - Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nấm nội sinh phân lập từ cây ngập mặn ở một số vùng địa lý khác nhau có thể tổng hợp được các chất gây độc và tiêu diệt tế bào ung thư Cyclic

depsipeptides bionectriamides A-C được tách chiết từ chủng Bionectria

ochroleuca được phân lập từ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) ở Hải

Nam, Trung Quốc [11]

2 - Tiêu diệt vi sinh vật: Các hợp chất mới có tính diệt khuẩn do nấm nội sinh sản xuất có thể sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, giúp khắc phục hiện tượng nhờn thuốc của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều hợp chất có nguồn gốc từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt

một dải rộng các loài vi khuẩn gây bệnh Fusarium incarnatum được phân lập

từ cây Cúc tần (Pluchea indica) ở đảo Hải Nam, Trung Quốc có khả năng

sinh ra equisetin [7]

3 - Chất chống oxi hóa: Chất chống oxi hóa thường được tìm thấy ở các cây dược liệu, rau và hoa quả Chất chống oxi hóa thường được xem như các tác nhân giúp phòng tránh và chữa trị bệnh như ung thư, bệnh tim, tăng huyết

áp, tiểu đường, run chân tay và mất trí nhớ, lão hóa… Thành phần phenol từ

nấm nội sinh có tác dụng chống oxi hóa cao Loài nấm Phomopsis amygdale phân lập từ cây ngập mặn ở Karankadu (Ấn Độ), và Trichoderma được tìm thấy trong lá cây ngập mặn Aegiceras corniculatum có thể sinh ra các chất có hoạt tính chống oxy hóa cao Nấm nội sinh Alternaria sp R6 phân lập từ rễ cây ngập mặn loài Myoporum bontioides A có khả năng tiết ra các chất

chuyển hóa resverratrodehydes A&C chống các gốc tự do ABTS&DPPH [7,34]

4 - Ức chế α-glucosidase: Các chất ức chế α-glucosidase có thể làm giảm sự hấp thụ carbohydrate từ bữa ăn và ngăn chặn tăng đường huyết sau khi ăn Các chất này có thể được sử dụng để điều trị tiểu đường, béo phì Hai

chất mới được tìm thấy từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum phân lập từ

loài cây ngập mặn Kandelia candel ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc desmethylterphenyllin, 3-hydroxy-6’-O-desmethylterphenyllin) có hoạt tính

(6’-O-ức chế α-glycosidase rất mạnh, và có hiệu quả cao hơn cả chất đối chứng

dương genistein Hợp chất 07H239 từ nấm Xylaria sp BL321 có hoạt tính ức

chế α-glucosidase khi thử ở nồng độ cao Ngoài ra, các chất chuyển hóa của vermistatin, 6-demethylpenisimplicissin và 2-epihydroxyldihydrovermistatin

từ nấm nội sinh Penicillium sp HN29-3B1 (phân lập từ cây Cerbera

manghas) cũng biểu hiện hoạt tính kháng cao [27]

5 - Ức chế acetylcholinesterase: Chất ức chế acetylcholinesterase (AChE) hiện sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer Tuy nhiên, hiện vẫn chưa tìm được loại chất AChE có tác dụng mạnh, lâu dài mà ít tác

dụng phụ nhất Sporothrin A từ nấm nội sinh Sporothrix sp có biểu hiện ức chế AChE rất mạnh Hai terphenyls từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum

(ZH4-E2) cũng có hoạt tính ức chế AchE Ngoài ra, họ đang nghiên cứu các

hợp chất do nấm nội sinh của cây ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp sk5GW1L và Penicillium sp sk14JW2P, có tác dụng ức chế AChE như

arigsugacin I, arigsugacin F và territrem B [14]

6 - Hoạt tính chống viêm: Hợp chất chống viêm không chứa steroid rất

cần thiết trong điều trị các bệnh viêm Nấm nội sinh Irpex hydnoides,

Aspergillus flavus, Schizophyllum commune, Neurospora crassa, Hypocrea lixii, Pestalotiopsis microspora, Aspergillus oryzae và Meyerozyma guilliermondi phân lập từ cây ngặp mặn có thể sản sinh ra các chất chống

viêm có hoạt tính tương đương thuốc Indomethacin [15]

7 - Tiêu diệt vi khuẩn lao mycobacteria, vi khuẩn Lao phổi đang trở

nên rất nguy hiểm khi xuất hiện các dạng vi khuẩn kháng thuốc, do đó việc tìm ra các chất mới thay thế trở thành vấn đề cấp bách Nấm nội sinh

Fusarium sp DZ-27 phân lập từ thân cây Kandelia candel (Hải Nam, TQ) có

thể sinh ra axit fusaric Các thử nghiệm chống vi khuẩn lao cho thấy rằng hỗn hợp axit fusaric với muối cadmium và muối đồng của nó thể hiện hoạt tính

tiêu diệt rất cao hai chủng vi khuẩn lao Mycobacterium bovis BCG và

M.tuberculosis H37Rv [7] Nấm nội sinh Nigrospora sp phân lập từ cây Bruguiera sexangula có thể sản sinh anthraquinones có tác dụng phòng bệnh

cao chống lại rhino virus [17]

Nhiều nấm nội sinh trong cây đã được phân lập, chúng có khả năng sản sinh những chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác

Fusarium sp là nấm phân lập từ cây Selaginella pallescens, được thu

nhập từ vùng Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất được

một pentaketide mới là CR 377 cho tác dụng mạnh trên C albicans [25]

Pestralotiopisis microspora thường gặp ở rừng mưa nhiệt đới, sản xuất

nhiều chất có tác dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambuic có

tác dụng kháng nấm Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã

được phân lập từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm

Muscodor albus là nấm được phân lập từ cành của cây Quế

(Cinnamomum zeylanicum), nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức

chế vi khuẩn và nấm Thành phần chính của những hợp chất này đã được xác định cấu trúc hóa học bằng sắc ký khí ghép với khối phổ (GC-MS), từ đó được tổng hợp hóa học Các chất tổng hợp được có hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với người [31]

Nodulisporium sp được phân lập từ cây Bontia daphnoides sản xuất

hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng [16]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trong nước:

Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nước đã phân lập được 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ cây thông đỏ, đã định được tên của 6 chủng nấm này Đây

là loài thực vật đặc hữu có ở Việt Nam, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một vị thuốc Chúng thường được phân bố ở Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, và chủ yếu là ở Lâm Đồng Trong

đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai có mặt

ở tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ được lấy mẫu Chúng phù hợp nhất với

hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp được tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở

Mỹ và được các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc

kí bản mỏng cùng với chất taxol chuẩn [35]

Trong 2 năm 2003-2004, phòng sinh học thực nghiệm cũng đã phân lập được trên 115 chủng nấm kí sinh trên các cây thuốc khác nhau trong đề tài được giao: “Phân lập một số chủng nấm ký sinh thực vật và tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học” [35]

Năm 2005, Lê Mai Hương cùng các cộng sự thuộc phòng sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã tiến hành nhiệm vụ

“Nghiên cứu khu hệ nấm nội ký sinh trong các cây Thông” Nghiên cứu này

tập trung chủ yếu vào 3 loài Thông là Thủy tùng (Glyptostrobus pensilis), Thông đỏ Bắc (Taxus chinensis) và Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana) Mục

tiêu của việc nghiên cứu là cung cấp cơ sở khoa học cho chính quyền địa phương và ngành Lâm nghiệp về giá trị bảo tồn và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên quý hiếm, cũng như cho ngành Y học ứng dụng kết quả nghiên cứu để giảm thiểu và điều trị bệnh ung thư Địa điểm triển khai khảo sát thực địa, thu thập mẫu của nhiệm vụ này ở tại một số tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Sơn La và một số tỉnh miền Trung như Lâm Đồng, Đắc Lắc Sau chuyến thực địa, các nhà nghiên cứu đã thu thập được 118 mẫu tại các tỉnh khảo sát Các mẫu này được kiểm định rồi đem nuôi cấy, lên men

và tách chiết sơ bộ các chủng nấm phân lập để sàng lọc hoạt tính sinh học, tách chiết hóa học theo định hướng hoạt tính một số chủng nấm tiêu biểu [35]

Lê Mai Hương và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số),

27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập) Từ

32 chủng có hoạt tính, bằng phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9 chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2

có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium

oxyporum [3]

Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh

trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất

ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc

tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính

kháng S.aureus với MIC=25mg/ml Chất ergosterol peroxid biểu hiện hoạt

tính độc tế bào mạnh với cả 3 dòng tế bào thử là ung thư gan, ung thư màng

tử cung và ung thư màng tim [2]

Năm 2009, tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Phạm Quang Thu

và cộng sự cũng đã nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế Phân lập được 8 chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tuợng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế, trong đó

có 15 chủng gồm vi khuẩn và nấm nội sinh trên tổng số 21 chủng có hoạt tính

ức chế nấm Ceratocystis sp ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8 trên tổng

số 21 chủng ức chế nấm Corticium salmonicolor ở mức dộ mạnh và rất mạnh

[5]

Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng nấm nội

sinh thực vật trên cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu được chủng

Pseudeurotium NS-T1 kháng C albicans, trên cây mã đề (Plantago major L.)

thu được chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng C

albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng Trichoderma TT-L1 kháng C albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu

được chủng Fusarium TR-T1 kháng C albicans…[4]

Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã phân lập được rất nhiều nấm nội sinh, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng) Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết quả có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thư như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4

chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46;

Eupenicillium ehrlichii SHT101 và Gongroniella butleri SHT106 Hợp chất

SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cơ vân với giá trị IC50 là 4,19 μg/ml Hợp chất SHT 101.1 biểu hiện khả năng kháng mạnh vi

khuẩn S aureus với MIC là 25 μg/ml Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây

độc 2 dòng tế bào ung thư phổi và ung thư cơ vân với giá trị IC50 tương ứng

là 4,0 và 3,06 μg/ml Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng nấm lựa chọn đều có khả năng ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng [35]

Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trường nuôi

cấy thích hợp cho nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum được phân lập trên Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng và lượng taxol

sinh ra ở môi trường nuôi cấy là 250,98 mg/kg khối lượng khô [6]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu củ, thân, lá nghệ vàng tươi

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc

Dụng cụ hóa chất cho phân lập nấm nội sinh trong thực vật

- Bình cô quay các loại

- Bình tam giác các loại

- Phễu lọc, phễu chiết

- Silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm

- Bản mỏng tráng silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) Alufolien

60 F254 chiều dày 0.2 mm trên nền nhôm

- Máy cô quay chân không

- Máy khuấy

- Máy hứng phân đoạn

- Máy siêu âm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu hái mẫu thực vật

Mẫu cây thu được xác định tên khoa học dựa dựa theo những tên gọi dân gian, những mô tả về hình thái của thực vật, các đặc điểm hoa, quả, hạt (nếu có) và các bộ phận khác, để từ đó có cơ sở đem so sánh với khóa phân loại hoặc các tài liệu tham khảo chuyên biệt để xác định tên khoa học thực vật

Chọn những cây trung tuổi, khỏe mạnh, không còi cọc, không bị sâu hại hay các biểu hiện bệnh như đốm lá, úng lá… Thu tất cả các bộ phận của cây nghệ như: củ, rễ, thân, lá Các bộ phận thu hái được tiến hành cắt gọn tùy theo đặc điểm cấu tạo của bộ phận để dễ dàng rửa sạch mẫu Rửa sạch đất, bụi bẩn trên các mẫu thu hái Mẫu được phân loại theo các bộ phận thu hái tránh

bị gẫy và dập nát gây tổn thương các lớp tế bào mô và tế bào biểu bì ảnh hưởng đến sức sống của vi sinh vật sống nội sinh trong cây

2.2.2 Phương pháp phân lập nấm nội sinh trong thực vật

Chuẩn bị môi trường:

Công thức môi trường: Agar 15g, malt extract 15g, chloramphenicol 0,2g, nước cất 1l

Môi trường được đem đi khử trùng ở 121ᴼC trong 20 phút Sau khi khử trùng xong lấy ra cho vào tủ hút đã lau sạch bằng cồn, bật đèn UV 15 phút Môi trường nguội đến 50ᴼC - 60ᴼC xoay nhẹ cho nó phân tán đều, rót ra đĩa petri

Khử trùng mẫu thực vật:

Sau khi xử lý sơ bộ các mẫu cây bằng cách xịt cồn 70% trước khi đưa vào box cấy Các mẫu được cắt nhỏ theo cấu tạo của các bộ phận mẫu cây và ngâm ngập trong cốc cồn 70% trong 90-120 giây sau đó chuyển mẫu sang cốc nước thanh trùng ngâm ngập trong 120 giây Mẫu khử trùng xong được để ráo

tự nhiên hoặc đặt trên giấy/khăn lau đã khử trùng

Phân lập nấm và theo dõi thí nghiệm:

Kiểm tra công thức khử trùng (độ sạch của mẫu nghệ dùng để phân lập nấm) bằng cách: Quệt hoặc lăn mẫu đã khử trùng lên trên bề mặt thạch (mẫu đối chứng)

Xử lý mẫu đã khử trùng: Dùng panh và dao sắc cắt nhỏ, cắt lát các mẫu nghệ rồi tiến hành đặt mẫu đã cắt lên bề mặt đĩa thạch Mỗi đĩa khoảng 4-5 mẫu cây đã cắt lên môi trường thạch (mẫu thí nghiệm/mẫu phân lập)

Đĩa thạch đối chứng và mẫu thí nghiệm được bọc kín bằng paraffin Tiến hành nuôi mẫu trong điều kiện 22 - 25 OC Sau 48h có thể kiểm tra mẫu :

Mẫu đối chứng không có gì (vi sinh vật không xuất hiện trên môi trường nuôi cấy) chứng tỏ khử trùng mẫu đã sạch

Mẫu đối chứng có dấu hiệu nấm phát triển chứng tỏ khử trùng mẫu chưa sạch cần tiến hành lại thí nghiệm với loại mẫu này

Cấy chuyển và làm sạch các chủng nấm:

Theo dõi sự phát triển của nấm nội sinh trong khoảng từ 1-2 tuần Nấm nội sinh được phân biệt với các nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát của khóm nấm và khóm vi khuẩn

Sau đó cấy chuyền nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp mới Khi xuất hiện các sợi nấm mọc trên đĩa thạch cần tiến hành cấy chuyển luôn, tránh hiện tượng mọc lẫn nhau của 2 hay nhiều chủng nấm Từ đó phân biệt các chủng giống khác nhau, ký hiệu chủng

2.2.3 Phương pháp bảo quản nấm

Phương pháp cấy truyền:

Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:

Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7 OC)

Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt

Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel, bảo quản nấm sợi có bào tử

theo phương pháp đông khô, bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp

2.2.4 Phương pháp phân loại dựa vào quan sát hình thái

Tên khoa học của các chủng nấm nội sinh cho chất biến dưỡng ra môi trường có tác động kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa… sẽ được xác định đến mức chi dựa trên các đặc điểm của nấm

Các qui tắc chính trong định danh

Chủng nấm tuyệt đối thuần khiết (không lẫn vi sinh vật khác)

Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần phù hợp

Quan sát và ghi lại các đặc điểm phân loại của chủng nấm cần định danh (đặc điểm khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học…)

Dùng chuyên luận các nhóm phân loại để định loại nấm đến mức chi Kiểm tra chủng nấm đã định danh với chủng nấm có trong bộ sưu tầm mẫu

Viết tên các nhóm phân loại đúng với danh pháp quốc tế

Quan sát các đặc điểm khuẩn lạc

Dùng que cấy, cấy điểm chủng nấm cần nghiên cứu vào môi trường thạch đĩa LCA, PDA Đặt đĩa nuôi cấy trong tủ ấm 25OC, trong 7-14 (30)

ngày, quan sát các đặc điểm khuẩn lạc (kích thước, màu sắc khuẩn lạc; màu sắc mặt trái khuẩn lạc; sự hình thành giọt tiết, sắc tố ra ngoài môi trường, )

bề mặt thạch một miếng chứa khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,2mm × 0,2mm rồi chuyển sang lam kính Đặt lamen lên, quan sát dưới kính quang học ở các vật kính có độ phóng đại 400 lần và 1000 lần Đo kích thước, và chụp ảnh hình thái cấu trúc các cơ quan sinh sản của nấm Sau đó so sánh với khóa phân loại của các tác giả uy tín trên thế giới như Seifert 2011,… tìm ra

sự tương đồng giữa hình ảnh của chủng nấm cần phân loại và hình ảnh trong sách, từ đó đưa ra kết luận

2.2.5 Phương pháp sinh khối nấm nội sinh

Sau khi đã phân lập được các chủng nấm sạch ta cần tiến hành nhân nuôi để tạo nguồn giống sinh khối và bảo quản chủng nấm sạch Có 2 phương pháp sinh khối: sinh khối lỏng và sinh khối rắn

Phương pháp sinh khối lỏng:

Môi trường lỏng: yeast extract 3g, malt extract 3g, pepton 5g, glucose 20g, nước cất 1l

Môi trường được khử trùng ở 121OC trong 30 phút Sinh khối nấm trong bình tam giác 1l với 300 ml môi trường Cho vào tủ cấy đã bật đèn UV

chờ môi trường nguội để nuôi sinh khối Cho đĩa vào tủ cấy đã vô trùng, bóc parafilm, dùng dao cắt đã khử trùng cắt nhỏ đĩa thạch rồi gắp vào môi trường nuôi cấy Cho môi trường lên máy rung lắc trong khoảng 3-4 tuần tùy từng điều kiện môi trường và đặc điểm sinh trưởng, triển của chủng nấm sinh khối

Phương pháp sinh khối rắn:

Môi trường gạo: gạo 100g, nước cất 300ml

Tiến hành vò qua gạo để sạch bụi bẩn và chấu rồi cho nước sạch và gạo bình tam giác 1l, sau đó khử trùng ở 121 O

C trong 30 phút Chú ý tùy từng loại gạo ta thể điểu chỉnh lượng nước sao cho môi trường được nấu khử trùng xong hạt gạo không được nguyên hạt như cơm, không nhão quá như cháo Bình sinh khối không được bịt kín quá, cần sử dụng nút bông hoặc 2 lớp giấy bạc sạch quấn quá cổ bình tam giác Cho đĩa giống nấm vào tủ cấy đã vô trùng, bóc parafilm, dùng dao cắt đã khử trùng cắt nhỏ thạch chứa giống nấm được cắt nhỏ, cấy vào môi trường gạo nuôi cấy Mẫu nấm được nuôi từ 4-6 tuần rồi tiến hành ngâm chiết

2.2.6 Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên

Phương pháp chiết xuất:

Phương pháp chiết rắn - lỏng: Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn, gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với bộ Soxhlet… Ngoài ra, còn có thể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn, chiết bằng siêu âm

Phương pháp chiết lỏng - lỏng: Phương pháp này dựa trên sự phân bố các chất hóa học vào hai dung môi không trộn lẫn được vào nhau Các chất hữu cơ sẽ chuyển từ nước (H2O) sang các dung môi hữu cơ, trong khi đó các chất phân cực khác sẽ được giữ lại trong pha nước Quá trình chiết được thực hiện dưới sự kiểm soát các điều kiện: pH, độ phân cực, tỷ lệ các dung môi, nhiệt độ, …

Phương pháp sắc ký:

Sắc ký bản mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hợp chất, định hướng và kiểm tra các quá trình phân tách Phân tích TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel Merck Các hợp chất được phát hiện trên đèn tử ngoại ở các bước sóng 254nm và 366 nm hoặc được phun thuốc thử anisaldehyde hoặc vanillin/axit sunfuric đặc 1% rồi nung nóng ở 110OC

Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên Chất hấp phụ được dùng trong sắc ký cột là silica gel Merck theo cơ chế sắc ký hấp phụ Phân tách sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi Phân tách sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới áp suất của không khí nén Cột tách sắc ký có nhiều loại với kích thước đường kính và chiều dài khác nhau

Sắc ký cột (CC) trên pha Sephadex LH-20 được sử dụng để phân tách các hợp chất phenolic theo cơ chế sắc ký loại trừ theo kích thước phân tử Đối với cột Sephadex dung môi thường dùng là Methanol (MeOH) (100%)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao - điều chế (HPLC-Preparative): Phương pháp hiện đại nhất để phân lập các hợp chất có độ phân cực cao đối với các phân đoạn đã qua xử lý bằng các cột sắc ký thích hợp

Sắc ký lỏng hiệu năng cao - phân tích: Đối với kỹ thuật HPLC phân tích, hiệu năng phân tách đạt được dựa trên việc xử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký Kỹ thuật phân tích HPLC được sử dụng để nhận dạng các píc (peak) từ các dịch chiết hay các phân đoạn

2.2.7 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Các phương pháp Hoá lý để xác định cấu trúc các hợp chất thiên nhiên

Khối phổ (MS):

Khối phổ (MS) là một phương pháp phân tích dựa trên việc xác định khối lượng nguyên tử hoặc phân tử của mỗi mẫu đo Trong MS, một hợp chất

được hoá hơi trong chân không và bị bắn phá với dòng điện tử có năng lượng cao khoảng 70 electron/volts ( tương ứng với 1.600 kcal/mol)

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS, 70 eV) được ghi trên thiết bị Hewlett Packard HP 5989 B MS spectrometer, Serie II

Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS) được ghi trên hệ thống LC/MSD Trap Agilen Series 1100

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để nghiên cứu về cấu trúc Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) (500 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) (125 MHz) và phổ DEPT được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer TMS (tetrametylsilan) là chất chuẩn nội zero Độ chuyển dịch hóa học δ được biểu thị bằng ppm, J tính theo Hz

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS):

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectrometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này , các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính

và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất

Các phương pháp khác như:

Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên thiết bị Impact-410-Nicolet FT-IR spectrophotometer Điểm nóng chảy không hiệu chỉnh được đo trên máy Boetius

2.2.8 Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm của các hợp chất sinh học

Bước 1: Chuẩn bị các chủng nấm gây bệnh đích: Nấm gây bệnh thán

thư (Colletotrichum gloeosporiodes) hoặc nấm gây bệnh thối xám (Botrytis

cinera),… Các chủng nấm sạch được hoạt hóa ở dạng sợi nấm

Bước 2: Chuẩn bị các nồng độ dịch chiết muốn kiểm tra hoạt tính Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: agar 15g, malt extract 15g, chloramphenicol 0,2g, nước cất 1l Môi trường được chia đều ra các bình tam giác nhỏ đem hấp khử trùng và trộn các dung dịch chất cần kiểm tra hoạt tính vào trong môi trường Malt extract rồi đổ vào đĩa petri Khả năng ức chế của các chất được đánh giá ở nồng độ khác nhau tùy từng đối tượng chất thử Thông thường đối với dịch chiết tổng ta thử ở 1500 ppm, phân đoạn dịch chiết thử ở 1000 ppm, chất sạch được thử ở 200 ppm

Bước 4: Cấy miếng nấm khảo nghiệm có đường kính 4 mm vào tâm đĩa môi trường Các mẫu thí nghiệm được nuôi ở nhiệt độ 24 OC, đo kích thước tản nấm sau 5 ngày nuôi cấy (hoặc khi mẫu đối chứng âm ăn kín đĩa thạch)

Đánh giá khả năng ức chế theo công thức:

C – T KNƯC % = - x 100

C Trong đó:

KNƯC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm

T: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm

C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng âm