Nghiên cứu tối ưu khả năng sinh tổng hợp và sơ bộ tinh sạch lipase từ chủng geotrichum candidum geo 26 3

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẬP MÃ SINH VIÊN: 1201566 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ SƠ BỘ TINH SẠCH LIPASE TỪ CHỦNG GEOTRICHUM CANDIDUM GEO 26.3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẬP MÃ SINH VIÊN: 1201566 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ SƠ BỘ TINH SẠCH LIPASE TỪ CHỦNG GEOTRICHUM CANDIDUM GEO 26.3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh TS Đỗ Thị Tuyên Nơi thực hiện: Viện Công nghệ sinh học Bộ môn Hóa Sinh HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ truyền đạt tri thức quý báu cho em suốt thời gian em học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, anh chị phòng Công nghệ sinh học enzym – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình hướng dẫn em trình nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, người trực tiếp bảo, hướng dẫn em từ ngày đầu tham gia nghiên cứu khoa học Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh Cô không người thầy giúp em định hướng, học tập nghiên cứu khoa học, mà cô người bạn - cho em lời khuyên chân thành sống Đó hành trang quý giá để em tự tin, vững chãi bước đường nghiệp sống sau Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình bạn bè động viên tiếp thêm sức mạnh cho em lúc khó khăn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Sinh Viên Nguyễn Thị Thập MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzyme lipase 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân bố tự nhiên 1.1.3 Cấu trúc .3 1.1.4 Đặc điểm xúc tác .5 1.1.5 Ứng dụng lipase 1.2 Chủng Geotrichum candidum 10 1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 10 1.2.2 Hình thái 11 1.2.3 Điều kiện nuôi cấy 11 1.2.4 Ứng dụng .11 1.3 Enzym lipase từ chủng Geotrichum candidum 12 1.3.1 Cấu trúc 12 1.3.2 Đặc điểm hóa lý, vị trí tiết enzym .13 1.3.3 Đặc điểm xúc tác .13 1.3.4 Ứng dụng y dược 15 1.3.5 Tình hình nghiên cứu lipase từ chủng Geotrichum candidum giới Việt Nam 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Chủng giống, hóa chất, thiết bị 19 2.1.1 Chủng giống 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 20 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Nuôi cấy chủng giống .22 2.3.2 Xác định hoạt tính enzym lipase .22 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố tới khả sinh tổng hợp lipase chủng G.candidum Geo 26.3 23 2.3.4 Tối ưu hóa khả sinh tổng hợp lipase phương pháp đáp ứng bề mặt, phương án cấu trúc có tâm 25 2.3.5 Tinh enzym amoni sulfat 27 2.3.6 Xác định hàm lượng protein 29 2.3.7 Xử lý số liệu 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Kết .31 3.1.1 Ảnh hưởng số yếu tố tới khả sinh tổng hợp lipase 31 3.1.2 Tối ưu hóa khả sinh tổng hợp lipase 37 3.1.3 Tinh enzym lipase 41 3.2 Bàn luận .43 3.2.1 Về kết tối ưu hóa khả sinh tổng hợp lipase từ chủng G.candidum Geo26.3 phương pháp RSM-CCD 43 3.2.2 Về kết tinh lipase từ chủng G.candidum Geo26.3 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN 49 CHƯƠNG KIẾN NGHỊ 49 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ ACEIs Angiotensin coverting enzyme inhibitors Nhóm thuốc ức chế men chuyển AN Amoni nitrat APS Amoni persulfat AS Amoni sulfat BĐT Bột đậu tương CCBs Calcium channel blockers Nhóm thuốc chẹn kênh canxi CNM Cao nấm men DĐN Dầu đậu nành DHPA 9-(2,3-dihydroxy propyl)adenin GLA Gamma-linoleic acid NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory drugs Nhóm thuốc giảm đau, chống viêm phi steroid PUFA Polyunsaturated fatty acid Acid béo không bão hòa có nhiều nối đôi SD Sabouraud dextrose SDA Sabouraud dextrose agar SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các chủng vi sinh vật sản xuất lipase Bảng 1.2 Các ứng dụng chung lipase 10 Bảng 1.3 Đặc điểm hóa lý số lipase ngoại bào G.candidum 13 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 19 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 20 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 21 Bảng 2.4 Thành phần môi trường khảo sát nguồn carbon nitrogen hữu 24 Bảng 2.5 Thành phần gel cô gel tách 29 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen hữu đến hoạt tính lipase (xác định phương pháp chuẩn độ pH tự động) 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính lipase 34 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến hoạt tính lipase 35 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dầu đậu nành đến hoạt tính lipase 36 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ amoni nitrat đến hoạt tính lipase 37 Bảng 3.6 Phạm vi nghiên cứu biến 38 Bảng 3.7 Giá trị hàm đáp ứng thực nghiệm 38 Bảng 3.8 Phân tích phương sai (ANOVA) 39 Bảng 3.9 Hoạt tính enzym mức kì vọng phương án tối ưu 40 Bảng 3.10 Độ hiệu suất tủa protein amoni sulfat khoảng nồng độ khác 41 Bảng 3.11 Độ hiệu suất tủa protein amoni sulfat 55 – 65% 42 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu 22 Sơ đồ 2.2 Quá trình tinh 27 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc α/β lipase Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác lipase Hình 1.3 Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân triglycerid lipase Hình 1.4 Hai dạng lỗ oxyanion Hình 1.5 Trạng thái đóng (màu xanh) mở (màu tím) nắp che vị trí hoạt động lipase từ chủng Rhizomucor miehei Hình 1.6 Các kiểu xúc tác đặc hiệu lipase Hình 1.7 Đặc điểm hình thái G.candidum 11 Hình 1.8 Cấu trúc không gian lipase từ chủng G.candidum 12 Hình 1.9 Lipase chủng ATCC34614 xúc tác đặc hiệu vị trí liên kết số 14 Hình 1.10 Ester hóa 9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin có lipase xúc tác 16 Hình 2.1 Đường chuẩn Bradford có sử dụng BSA làm chuẩn 30 Hình 3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen hữu đến hoạt tính lipase (xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch) 31 Hình 3.2 Ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen hữu đến hoạt tính lipase (xác định phương pháp chuẩn độ pH tự động) 32 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính lipase 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến hoạt tính lipase 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ dầu đậu nành tới hoạt tính lipase 36 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ amoni nitrat đến hoạt tính lipase 37 Hình 3.7 Mặt đáp ứng hoạt tính lipase theo nồng độ CNM AN (1) theo nồng độ DĐN AN (2) 39 Hình 3.8 Điện di đồ enzym tủa amoni sulfat nồng độ khác 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Lipase (EC 3.1.1.3) nhóm enzym thủy phân triglycerid, ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác Trong năm gần đây, mối quan tâm nhu cầu sử dụng lipase ngày tăng, khiến cho thị phần lipase thị trường giới tăng cách đáng kể, doanh số dự tính thu từ lipase năm 2020 khoảng 590,4 triệu USD [54] Đây lí nguồn sản xuất, đặc tính vượt trội sản phẩm, phương pháp làm tăng hiệu suất sản xuất lipase nhà khoa học giới vô quan tâm Từ lâu, vi sinh vật biết đến nguồn sản xuất lipase phong phú đem lại lợi ích kinh tế lớn, đó, Geotrichum candidum (G.candidum) nhân tố tiềm Lipase sản xuất từ G.candidum có nhiều đặc tính vượt trội tính xúc tác đặc hiệu loại acid béo [17] [26], đặc hiệu vị trí liên kết [73] [76], đặc hiệu lập thể [88] tính an toàn [64] Với ưu điểm đó, lipase từ G.candidum không ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp hóa chất, thực phẩm mà công cụ hiệu tổng hợp hóa dược Từ lâu, lipase từ chủng G.candidum sử dụng làm chất xúc tác cho trình tổng hợp acid béo không bão hòa [32] thực phẩm bổ sung hiệu điều trị nhiều bệnh khác Gần đây, lipase nghiên cứu sử dụng làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp ester tiền thuốc kháng virus để tăng sinh khả dụng đường uống [16] Không nằm xu hướng chung toàn cầu, Việt Nam, chủng G.candidum enzym lipase nhà khoa học vô quan tâm Rất nhiều nghiên cứu phân lập vi sinh vật, tìm hiểu đặc tính hay tái tổ hợp lipase thực [2] [4] Không dừng lại đó, nhằm mục đích gia tăng quy mô sản xuất lipase từ G.candidum, điều kiện vật lí, sinh hóa ảnh hưởng tới trình lên men nhà khoa học tiến hành tối ưu hóa phương pháp truyền thống: tối ưu hóa yếu tố giữ nguyên yếu tố khác Tuy nhiên, cách thực tốn thời gian không xác định tác động qua lại yếu tố thí nghiệm quy hoạch cách khoa học làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm, công sức, thời gian, chi phí mà có phân tích thống kê giúp người nghiên cứu đánh giá mức độ tin cậy mô hình mà phần mềm xây dựng Rõ ràng, phương pháp đáp ứng bề mặt có nhiều ưu điểm vượt trội so với cách làm truyền thống; chọn đáp ứng bề mặt với kiểu thiết kế cấu trúc có tâm phương pháp nghiên cứu cho đối tượng Đối với vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy yếu tố vô quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu suất sản xuất enzym Chủng G.candidum sản phẩm lipase ngoại lệ, điều kiện nuôi cấy không định hiệu suất sản xuất mà định đặc tính xúc tác lipase Trong đó, với kinh tế khoa học phát triển Việt Nam, nguồn dinh dưỡng, hàm lượng dinh dưỡng thời gian lên men yếu tố cần quan tâm hàng đầu mối liên hệ chặt chẽ chúng chi phí sản xuất Hiểu tầm quan trọng đó, chọn nguồn dinh dưỡng, hàm lượng nguồn dinh dưỡng thời gian lên men yếu tố ban đầu để tiến hành khảo sát Hơn nữa, cố gắng lựa chọn nguồn dinh dưỡng hiệu rẻ tiền sẵn có Việt Nam bột đậu tương, bột mỳ, dầu đậu nành, …Từ lâu, nhà khoa học phát có mặt loại dầu môi trường lên men làm tăng khả sinh tổng hợp lipase G.candidum, không đóng vai trò nguồn carbon cung cấp dinh dưỡng cho vi sinh vật mà chất cảm ứng kích thích vi sinh vật sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn Những nghiên cứu ban đầu cho thấy, chủng G.candidum Geo26.3 sinh tổng hợp lipase mạnh mẽ có mặt dầu ô-liu, nhiên dầu ô-liu đắt đỏ không sẵn có Việt Nam, nên chọn dầu đậu nành để thay thế, loại dầu cho kết thua dầu ô-liu không đáng kể lại rẻ tiền nhiều Bên cạnh đó, chọn bột đậu tương, bột mỳ cao nấm men nguồn dinh dưỡng chính, chúng không nguồn nitrogen hữu dồi mà cung cấp lượng đáng kể carbohydrat loại khoáng cần thiết cho sinh trưởng vi sinh vật; nữa, giá thành chúng thấp, ngoại trừ cao nấm men Tuy nhiên, giới, cao nấm men lại 44 nguồn nitrogen lựa chọn nhiều môi trường lên men G.candidum tính hiệu thực tế, khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen hữu chúng tôi, cao nấm men nguồn dinh dưỡng có hiệu vượt trội so với nguồn dinh dưỡng khác Các lựa chọn phù hợp với số nghiên cứu tương tự giới [55] (cao nấm men, rác thải chứa dầu hoa hướng dương), [22] (dầu đậu nành, amoni nitrat, bột ngô), [33] (dầu đậu nành), … Sau tiến hành tối ưu hóa phương pháp đáp ứng bề mặt, lựa chọn điều kiện lên men G.candidum Geo26.3 tối ưu môi trường lên men chứa: 0,5% cao nấm men; 0,5% dầu đậu nành; 0,31% amoni nitrat; 1% bột đậu tương thời gian lên men 72h; thu enzym có hoạt tính 56,456 IU/ml So với trước tối ưu hóa, enzym thu có hoạt tính 12 IU/ml lên men 96h môi trường chứa: 1% cao nấm men; 1% dầu đậu nành; 0,2% amoni nitrat; hoạt tính enzym tăng khoảng 4,5 lần nồng độ cao nấm men dầu đậu nành giảm lần Như vậy, phương pháp bước đầu đáp ứng mục tiêu đề ra: nâng cao hiệu suất giảm chi phí sản xuất Trên giới, đáp ứng bề mặt áp dụng để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy G.candidum kết khác Trong Burkert et al thu hoạt tính tối ưu 20 IU/ml môi trường lên men chứa 2,1 – 2,5% amoni nitrat; 13 – 15% bột ngô; 0,6% bột đậu tương thiết kế kiểu giai thừa [22] Gopinath et al lại thu enzym có hoạt tính 87,7 IU/ml lên men chủng điều kiện: nuôi cấy ngày; pH 7,0; nhiệt độ 30oC; 1,25% galactose; 2,0% cao nấm men; 1,0% Tween 0,05 mM amoni nitrat thiết kế Box-Behnken [35] Mặc dù có số tương đồng định thành phần nguồn dinh dưỡng môi trường lên men, enzym thu có phần vượt trội hoạt tính so với kết Burkert (cao gấp 2,7 lần) So với kết Gopinanth, enzym có hoạt tính thấp khoảng 1,55 lần bù lại, thời gian lên men nửa, nồng độ cao nấm men thấp lần làm giảm đáng kể chi phí sản xuất 45 3.2.2 Về kết tinh lipase từ chủng G.candidum Geo26.3 Tinh bước vô quan trọng protein, đặc biệt enzym lợi ích khoa học kinh tế vô lớn mà enzym tinh mang lại: tiếp tục nghiên cứu cấu trúc 3D, chế xúc tác, đặc tính hóa lý, tính xúc tác đặc hiệu enzym; hay làm tăng hiệu suất xúc tác enzym nhờ tăng hoạt tính riêng, …Vì thế, với nghiên cứu ban đầu lipase từ chủng G.candidum Geo26.3 tại, nghiên cứu điều kiện tinh nhu cầu thiết yếu, tảng cho nghiên cứu Hơn nữa, công nghệ dược phẩm, độ nguyên liệu sản xuất ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng sản phẩm nên chúng kiểm soát vô chặt chẽ khắt khe Do đó, để trở thành công cụ công nghiệp hóa dược, tinh điều kiện tất yếu lipase Có nhiều phương pháp sử dụng để tinh enzym như: tủa protein, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel, sắc kí lực, …Dựa vào tính chất enzym mà enzym có phương pháp tinh phù hợp Trên thực tế, phương pháp thường phối hợp với cách hợp lí để thu enzym có độ hiệu suất thu hồi cao Để tinh lipase từ chủng G.candidum, nhiều phương án phối hợp phương pháp tinh thực hiện, phần lớn gồm bước tinh sơ phương pháp tủa protein, sau tiếp tục tinh sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel kết hợp sắc kí trao đổi ion sắc kí lọc gel Trên sở đó, chọn tủa protein bước tinh cho chuỗi nghiên cứu Để tinh enzym phương pháp tủa protein, thường sử dụng muối amoni sulfat số dung môi hữu như: aceton, ethanol, trichloroacetic Khác với phương pháp tủa amoni sulfat phải cần nhiều thời gian để tủa protein cần thêm bước thẩm tích để loại muối khỏi enzym, tác nhân lại cần thời gian tiến hành Tuy nhiên, dung môi hữu lại thường có xu hướng giảm độ ổn định, gây biến tính protein, đòi hỏi điều kiện thí nghiệm khắt khe hiệu suất thu hồi thường thấp so với tủa amoni sulfat Do đó, với điều kiện thí nghiệm sẵn có, cho amoni sulfat tác nhân tủa protein 46 phù hợp Trên giới, tủa protein amoni sulfat phương pháp sử dụng nhiều để tinh sơ lipase từ chủng G.candidum, chủ yếu phương pháp tủa giai đoạn nồng độ nằm khoảng 55 – 80% Gopinath et al., 2003 sử dụng amoni sulfat 70%, thu enzym có độ tăng 1,03 lần; hiệu suất 56,48% [35] So sánh với enzym có độ tăng 1,49 lần hiệu suất 14,73% Điều dễ dàng giải thích, tiến hành tủa giai đoạn với khoảng nồng độ sát 55 – 65%, nồng độ 55% có nhiều protein bị tủa loại, có nhiều protein tạp lipase nữa, enzym có độ cao hiệu suất lại thấp Cai et al., 2009 tiến hành tủa giai đoạn khoảng nồng độ 30 – 60%, hiệu suất thu hồi lipase A 11,2% lipase B 9,2% [24]; thấp so với kết Trong đó, Muhammad et al., 2017 tiến hành tủa lipase amoni sulfat 60% thu enzym có độ tăng 6,63 lần; hiệu suất 58,5% [57] kết đáng ngạc nhiên cho bước tinh sơ bộ, điều cho phép ta nghĩ trường hợp này, enzym thô ban đầu protein tạp chúng có khả tích điện khác – điều kiện lí tưởng để tiến hành tinh protein amoni sulfat Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứu chọn dung môi hữu để tinh sơ lipase như: tủa ethanol thu enzym có độ tăng 1,28 lần hiệu suất 82% [79]; hay phối hợp tủa aceton sắc kí cột Q-Sepharose thu enzym có độ tăng 1,15 lần hiệu suất 96% [55]; tủa lipase aceton, hiệu suất đạt 30,82% độ không tăng, chí hoạt tính riêng giảm 1,2 lần [56] Nhìn chung, enzym thu từ bước tủa protein thường có độ thấp (1 – 1,5 lần), hiệu suất dao động lớn Như vậy, với kết tăng 1,49 lần; nói enzym thu từ phương pháp có độ cao so với nghiên cứu tương tự giới Lipase từ chủng G.candidum có khối lượng phân tử dao động, đa số lipase có khối lượng phân tử lớn (≥ 50 kDa), nhiên có nhiều báo cáo lipase với trọng lượng phân tử thấp như: 41,1 kDa 35,8 kDa [24]; 38,3 kDa 47 [33]; 32 kDa [35] Kết điện di sau bước tinh amoni sulfat cho thấy điện di đồ dịch enzym sau tủa băng có kích thước khoảng 45 kDa thường thấy nghiên cứu trước, xuất thêm băng vị trí 25 kDa Vì loại lipase tạo phụ thuộc nhiều vào chủng G.candidum vào điều kiện môi trường nuôi cấy nên chủng G.candidum Geo26.3, chủng G.candidum phân lập từ vùng biển Việt Nam, điều kiện nuôi cấy chúng tôi, sinh tổng hợp loại lipase Để kiểm định giả thuyết mình, cần tiếp tục xác định cấu trúc hoạt tính băng protein lạ Tuy dự đoán ban đầu, kết cho phép hy vọng vào xuất loại lipase từ Việt Nam với nhiều đặc tính hứa hẹn 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN Sau tiến hành tối ưu hóa khả sinh tổng hợp tinh lipase từ chủng Geotrichum candidum Geo26.3, rút kết luận sau: - Đã xác định điều kiện lên men tối ưu sinh tổng hợp lipase từ chủng Geotrichum candidum Geo26.3 phương pháp đáp ứng bề mặt: lên men 72h môi trường chứa 0,5% (w/v) CNM; 0,5% (v/v) DĐN; 0,31% (w/v) AN 1% (w/v) BĐT Nuôi cấy Geotrichum candidum Geo26.3 điều kiện thu lipase dịch lên men có hoạt tính 56,456 IU/ml - Đã sơ tinh lipase từ chủng Geotrichum candidum Geo26.3 phương pháp tủa amoni sulfat giai đoạn nồng độ 55 – 65% với độ tăng lên 1,49 lần hiệu suất tinh đạt 14,73% CHƯƠNG KIẾN NGHỊ Giải trình tự băng protein có kích thước 25 kDa phát Nghiên cứu biện pháp tinh để nâng cao độ hiệu suất tinh lipase từ chủng Geotrichum candidum Geo26.3 Nghiên cứu cấu trúc đặc điểm hóa lí lipase tinh 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Huỳnh Thị Thanh Hiền, Trịnh Thị Bích Huyền, et al (2010), "Sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp đáp ứng bề mặt thiết kế cấu trúc có tâm nhằm tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Bacillus licheniformis GBDTY1", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp 811-818 Trương Thị Bích Huệ (2006), Phân lập số chủng vi sinh vật biển sinh tổng hợp lipase đánh giá tính chất lý hóa, Khóa luận tốt nghiệp hệ Đại học quy, Đại học Khoa học Tự nhiên Bùi Hồng Quân, Nguyễn Đức Lượng (2009), "Tối ưu hóa sinh tổng hợp Li- pase từ Pichia anomala VTCC Y0787 sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp đáp ứng bề mặt - phương án cấu trúc có tâm", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(4), pp 493-500 Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2007), "Một số tính chất hóa lý lipase ngoại bào chủng Geotrichum sp DTQ-26.3", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(31-40), pp Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, et al (2006), "Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Geotrichum sp DTQ-26.3 sinh tổng hợp lipase", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4, pp 455-462 Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, et al (2007), "Tuyển chọn nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp beta-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae", Tạp chí Khoa học Công nghệ, Tập 45(Số 1), pp 23-31 Tiếng Anh Almeida A.F., Tauk-Tornielo S.M., et al (2013), "Acid lipase from Candida viswanathii: Production, biochemical properties, and potential application", Biomes Res Int, 2013, pp 1-10 Asses N., Ayed L., et al (2009), "Use of Geotrichum candidum for olive mill wastewater treatment in submerged and static culture", Bioresource Technology, 100, pp 2182-2188 Baillargeon M.W., Bistline R.G., et al (1989), "Evaluation of strains of Ge- otrichum candidum for lipase production and fatty acid specificity", Appl Microbiol Biotechnol, 30, pp 92-96 10 Barnett J., Payne R., et al (2000), Yeasts: Characteristics and Identification, Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp 1139 11 Bertolini M.C., Laramée l., et al (1994), "Polymorphism in the lipase genes of Geotrichum candidum strains", Eur J Biochem, 219, pp 119-125 12 Boel E., Huge-Jensen B., et al (1998), "Rhizomucor miehei triglycerid lipase is synthesized as a precursor", Lipids, 23, pp 701-706 13 Borkar P.S., Bodade R.G., et al (2009), "Purification and characterization of extracellular lipase from a new strain − Pseudomonas aeruginosa SRT 9", Brazilian Journal of Microbiology, 40, pp 358-366 14 Bornscheuer U.T., Bessler C., et al (2002), "Optimizing lipases and related enzymes for efficient application", Trends in biotechnology, 20(No.10), pp 433437 15 Boutrou R., Guéguen M (2005), "Interests in Geotrichum candidum for cheese technology", International Journal of Food Microbiology, 102, pp 1-20 16 Brabcová J., Blažek J., et al (2012), "Lipases as tools in the synthesis of prodrugs from racemic 9-(2,3-Dihydroxypropyl)adenine", Molecules, 17, pp 13813-13824 17 Brabcová J., Zarevúcka M., et al (2010), "Differences in hydrolytic abilities of two crude lipases from Geotrichum candidum 4013", Yeast, 27, pp 1029-1038 18 Bradford M.M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding ", Anal Biochem, 72, pp 248-254 19 Brady L., Brzozowski A.M., et al (1990), "A serine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase", Nature, 343, pp 767-770 20 Budeiri D., Li Wan P.A., et al (1996), "Is evening primrose oil of value in the treatment of premenstrual syndrome", Control Clin Trials, 17, pp 60-68 21 Burgess R.R (2009), "Protein precipitation techniques", Methods in Enzy- mology, 463, pp 331-342 22 Burkert J.F.M., Maugeri F., et al (2004), "Optimization of extracellular li- pase production by Geotrichum sp using factorial design", Bioresource Technology, 91, pp 77-84 23 Cai J., Jiang W.G., et al (1999), "Inhibition of angiogenic factor- and tu- mour-induced angiogenesis by gamma linolenic acid", Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 60, pp 21-29 24 Cai Y., Wang L., et al (2009), "Purification and partial characterization of two new cold-adapted lipases from mesophilic Geotrichum sp SYBC WU-3", Process Biochemistry, 44, pp 786-790 25 Chakavarti B., Chakavarti D (2008), "Electrophoretic Separation of Pro- teins", J Vis Exp, 16, pp 758 26 Charton E., Macrae A.R (1993), "Specificities of immobilized Geotrichum candidum CMICC 335426 lipases A and B in hydrolysis and ester synthesis reactions in organic solvents", Enzyme Microbial Technol, 15, pp 489-493 27 Derewenda U., Brzozowski A.M., et al (1992), "Catalysis at the interface - the anatomy of a conformational change in a triglyceride lipase", Biochemistry, 31, pp 1532-1541 28 Dokholyan S.R., Albert C.M., et al (2003), "A trial of omega-3 fatty acids for prevention of hypertension", Am J Cardiol, 93, pp 1041-1043 29 Ducret A., Trani M., et al (1998), "Lipase catalysed enantioselective esteri- fication of ibuprofen in organic solvent under controlled water activity", Enzyme Microb Technol, 22, pp 212-216 30 Dziuba E., Wojtatowicz M., et al (2000), "The use of Geotrichum candidum starter cultures in malting of brewery barley", Food Biotechnology, pp 311-316 31 Eriksen B.B., Kare L.D (2006), "Open trial of supplements of omega and fatty acids, vitamins and minerals in atopic dermatitis", J Derm Treat, 17, pp 8285 32 Fregolente P.B.L., Fregolente L.V., et al (2009), "Screening of microbial li- pases and evaluation of their potential to produce glycerides with high gamma linolenic acid concentration", Brazilian Journal of Microbiology, 40, pp 747-756 33 Galvão de Morais W., Júnior, et al (2016), "Optimization of the production and characterization of lipase from Candida rugosa and Geotrichum candidum in soybean molasses by submerged fermentation", Protein Expression and Purification, pp 2-31 34 Godoy L.C (2012), Lipase-catalyzed purication and functionalization of Omega-3 polyunsaturated fatty acids and production of structured lipids, Université de Toulouse, Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse (INSA Toulouse) 35 Gopinath S.C.B., Hilda A., et al (2003), "Purification of lipase from Ge- otrichum candidum: conditions optimized for enzyme production using Box– Behnken design", World Journal of Microbiology & Biotechnology, 19, pp 681689 36 Hasan F., Shah A.A., et al (2006), "Industrial applications of microbial li- pases", Enzyme and Microb Technol, 39, pp 235-251 37 Hedrich H.C., Spener F., et al (1991), "Large-scale purification, enzymic characterization, and crystallization of the lipase from Geotrichum candidum", Enzyme and Microbial Technology, 13, pp 840-847 38 Heyllyer S.A., Chandler I.C., et al (1999), "Can the fatty acid selectivity of plant lipases be predicted from the composition of the seed triglyceride?", BBA-Mol Cell Biol Lipids, 1440, pp 215-224 39 Ibegbulam-Njoku P.N., Achi O.K (2014), "Lipase production by fungal iso- lates grown in palm oil mill effluent", British Biotechnology Journal, 4(11), pp 1191-1200 40 Iftikhar T., Niaz M., et al (2011), "Purification and characterization of extra- cellular lipases", Pak J Bot, 43(3), pp 1541-1545 41 Jacobsen T., Olsen J., et al (1990), "Substrate specificity of Geotrichum candidum lipase preparations", Biotechnol Lett, 1282, pp 121-126 42 Jacobsen T., Poulsen O.M (1995), "Comparison of lipases from different strains of the fungus Geotrichum candidum", Biochimica et Biophysics Acta, 1257, pp 96-102 43 Jacques N., Casaregola S., et al (2008), "Contribution to the safety of tech- nological microflora found in fermented dairy products", International Journal of Food Microbiology, 126(Part X, the Hemiascomycetous yeasts), pp 263-266 44 Jaeger K.E, Dijkstra B.W., et al (1999), "Bacterial biocatalysts: Molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases", Annu Rev Microbiol, 53, pp 315-351 45 Jaeger K.E., Eggert T (2002), "Lipases for biotechnology", Curr Opin Bio- technol, 13, pp 390-397 46 Jaeger K.E., Reetz M.T (1998), "Microbial lipases form versaltile tools for biotechnology", Trends Biotechnol, 16, pp 396-403 47 Jensen R.G., Gordon D.T., et al (1972), "Specificity of Geotrichum can- didum lipase with respect to double bond position in triglycerides containing cisoctadecenoic acids", Lipids, 7, pp 738-741 48 Joseph D.S., Yunge L., et al (1991), "Ser-His-Glu triad forms the catalytic site of lipase from Geotrichum candidum", Nature, 351, pp 761-764 49 Kamal A., Khanna G.B., et al (2002), "Chemoenzymatic synthesis of both enantiomers of flouxetine, tomoxetine and nisoxetine: Lipase-catalyzed resolution of 3-aryl-3-hydroxypropanenitriles ", Tetrahedron: Asymmetry, 13, pp 2039-2051 50 Kim M.G., Lee E.G., et al (2000), "Improved enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards ketoprofen ethyl ester by a simple two-step treatment", Process Biochem, 35, pp 977-982 51 Lau H.L., Ariff A., et al (2011), "Production and optimization of alkalosta- ble lipase by alkalophilic Burkholderia cenocepacia ST8", African Journal of Biotechnology, 10(36), pp 7002-7009 52 Lee W.M., Kim K.J., et al (1995), "Enzymatic resolution of racemic ibu- profen esters: effects of organic cosolvents and temperature", J Ferment Bioeng, 6, pp 613-615 53 Loo J.L., Lai O.M., et al (2006), "Identification and characterisation of a lo- cally isolated lipolytic microfungus -Geotrichum candidum", Malaysian Journal of Microbiology, 2, pp 22-29 54 Market Research and (2015), "Lipase market by source, application, and by geography – global forecast to 2020", Markets and Markets 55 Mladenoska I (2014), "Isolation and purification of lipases from Geotrichum candidum grown on a sunflower oil waste as a carbon source", Chemical engineering transactions, 42, pp 49-54 56 Mladenoska I (2013), "Isolation, purification and partial characterization of extracellular lipases from Geotrichum candidum grown on a biodegradable oil waste" 57 Muhammad A., Bokhari S.A.I., et al (2017), "Purification and characteriza- tion of extracellular lipase by Geotrichum candidum of dairy origin", Pak J Bot, 49(2), pp 757-761 58 Palomo J.M., Mateo C., et al (2003), "Resolution of (+-)-5-substituted-6-(5- chloropyridin-2-yl)-7-oxo-5,6-dihydropyrrolo[3,4b] pyrazine derivatives-precursors of (S)-(+)-Zopiclone, catalyzed by immobilized Candida antarctia B lipase in aqueous media", Tetrahedron: Asymmetry, 114, pp 429-438 59 Pandey A., Benjamin S., et al (1999), "The realm of microbial lipases in bio- technology", Biotechnol Appl Biochem, 29, pp 119-131 60 Patil K.J., Chopda M.Z., et al (2011), "Lipase biodiversity", Indian J Sci Technol, 4, pp 971-982 61 Pejic N.R., Lee T.D (2006), "Hypertriglyceridemia", J Am Board Fam Med, 19, pp 310-316 62 Pleiss J., Fischer M., et al (2000), "Lipase engineering database: Under- standing and exploiting sequence–structure–function relationships", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10, pp 491-508 63 Pleiss J., Fischer M., et al (1998), "Anatomy of lipase binding sites: the scis- sile fatty acid binding site", Chemistry and Physics of Lipids, 93, pp 67-80 64 Pottier I., Gente S., et al (2008), "Safety assessment of dairy microorgan- isms: Geotrichum candidum", International Journal of Food Microbiology, 126, pp 327-332 65 Quyen D.T., Nguyen T.T., et al (2004), "A novel lipase/chaperone pair from Ralstonia sp M1: analysis of the folding interaction and evidence for gene loss in R solanacearum", Mol Gen Genomics, 272, pp 538-549 66 Schrag J.D., Li Y., et al (1991), "Multiple Crystal Forms of Lipases from Geotrichum candidum", J Mol Biol., 220, pp 541-543 67 SCHRAG Joseph D, Li Yunge, et al (1991), "Ser-His-Glu triad forms the catalytic site of the lipase from Geotrichum candidum", Nature, 351, pp 761-764 68 Sharma R., Chisti Y., et al (2001), "Production, purification, characterization and applications of lipases", Biotechnol Adv, 19, pp 627-662 69 Sharma S., Kanwar S.S (2014), "Review article: Organic solvent tolerant lipases and applications", The Scientific World Journal, 2014, pp 1-15 70 Shibatani T., Omori K., et al (2000), "Enzymatic resolution of diltiazem in- termediate by Serratia marcescens lipase: Molecular mechanism of lipase secreation and its industrial application", J Mol Catal B: Enzymatic, 10, pp 141-149 71 Sidebottom C.M., Charton E., et al (1991), "Geotrichum candidurn produces several lipases with markedly different substrate specificities", Eur J Biochcm, 202, pp 485-491 72 Sonnet P.E (1988), "Lipase selectivities", Journal of the American oil chem- ists' society, 65(No.6), pp 900-904 73 Stránský K., Zarevúcka M., et al (2007), "Substrate specificity, regioselec- tivity and hydrolytic activity of lipases activated from Geotrichum sp.", Biochemical Engineering Journal, 34, pp 209-216 74 Strinska H., Zhekova B., et al (2015), "Response surface methodology opti- mization of process parameters for lipase by Rhizopus arrhizus", Annuaire de l’Université de Sofia “St Kliment Ohridski” Faculte de Biologie, 100, pp 32-40 75 Sugihara A., Hata S., et al (1993), "Characterization of Geotrichum can- didum lipase III with some preference for the inside ester bond of triglyceride", Appl Microbiol Biotechnol, 40, pp 279-283 76 Sugihara A., Shimada Y., et al (1994), "Positional and fatty acid specificities of Geotrichum candidum lipases", Protein Engineering, 7, pp 585-588 77 Sybren de Hoog G., Smith M.T (2004), "Ribosomal gene phylogeny and species delimitation in Geotrichum and its teleomorphs", Studies in Mycology, 50, pp 489–515 78 Uppenberg J., Hansen M.T., et al (1994), "The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica", Structure, 2, pp 293-308 79 Veeraragavan K., Colpitts T., et al (1990), "Purification and characterization of two distinct lipases from Geotrichum candidum", Biochimica et Biophysics Acta,, 1044, pp 26-33 80 Verger R (1997), "Interfaciak activation of lipase-Facts and artifacts", Trends Biotechnol, 15, pp 32-38 81 Villeneuve P (2003), "Plant lipases and their applications in oils and fats modification", European Journal of Lipid Science and Technology, 105(No.6), pp 308-317 82 Vulfson E.N (1994), Industrial applications of lipases, Cambridge Univ Press, Cambridge, pp 271-288 83 Wingfield P.T (2016), "Protein precipitation using amonium sulfat", Current Protocols in Protein Science, 84, pp 84 Wouters J., Ayad E., et al (2002), "Microbes from raw milk for fermented dairy products", International Dairy Journal, 12, pp 91-109 85 Xie Y.C., Liu H.Z., et al (1998), "Candida rugosa lipase catalyzed esterifi- cation of racemic ibuprofen and chemical hydrolysis of S-ester formed.", Biotechnol Lett, 20, pp 455-458 86 Xin J.Y., Li S.B., et al (2001), "Dynamic enzymatic resolution of naproxen methyl ester in a membrane bioreactor", J Chem Technol Biotechnol, 76, pp 579585 87 Zaman M.M., Hayashi Y., et al (2005), "Enhanced activity and stability of Chromobacterium viscosum lipase in AOT reverse micellar systems by pretreatment with acetone", J Mol Catal: B Enzym, 32, pp 149-155 88 Zarevúcka M., Kej´ık Z., et al (2005), "Enantioselective properties of in- duced lipases from Geotrichum", Enzyme and Microbial Technology, 37, pp 481486 Tiếng Pháp 89 M Guéguen, Lenoir J (1975), "Aptitude de l'espèce Geotrichum candidum la production d'enzymes protéolytiques", Le lait, 543-544, pp 145-162 ... 31 3. 1.2 Tối ưu hóa khả sinh tổng hợp lipase 37 3. 1 .3 Tinh enzym lipase 41 3. 2 Bàn luận . 43 3.2.1 Về kết tối ưu hóa khả sinh tổng hợp lipase từ chủng G .candidum Geo2 6 .3. .. Nghiên cứu tối ưu hóa khả sinh tổng hợp tinh lipase từ chủng G .candidum Geo2 6 .3 với mục tiêu là: Xác định điều kiện tối ưu nhằm tăng khả sinh tổng hợp lipase từ G .candidum Geo2 6 .3 Bước đầu tinh. ..BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẬP MÃ SINH VIÊN: 1201566 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ SƠ BỘ TINH SẠCH LIPASE TỪ CHỦNG GEOTRICHUM CANDIDUM GEO 26. 3 KHÓA