Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (curcuma longa l ) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - HVCH: NGHIÊM VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU NẤM NỘI SINH TRONG CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TỪ NẤM NỘI SINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hóa sinh Mã ngành: 60420114 LUẬN VĂN: THẠC SĨ SINH HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DƢƠNG NGỌC TÚ Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS.Dƣơng Ngọc Tú, Trƣởng phòng Sinh dƣợc - Viện Hóa học, Phó giám đốc kiêm điều phối viên Trung tâm Xuất sắc liên ngành lĩnh vực hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vƣơng quốc Anh Thầy hƣớng dẫn, định hƣớng giúp đỡ thực thành công luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo trƣờng Đại học Thái Nguyên nhƣ thầy cô thuộc Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tnh giảng dạy truyền thụ cho kiến thức chuyên môn để thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn nhà khoa học, bạn đồng nghiệp phòng Sinh dƣợc, phòng Nghiên cứu Hợp chất tự nhiên, Viện Hóa học đồng hành giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Đặc biệt PGS.TS.Nguyễn Thị Hồng Anh ngƣời tận tình hƣớng dẫn, bảo bƣớc từ bắt đầu nghiên cứu lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, nhƣ giúp đỡ, cho lời khuyên q báu để tơi hồn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng chỗ dựa tinh thần vững cho suốt thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn bè cổ vũ động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Một lần tơi vô cảm ơn Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên Nghiêm Văn Đức i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ v MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm nội sinh 1.1.1 Khái niệm quan hệ nấm nội sinh thực vật 1.1.2 Phân lập nấm nội sinh: 1.2 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh: 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh giới: 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh nước: 12 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ, hóa chất thiết bị máy móc 16 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị máy móc 16 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp thu hái mẫu thực vật 16 2.2.2 Phương pháp phân lập nấm nội sinh thực vật 16 2.2.3 Phương pháp bảo quản nấm 17 2.2.4 Phương pháp phân loại dựa vào quan sát hình thái 18 2.2.5 Phương pháp sinh khối nấm nội sinh 19 2.2.6 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên 20 2.2.7 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 21 2.2.8 Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm hợp chất sinh học 23 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết phân lập sinh khối nấm nội sinh 24 3.1.1 Kết thu hái xử lý mẫu thí nghiệm 24 3.1.2 Kết phân lập nấm nội sinh 25 3.1.3 Kết định danh số chủng nấm nội sinh 33 3.1.4 Kết sinh khối nấm nội sinh: 35 3.2 Kết ngâm chiết phân lập hợp chất từ mẫu nấm nội sinh 36 3.2.1 Kết ngâm chiết mẫu nấm B1 C, sinh khối 36 3.2.2 Kết thử hoạt tính kháng nấm B.cinera dịch chiết 38 3.2.3 Kết phân lập chất từ nấm Fusarium sp (B1) 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AChE Acetylcholinesterase Enzyme thủy phân acetylcholinesterase ARNr ARN ribosome ARN ribosome TLC Thin layer chromatography Sắc ký mỏng CC Column chromatography Sắc ký cột HPLC High-performance liquid sắc ký lỏng hiệu cao chromatography GC/MS Gas Chromatography Mass Sắc ký khí ghép khối phổ Spectometry MS Mass spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Sơ đồ 3.1: Qui trình ngâm chiết mẫu nấm sinh khối 37 Sơ đồ 3.2: Qui trình phân lập hợp chất từ nấm Fusarium sp (B1) 40 Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế nấm Botryts cinera dịch chiết nấm 38 Bảng 3.2: Thông tin hợp chất 1-12 41 13 Bảng 3.3: Số liệu phổ H- C-NMR HSQC chất 14 (DMSO, 500 125 MHz) 47 iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 3.1: Hình ảnh mẫu nghệ vàng (Curcuma longa) 24 Hình 3.2: Thu hái mẫu nghệ vàng 24 Hình 3.3: Khử trùng mẫu nghệ phân lập nấm nội sinh 25 Hình 3.4: Mẫu đối trứng (kiểm tra công thức khử trùng) 25 Hình 3.5: Mẫu thí nghiệm (mẫu lá, củ nuôi cấy phân lập nấm nội sinh) 26 Hình 3.6: Chủng nấm A 27 Hình 3.7: Chủng nấm B1 27 Hình 3.8: Chủng nấm B2 28 Hình 3.9: Chủng nấm C 28 Hình 3.10: Chủng nấm D 28 Hình 3.11: Chủng nấm E 29 Hình 3.12: Chủng nấm F 29 Hình 3.13: Chủng nấm G 29 Hình 3.14: Chủng nấm H 30 Hình 3.15: Chủng nấm I 30 Hình 3.16: Chủng nấm J 30 Hình 3.17: Chủng nấm K 31 Hình 3.18: Chủng nấm L 31 Hình 3.19: Chủng nấm M 31 Hình 3.20: Chủng nấm Ng1 32 Hình 3.21: Chủng nấm Ng2 32 Hình 3.22: Chủng nấm Ng3 32 Hình 3.23: Khuẩn lạc quan sinh sản chủng C, bar 20 µm 33 Hình 3.24: Khuẩn lạc quan sinh sản chủng B1, bar 10 µm 34 Hình 3.25: Khuẩn lạc quan sinh sản chủng NG01, bar 20 µm 35 Hình 3.26: Khuẩn lạc cuống sinh bào tử chủng NG03, bar 20 µm 35 Hình 3.27: Kết sinh khối chủng nấm Fusarium sp (B1) 36 Hình 3.28: Ngâm chiết mẫu sinh khối chủng nấm 37 Hình 3.29: Hình ảnh thử hoạt tính ức chế phát triển chủng nấm Botryts cinera cặn chiết 39 Hình 3.30: Phổ sắc ký đồ mẫu NB1M4 44 Hình 3.31: Phổ 1H chất 14 48 Hình 3.32: Phổ C13CPD chất 14 49 Hình 3.33: Phổ HSQC chất 14 50 v MỞ ĐẦU Nấm nội sinh vi sinh vật sống tế bào mà không gây tác động tiêu cực Trong nhiều trƣờng hợp, nấm nội sinh có chức bảo vệ chống lại lồi gây bệnh bên ngồi Có hai chế liên quan đến khả bảo vệ này, loài nấm nội sinh trực tiếp sản xuất sản phẩm trao đổi chất để công lồi ngoại lai xâm nhập, chúng kích thích chế phòng vệ chủ Nấm nội sinh kích thích tăng trƣởng cách sản xuất hormone thực vật, tổng hợp siderophore, cố định nito, hòa tan chất khống, ức chế ethylene, trợ giúp trình phytoremediation Nấm nội sinh đƣợc truyền từ hệ sang hệ khác thông qua mô cây, hạt, phƣơng thức truyền giống thực vật khác Trong số 300 ngàn loài thực vật bậc cao, vật chủ nhiều loài nấm nội sinh Tƣơng tác nấm nội sinh chủ tƣơng ứng liên quan đến trình đồng sản xuất phân tử có hoạt tính sinh học, nhiên ngƣời ta chƣa hiểu hết đƣợc chất tƣơng tác Điều quan trọng chất mối quan hệ cộng sinh xác định hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh không hại đến tế bào không gây độc, việc ứng dụng chúng y tế, chữa trị bệnh cho ngƣời có tiềm cao Hợp chất tự nhiên chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính sinh học có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò quan trọng việc đáp ứng nhu cầu giới chất có hoạt tính sinh dƣợc Những lồi nấm nội sinh sống cộng sinh bên tế bào thực vật, chúng đƣợc nghiên cứu sâu rộng giới đƣợc coi nhƣ nguồn tài nguyên vô tận chƣa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dƣợc phẩm Những nghiên cứu nấm nội sinh có nguồn gốc từ biển tìm thấy 270 hợp chất từ năm 1990 tới năm 2002 (2/3 số từ tảo biển ngập mặn) Chỉ khoảng năm từ 2002 tới 2006, tìm 330 hợp chất (là sản phẩm trao đổi chất bậc hai nấm nội sinh) Các hợp chất trao đổi chất bậc hai vi sinh vật sống sản sinh đƣờng quan trọng để giải nhu cầu thuốc y tế ngày tăng giá thành sản xuất rẻ, phong phú cấu trúc, tính Các lồi nấm sống nội sinh tế bào sản sinh hợp chất tƣơng tự, loại hợp chất sản xuất chủ Cũng có trƣờng hợp nấm sản sinh chất mà ngƣời ta không chiết đƣợc từ Thơng qua q trình lên men vi sinh quy mơ lớn, lồi nấm nội sinh sản xuất số lƣợng lớn hợp chất có hoạt tính sinh học với giá thành rẻ để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất dƣợc phẩm Điều quan trọng sử dụng vi sinh vật nội sinh tránh đƣợc việc khai thác cạn kiệt nguồn tài nguyên thực vật, làm đa dạng sinh học đe dọa tuyệt chủng loài cây, gây hậu xấu tới môi trƣờng tự nhiên Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ nghệ vàng chứa tinh dầu, ngồi có chất curcumin Theo y học cổ truyền, nghệ vàng đƣợc phân làm hai vị thuốc Thân rễ to đƣợc gọi khƣơng hoàng, củ nhỏ mọc từ thân rễ đƣợc gọi uất kim Uất kim thƣờng có màu đỏ Nghệ không làm gia vị để tạo màu cho ăn mà đặc biệt nghệ dùng để làm thuốc, có nhiều loại nghệ nhƣng cơng dụng loại nghệ vàng Nghệ vàng có vị đắng cay, có mùi thơm hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thơng kinh thống Nghệ vàng dùng để chữa bệnh: kinh nguyệt không đều, viêm loét dày, ung nhọt, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt Nghệ vàng dùng để điều trị ung thƣ, HIV, tiểu đƣờng, Alzheimer, viêm gan B, C, kháng nấm, chống oxy hóa, sử dụng Mỹ phẩm Thực phẩm [1] Hoạt chất Curcumin c Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin thành phần Curcuminoit – chất củ Nghệ, có tên khoa học (1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5- dione Curcumin có dạng bột màu vàng đƣợc mệnh danh nhƣ loại thần dƣợc có khả phòng chống chữa đƣợc nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu khối u, giúp tăng cƣờng miễn dịch, chống đơng máu, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus Hiện có nhiều nghiên cứu nghệ, nhƣng đối tƣợng nấm nội ký sinh nghệ chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu Vì phân lập nấm nội ký sinh từ nghệ hƣớng nghiên cứu khoa học nói chung lĩnh vực hợp chất thiên nhiên nói riêng Để tm hiểu vấn đề tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nấm nội sinh nghệ vàng (Curcuma longa L.) hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh” Mục tiêu đề tài tm chủng nấm nội sinh nghệ nghiên cứu thành phần hóa học chúng Nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất tự nhiên từ nấm nội sinh CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm nội sinh 1.1.1 Khái niệm quan hệ nấm nội sinh thực vật Nấm nội sinh (Endophytes fungal, Endophytc fungi) vi sinh vật sống mô sâu thực vật nhƣng không gián tiếp trực tiếp gây bất lợi cho [32] Endophytes thúc đẩy tăng trƣởng thực vật thông qua chế khác nhƣ sản xuất phytohormones [10], tổng hợp siderophores [21], cố định đạm [23], hay qua hỗ trợ phytoremediaton [24] Endophytes đƣợc truyền từ hệ thông qua mô vật chủ, hạt giống mầm thực vật [9] Nghiên cứu cho thấy sản phẩm tự nhiên thu đƣợc từ vi khuẩn endophytc có chống vi khuẩn, chống ung thƣ, chống oxy hóa, chống tiểu đƣờng, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm chống bệnh Alzheimer số bệnh khác [26] Giữa nấm nội sinh thực vật có mối quan hệ cộng sinh tƣơng sinh, nấm nội sinh xuất phát từ số bệnh lý thực vật q trình tiến hóa Sự tƣơng tác chủ vi sinh vật gây bệnh suốt trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất đột biến gen từ vi sinh vật gây bệnh chủng nấm nội sinh hữu ích Chúng đƣợc xem nhƣ tác nhân giúp cân hệ vi sinh chủ nhằm ngăn chặn tác nhân vi sinh gây bệnh [7,32] Nấm nội sinh thúc đẩy khả thích nghi sinh thái thực vật chủ Ở số loài cỏ có nấm nội sinh sống, ngƣời ta nhận thấy chúng có khả gia tăng sức chịu đựng khơ hạn chịu đƣợc độc tính nhơm nguồn nƣớc, mơi trƣờng sống… Ngồi việc bảo vệ chống lại số yếu tố bất lợi cho kí chủ nhƣ động vật ăn cỏ côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên đƣợc sinh từ nấm nội sinh đƣợc quan sát, theo dõi đƣợc kết luận khả ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác xâm nhập mô thực vật Trƣớc thực tế này, câu hỏi đƣợc đặt Chất 1-12: Các chất 1-12 đƣợc xác định phƣơng pháp kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) Viện Hợp chất thiên nhiên Thông tin chất 1-12 đƣợc mô tả bảng 3.2: TT Time Faty acids Tên khoa học Hàm lƣợng % 10.39 14: Tetradecanoic acid 0.93 13.57 15:0 Pentadecanoic acid 0.20 16.46 16:1n-7 9-Hexadecenoic acid 2.55 17.22 16: Hexadecanoic acid 29.04 19.69 17: Heptadecanoci acid 2.82 24.07 18: 2(n-6) Octadecadienoic acid 27.98 24.28 18:1(n-9) Octadecenoic acid 28.63 24.49 18:1(n-7) Octadecenoic acid 0.27 25.34 18: Octadecanoic acid 6.9 10 33.75 20:0 Eicosanoic acid 0.34 11 41.92 22:0 Docosanoic acid 0.17 12 49.68 24:0 Tetracosanoic acid 0.17 Bảng 3.2: Thông tin hợp chất 1-12 Chất 1: Tetradecanoic acid (Myristic acid) Chất 2: Pentadecanoic acid (Pentadecylic acid) Chất 3: 9-Hexadecenoic acid (Palmitoleic acid) Chất 4: Hexadecanoic acid (Palmitic) 41 Chất 5: Heptadecanoci acid (Margaric acid) Chất 6: Octadecadienoic acid (Linoleic acid) Chất 7: Octadecenoic acid (Oleic acid) Chất 8: Octadecenoic acid (Vaccenic acid) Chất 9: Octadecanoic acid (Stearic acid) Chất 10: Eicosanoic acid (Arachidic acid) Chất 11: Docosanoic acid (Behenic) Chất 12: Tetracosanoic acid (Lignoceric acid) 42 Hình 3.30: Phổ sắc ký đồ c a mẫu NB1M4 44 Chất 13: β-sitosterol Phân đoạn NB1M6.2 đƣợc rửa n-Hexan kết tnh lại thu đƣợc tinh thể hình kim màu trắng Sau sử dụng sắc ký TLC với chất chuẩn β- sitosterolvà xác định đƣợc hợp chất phân lập đƣợc β-sitosterol O Chất có nhiệt độ nóng chảy 132-133 C, Rf = 0,26 hệ dung mơi triển khai n-Hexan-axeton 9:1 Do kết luận đƣợc chất 13 β-sitosterol Chất 13: β-sitosterol Chất 14: (24R)-Methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol Chất 14 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng tan methanol nóng, nhiệt nóng o chảy 221-224 C, Rf = 0.61 hệ dung môi diclometan- methanol 9:1 Cấu trúc 13 chất 14 đƣợc xác định phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều ( H-NMR, C1 NMR) hai chiều (HSQC), kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Phổ H-NMR cho thấy tín hiệu nhóm methyl, bao gồm hai tín hiệu đơn (singlet) H = 0.91 (3H); 0.54 (3H) bốn tín hiệu kép (doublet) H = 0.99 (J = 6.5 Hz, 3H);H = 0.88 (J = 7.0 Hz, 3H); H = 0.81 (J = 6.5, 3H) H = 0.80 d (J = 6.5, 3H) Ngoài ra, có mặt hai nối đơi thể qua ba tín hiệu, gồm có hai proton vị trí trans nối đôi bị lần H = 5.23 (dd, 1H, 7.5 & 15.5); 5.17 (dd, 1H, & 15.5) proton nối đôi bị ba lần H = 5.08 m (1H); tín hiệu ba nhóm hydroxyl H = 4.48 d (5.5, 1H), 4.22 d (5.5, 1H) 3.58 s (1H); tín hiệu hai nhóm methin có gắn với nhóm hydroxyl H = 3.76 m (1H), 45 3.37 s (1H) 20 aliphatic proton vùng từ 1.2 đến 2.0ppm đƣợc quan sát thấy 13 phổ H-NMR Phổ C-NMR cho thấy phân tử chất 14 có 28 ngun tử cacbon, hồn tồn phù hợp với số liệu phổ H-NMR, bao gồm hai nối đôi C = 139.64 (C), 135.35 (CH), 131.36 (CH) 119.41 (CH); ba cacbon có gắn với oxy C = 74.45 (C), 72.10 (CH), 65.94 (CH); nhóm methyl C = 12.03, 17.25, 17.66, 19.42, 19.71, 20.94 15 cacbon cộng hƣởng vùng từ 21.30 đến 55.30 ppm 13 Công thức phân tử chất 14 C28H46O3 đƣợc rút từ số liệu phổ H, C-NMR HSQC Các liệu phổ cho phép dự đoán chất 14 sterol dạng trihydroxyergostane Cấu trúc chất 14 đƣợc kết luận (24R)- Methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol so sánh với tài liệu [18] Chất đƣợc phân lập trƣớc từ loài san hô mềm Sinularia sp Việc xếp số liệu phổ (bảng 3.3) dựa vào việc phân tích loại phổ, kết hợp so sánh tài liệu tham khảo Chất 14: (24R)-Methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol 46 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 13 Bảng 3.3: Số liệu phổ H- C-NMR HSQC c a chất 14 (DMSO, 500 125 MHz) 1H (DMSO) HSQC (DMSO) Chất tài 13C (DMSO) liệu [18] NB1M8.1 NB1M8.1 NB1M8.1 1.6 m & 1.2 m 31.15/1.6 & 1.2 32.6 31.15 CH2 1.4 m & 1.3m, 1H 32.44/ 1.4 & 1.3 33.9 32.44 CH2 3.76 m, 1H 65.94/ 3.76 67.6 65.94 CH 1.9 m & 1.4 m 40.00/ 1.9 & 1.4 41.9 40.00 CH2 74.45 76.1 74.45 C 3.37 m, 1H 72.10/ 3.37 74.2 72.10 CH 5.08 m, 1H 119.41/ 5.08 120.4 119.41 CH 139.64 141.6 139.64 C 1.92m, 1H 42.24/ 1.92 43.8 42.24 CH 36.62 38.1 36.62 C 1.42 m 21.30/ 1.42 22.4 21.30 CH2 1.95 m & 1.23 m 39.0/ 1.95 & 1.23 39.9 39.0 CH2 42.96 43.8 42.96 C 1.80 m 54.14 / 1.80 55.3 54.14 CH 1.48 m & 1.3 m 22.56/ 1.48 & 1.3 23.5 22.56 CH2 1.7 m & 1.2 m 27.67/ 1.7 & 1.2 28.5 27.67 CH2 1.25 m 55.30/ 1.25 56.2 55.30 CH 0.91 s, 3H 17.66/ 0.91 18.8 17.66 CH3 0.54 s, 3H 12.03/0.54 12.5 12.03 CH3 0.99 d (6.5 , 3H) 20.94/0.99 21.5 20.94 CH3 2.0 m 39.95/ 2.0 40.8 39.95 CH 5.17 dd, 1H, & 15.5 135.35/ 5.17 136.2 135.35 CH 5.23 dd, 1H 7.5 & 15.5 131.36/ 5.23 132.1 131.36 CH 1.82 m, 1H 41.98/ 1.82 43.1 41.98 CH 1.4 m, 1H 32.44/ 1.4 33.4 32.44 CH 0.80 d (6.5, 3H) 19.42/0.80 19.8 19.42 CH3 0.81 d (6.5, 3H) 19.71/ 0.81 20.2 19.71 CH3 0.88 d (7.0, 3H) 17.25/ 0.88 17.8 17.25 CH3 4.48 d (5.5, 1H) OH 4.22 d (5.5, 1H) OH 3.58 s, 1H OH 47 Hình 3.31: Phổ 1H chất 14 48 Hình 3.32: Phổ C13CPD chất 14 49 Hình 3.33: Phổ HSQC chất 14 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ kết nghiên cứu trên, kết luận rằng: Trong nghệ vàng (Curcuma longa L.) phát đƣợc 17 loại nấm nội sinh có hình thái đặc điểm sinh trƣởng, phát triển khác Trong số xác định phân loại đƣợc chủng nấm nội sinh: chủng thuộc vào chi Trichodema, chủng thuộc vào chi Fusarium Những chủng nấm nội sinh đƣợc phân lập từ đối tƣợng thực vật khác cho kết khoa học thú vị Nghiên cứu hợp chất thiên của chủng nấm Fusarium sp (B1) nghệ vàng, xác định đƣợc cặn chiết MeOH chủng nấm có tác dụng ức chế cao sinh trƣởng, phát triển nấm gây bệnh thối xám (Botrytis cinera) nồng độ 1500 ppm so với đối chứng 56,5% Chúng xác định đƣợc cấu trúc hóa học 14 chất hóa học có chủng nấm Trong đó, có 12 loại acid (chất 1-12), chất 13 (β-sitosterol) chất phổ biến đối tƣợng thực vật có nấm nội sinh, chất 14 ((24R)-Methylcholesta-7,22diene-3β,5α,6β-triol) đƣợc tìm thấy lồi san hơ mềm Sinularia sp Kiến nghị: Từ kết nghiên cứu cho thấy nghiên cứu nấm nội sinh hƣớng nghiên cứu có tềm lớn Đặc biệt lĩnh vực hợp chất thiên nhiên nhằm tìm hợp chất lĩnh vực y học với mục đích tm nguồn cung cấp tạo hợp chất điều trị bệnh Vì nên chúng tơi đề nghị đƣợc tiếp tục đƣợc nghiên cứu chủng loài chủng nấm nội sinh lại phân lập hợp chất tự nhiên nấm nội sinh Ngoài ra, hợp chất tách chiết đƣợc cần thử hoạt tính sinh học khác nhƣ: kháng vi khuẩn, kháng viêm, chống ung thƣ, 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (1997),(2012), 300, “Từ điển thuốc Việt Nam”, Nxb Y học, Hà Nội, 267-270 [2] Trần Thị Nhƣ Hằng cộng sự, (2009), Xác định cấu trúc thử hoạt tính sinh học ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh Khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep), Tạp chí dƣợc học (400), trang 60-65 [3] Lê Mai Hƣơng cộng sự, (2005), Phân lập sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam, Tạp chí dƣợc học (352), trang 20-23 [4] Nguyễn Đinh Nga cs (2010), Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng Candida albicans, Tạp chí Y – Dƣợc học quân 4, 17-24 [5] Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hƣng, Nguyễn Văn Nam, (2012), “Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh hợp chất hóa học có hoạt tnh kháng nấm gây bệnh dòng Keo tai tượng khảo nghiệm Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 2, 2243-2252 [6] Đàm Sao Mai, Võ Trung Âu, (2014), “Nghiên cứu phân lập xác lập môi trường nuôi cấy phân lập vi nấm cộng sinh phân lập từ thông đỏ vùng Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Sinh học, 36(1se), 84-89  Tài liệu tiếng Anh [7] Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri, Kollam 690525, Kerala, India, (2015), “Pharmacollogical profile of mangrove endophytes – a review”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences Vol 7, Issue 1, 615 [8] Aswathy A J., Jasim B., Jyothis M., Radhakrishnan E.K., (2012), “Identfcation of two strains of Paenibacillus sp as indole acetc acid- producing endophytic bacteria from Curcuma longa”, 52 rhizome-associated School of Biosciences, Mahatma Gandhi University, Priyadarshini Hills, Kottayam, Kerala, India, 686 – 560 [9] Carroll G., (1988), “Fungal endophytes in stems and leaves: from latent pathogen to mutualistic symbiont”, Ecol, 69, 2-9 [10] Carroll G.C., Tudzynski P, (1997), “Fungal phytohormones in pathogenic and mutualistic associations”, The Mycota V: plant relationships part A Berlin: SpringerVerlag, 167–184 [11] Castillo U.F., Strobel G.A., Ford E.J., Hess W.M., Porter H., Jensen J.B., Albert H., Robison R., Condron M.A.M., Teplow D.B.,Stevens D., Yaver D.,(2002) “Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces (NRRL 30562) endophytic on Kennedia nigriscans” Microbiology 148, 2675–2685 [12] Cui Y., Yi D., Bai X., Sun B., Zhao Y., Zhang Y., (2012), “Ginkgolide B produced endophytic fungus (Fusarium oxysporum) isolated from Ginkgo biloba”, Fitoterapia, 83, 913–920 [13] Hammerschmidt L & cộng (2014), “Polyketides from the mangrove- derived endophytic fungus Acremonium strictum”, Tetrahedron Letters, 55, 2463 - 3468 [14] Huang H., Feng X., Xiao Z., Liu L., Li H., Ma L., Lu Y., Ju J., She Z., Lin Y., (2011), “Azaphilones and p-terphenyls from the mangrove endophytic fungus Penicillium chermesinum (ZH4-E2) isolated from the South China Sea”, J Nat Prod, 74(5), 997-1002 [15] Joel E.L., Bhimba B.V., (2011) “In vitro anti-inflammatory activity of mangrove associated fungi”, J Pharm Res, 4(9), 2900-2901 [16] John G.O., Gregory L.H., Oto D.H., Michael A.G., cộng sự, (1997), “Nodulisporic Acid A, a Novel and Potent Insectcide from a NodulisporiumSp Isolation, Structure Determination, and Chemical Transformatons”, J Am Chem Soc, 119, 8809-8816 53 [17] Kjer J., Debbab A., Amal H.A & Proksch P., (2010), “Methods for isolation of marine-derived endophytc fungi and their bioactve secondary products”, Nature protocols , vol.5, no.3, 479–490 [18] Kobayashi M., Krishna M., Anjaneyulu V, “ Isolaton of 24methylenecholestane-1α, 3β, α, β, 16β - pentol from Sinularia sp of soft coral”, Marine sterols XXIV, Chem Pharm Bull., 40, 2845–2846 [19] Kusari S., Zühlke S., Spiteller M., (2009), “An endophytc fungus from Camptotheca acuminata that produces camptothecin and analogues”, J Nat Prod, 72(1), 2-7 [20] Li W., Zhou J., Lin Z., Hu Z., (2007), “Study on fermentation conditon for production of huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrata” Chinese Medicinal Biotechnology, 2, 254-259 [21] O’Sullivan D J., O’Gara F., (1992), “Traits of fluorescent Pseudomonas spp involved in suppression of plant root pathogens”, Microbiol Rev, 56, 662–676 [22] Raviraja N.S., (2005), “Fungal endophytes in five medicinal plant species from Kudremukh Range, Western Ghats of India”, J Basic Microbiol, 45(3), 230-235 [23] Richardson A E., Barea J M., McNeill A.M., Prigent-Combaret C (2009), “Acquisiton of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and plant growth promotion by microorganisms”, Plant Soil, 321, 305–339 [24] Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N., (2008), “Bacterial endophytes: recent developments and applications”, FEMS Microbiol Let, 278, 1–9 [25] Sean F B and Clardy J., (2000) “CR377, a new pentaketde antifungal agent isolated from an endophytic fungus”, J Nat Prod., 63 (10), 1447–1448 54 [26] Shukla S T., Habbu P V., Kulkarni V H., Jagadish K S., Pandey A R., Sutariya V N., (2014), “Endophytic microbes: a novel source for biologically/pharmacologically active secondary metabolites”, Asian J Pharmacol Toxicol, 2(3), 1-16 [27] Song Y., Wang J., Huang H., Ma L cộng sự, (2012), “Four eremophilane sesquiterpenes from the mangrove endophytic fungus Xylaria sp BL321”, Mar Drugs, 10(2), 340–348 [28] Sterle A., Strobel G A & Stierle D., (1993), “Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew”, Science, 260, 214–216 [29] Strobel G A., Sterle A., Sterle D & Hess W M., (1993), “Taxomyces andreanaea proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacifc yew”, Mycotaxon, 47, 71–80 [30] Strobel G and Daisy B., (2003), “Bioprospectng for microbial endophytes and their natural products”, Microbiol Mol Biol Rev, 67(4), 491– 502 [31] Strobel G., (2006), “Muscodor albus and its biological promise”, J Ind Microbiol Biotechnol”, 33(7), 514-522 [32] Taechowisan T., Lumyong S., (2003), "Activity of endophyte actnomycetes from roots of Zingiber ofcinale and Alpinia galang against phytopathogenic fungi", Annals of Microbiology, 53 (3), 291 – 298 [33] Tan R., Zou W X., (2001), “Endophytes: a rich source of functional metabolites”, Nat Prod Rep, 18(4), 448-459 [34] Wang J., Daniel G Cox, Ding W., Huang G., Lin Y and Li C., (2014), “Three New Resveratrol Derivatives from the Mangrove endophytic fungus Alternaria sp”, Mar Drugs, 12(5), 2840-2850 55  Nguồn internet [35] Minh Tâm Mai Lan, Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên (2013), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, , xem ngày 1/5/2015 Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Giáo viên hƣớng dẫn Học viên Dƣơng Ngọc Tú Nghiêm Văn Đức 56 ... sinh nghệ vàng (Curcuma longa L. ) hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh Mục tiêu đề tài tm chủng nấm nội sinh nghệ nghiên cứu thành phần hóa học chúng Nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất tự nhiên. .. tâm nghiên cứu Vì phân l p nấm nội ký sinh từ nghệ hƣớng nghiên cứu khoa học nói chung l nh vực hợp chất thiên nhiên nói riêng Để tm hiểu vấn đề tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu nấm nội sinh. .. terphenyls từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum 10 (ZH4-E 2) có hoạt tính ức chế AchE Ngoài ra, họ nghiên cứu hợp chất nấm nội sinh ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp sk5GW 1L Penicillium