Phân lập agrobacterium rhizogenes và nghiên cứu ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp vinca ankaloid của rễ tơ cây dừa cạn (cantharanthus roseus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NHƯ NHỨT PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NHƯ NHỨT PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus) Ngành: Sinh học Mã số ngành: 62 42 30 15 Phản biện 1: PGS TS Dương Tấn Nhựt Phản biện 2: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên Phản biện 3: TS Phan Tường Lộc Phản biện độc lập 1: PGS TS Dương Tấn Nhựt Phản biện độc lập 2: TS Phan Tường Lộc NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS BÙI VĂN LỆ Tp Hồ Chí Minh – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi giám sát hướng dẫn khoa học PGS TS Bùi Văn Lệ Các kết thu luận án trung thực chưa công bố cơng trình Tác giả luận án Nguyễn Như Nhứt i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gởi lởi cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS TS Bùi Văn Lệ, thầy người hướng dẫn khoa học để tơi hồn thành luận án Xin cảm ơn thầy dõi theo để hỗ trợ hướng dẫn tơi tận tình suốt năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn ông Trần Văn Thanh, Chủ tịch Hội đồng Thành viên Công ty TNHH Gia Tường đầu kinh phí, cho tơi tự ủng hộ theo đuổi đường mà chọn Tôi xin cảm ơn: Các thầy Chun ngành Hóa Sinh dành thời gian công sức để truyền đạt cho kiến thức chun ngành khóa học Các thầy PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, PGS TS Phạm Thị Ánh Hồng, PGS TS Nguyễn Đức Lượng, PGS TS Nguyễn Tiến Thắng, PGS TS Ngơ Đại Nghiệp, TS Nguyễn Quốc Bình, TS Hoàng Quốc Khánh TS Lê Phi Nga thành viên Hội đồng đánh giá đề cương chuyên đề có ý kiến đóng góp quan trọng để tơi hồn thiện luận án PGS TS Phan Thị Phượng Trang, PGS TS Quách Ngô Diễm Phương, NCS Bùi Thế Vinh, NCS Vũ Thị Bạch Phượng thành viên phịng thí nghiệm Chi nhánh Cơng ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương giúp đỡ tơi thời gian thực luận án ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i i Lời cảm ơn ii ii Mục lục iiiiii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vii vi Danh mục bảng xix Danh mục hình ảnh, đồ thị xiv xii Chương mở đầu 1 Chương – Tổng quan 5 1.1 Giới thiệu sơ lược Agrobacterium rhizogenes 6 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 6 1.1.2 Tình hình phân loại 7 1.1.3 Phân bố hình thái 8 1.1.4 Sinh lý biến dưỡng 9 1.1.5 Khả chuyển gen vào tế bào thực vật 1010 1.2 Giới thiệu sơ lược Dừa cạn 1313 1.2.1 Nguồn gốc, hình thái phân bố 1313 1.2.2 Vinca alkaloid 1414 1.3 Sơ lược rễ tơ 1717 1.3.1 Kỹ thuật cảm ứng tạo rễ tơ 1717 1.3.2 Thiết lập quy trình ni cấy rễ tơ 1818 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng A rhizogenes khai thác rễ tơ Dừa cạn 2121 Chương – Vật liệu phương pháp 2626 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2727 2.2 Vật liệu 2727 2.2.1 Mẫu đất dùng để phân lập Agrobacterium rhizogenes 2727 2.2.2 Các chủng vi sinh vật 2727 2.2.3 Vật liệu thực vật 2727 2.2.4 Các hóa chất, dụng cụ thiết bị 2828 2.2.5 Môi trường MG-Te dùng để phân lập chọn lọc Agrobacterium 2929 2.2.6 Các mơi trường dùng kiểm tra đặc tính sinh hóa, ni cấy bảo quản A rhizogenes 3030 2.2.7 Các môi trường nuôi cấy mô thực vật 3030 2.3 Phương pháp 3030 2.3.1 Phương pháp phân lập chọn lọc Agrobacterium 3030 iii 2.3.2 Các phương pháp kiểm tra đặc tính hình thái sinh hóa A rhizogenes 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh A rhizogenes 2.3.4 Phương pháp nhận diện A rhizogenes kiểm tra bệnh học 2.3.5 Phương pháp gây nhiễm cảm ứng rễ tơ Dừa cạn in vitro 2.3.6 Phương pháp chuẩn bị dòng rễ tơ nuôi cấy môi trường thạch 2.3.7 Phương pháp nuôi cấy rễ tơ môi trường lỏng 2.3.8 Phương pháp tách chiết alkaloid tổng số 2.3.9 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp phân tích Vinca alkaloid 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Tóm tắt nội dung thí nghiệm 2.4.2 Phân lập thu nhận A rhizogenes 2.4.3 Nghiên cứu thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn 2.4.4 Chọn lọc điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ Dừa cạn 2.4.5 Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn môi trường lỏng 2.4.5.1 Sàng lọc dòng rễ tơ 2.4.5.2 Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ 2.4.5.3 Xác định động học tăng trưởng sinh khối dòng rễ tơ chọn lọc 2.4.6 Đánh giả khả sinh tổng hợp alkaloid Dừa cạn in vivo xâm nhiễm với A rhizogenes rễ tơ 2.5 Phương pháp phân tích số liệu Chương – Kết thảo luận 3.1 Phân lập Agrobacterium rhizogenes 3.1.1 Thu thập mẫu đất để phân lập Agrobacterium rhizogenes 3.1.2 Phân lập chọn lọc Agrobacterium 3.1.3 Nhận diện A rhizogenes xét nghiệm sinh hóa 3.1.4 Nhận diện A rhizogenes có khả cảm ứng tạo rễ tơ xét nghiệm bệnh học 3.1.4.1 Khả xâm nhiễm gây triệu chứng rễ tơ họ đậu in vivo 3.1.4.2 Khả xâm nhiễm gây triệu chứng rễ tơ Dừa cạn in vivo 3.1.5 Nhận diện A rhizogenes kỹ thuật sinh học phân tử iv 3030 3131 3131 3232 3333 3333 3434 3434 3535 3535 3636 3737 3838 3939 3939 4040 4141 4242 4242 4343 4444 4444 4444 4646 4747 4848 5050 5050 3.1.6 Một số đặc điểm tăng trưởng chủng A rhizogenes thu nhận 5252 3.2 Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ chuyển gen Dừa cạn in vitro 5353 3.2.1 Sàng lọc chủng A rhizogenes 5353 3.2.2 Xác định điều kiện thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ 5656 3.2.2.1 Ảnh hưởng loại mô 5757 3.2.2.2 Ảnh hưởng hợp chất phenol 5757 3.2.2.3 Ảnh hưởng mật độ tế bào vi khuẩn, thời gian ngâm mẫu thời gian ủ cảm ứng 6060 3.2.2.4 Ảnh hưởng ánh sáng gian đoạn ủ cảm ứng ủ loại nhiễm vi khuẩn 6363 3.2.2.5 Ảnh hưởng môi trường khoáng bản, nguồn nồng độ nguồn đường 6565 3.2.3 Đề xuất quy trình cảm ứng tạo rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn 6868 3.3 Điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ Dừa cạn môi trường thạch 6969 3.4 Nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn 7373 3.4.1 Sàng lọc dòng rễ tơ 7373 3.4.2 Chọn lọc điều kiện nuôi cấy tăng sinh rễ tơ 7777 3.4.3 Đường cong tăng trưởng dòng rễ tơ 8282 3.5 Khả sinh tổng hợp alkaloid rễ tơ Dừa cạn in vivo gây nhiễm với A rhizogenes 8383 3.5.1 Ảnh hưởng A rhizogenes phát triển Dừa cạn in vivo 8383 3.5.2 Khả sinh tổng hợp alkaloid Dừa cạn in vivo gây nhiễm với A rhizogenes 8585 3.5.3 Khả sinh tổng hợp alkaloid rễ tơ Dừa cạn 9090 3.5.4 So sánh khả sinh tổng hợp alkaloid rễ tơ với rễ Dừa cạn in vivo tiềm ứng dụng sản xuất alkaloid 93 Chương – Kết luận đề nghị 9797 4.1 Kết luận 9898 4.2 Đề nghị 9999 Các cơng trình có liên quan 100 100 Tài liệu tham khảo 102 102 Phụ lục v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ajm : Ajmalicine B5 : Gamborg’B5 Cat : Catharanthine DHa : Đất vùng rễ dưa hấu DLe : Đất vùng rễ dưa leo DP : Development of disease - Tỷ lệ biểu bệnh DWf : Final dry weight - Trọng lượng khô thời điểm phân tích DXP : Deoxyxylulose Phosphate ĐBa : Đất vùng rễ đậu bắp ĐĐe : Đất vùng rễ đậu đen ĐĐu : Đất vùng rễ đậu đũa ĐNa : Đất vùng rễ đậu nành ĐPh : Đất vùng rễ đậu phộng ĐQu : Đất vùng rễ đậu que ĐXa : Đất vùng rễ đậu xanh E4P : Erthrose-4-phosphate Ep : Effect of phenol - Phần trăm thay đổi tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ FGI : Fresh growth index - Chỉ số tăng trưởng trọng lượng tươi Fru : Fructose FWf : Final fresh weight - Trọng lượng rễ tươi cuối (khi phân tích) FWi : Initial fresh weight - Trọng lượng rễ tươi ban đầu (rễ nguồn) Glu : Glucose HRd : Development of hairy root - Tỷ lệ số dòng rễ tơ phát triển rễ vi I : Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ IJSEM : The International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology – Tạp chí Quốc tế Vi sinh học hệ thống tiến hóa Lua : Đất vùng rễ lúa nước MAC : MacConkey Agar malkaloid : Hàm lượng alkaloid tổng số MG : Mannitol Glutamate broth MS : Murashige & Skoog ORCA2 : Octadecanoid-Responsive Catharanthus AP2-domain proteins ORF : Open Reading Frame PGA : Potato glucose agar plasmid Ri : Root inducing plasmid - Plasmid cảm ứng tạo rễ tơ rol : Root oncogene locus SH : Schenk & Hildebrandt Suc : Sucrose TIA : Terpenoid Indole Alkaloid T-DNA : Transfer deoxyribonucleic acid – DNA chuyển TL/R-DNA : Left/Right Transfer DNA - DNA trái/phải chuyển TSA : Trypticase Soy Agar TSI : Triple Sugar Iron Agar VBL : Vinblastine VCR : Vincristine Vin : Vindoline vir : vùng gen gây nhiễm W : White vii Yalkaloid : Yeild of alkaloid - Năng suất alkaloid tổng số Ydb : Yeild of dry biomass - Năng suất sinh khối khô YEMA : Yeast Extract Mannitol Agar YMB : Yeast Extract Mannitol Broth viii Phụ lục 4.2 Các số liệu chọn lọc dòng rễ tơ So sánh khả phát triển sinh tổng hợp alkaloid nhóm dịng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN002 Dòng rễ tơ FGI malkaloid (mg/g DW) Yalkaloid (mg/g FWi) VIN002-01 33,6ab 7,87cd 49,7b VIN002-02 23,1de 4,23g 16,5ijkl VIN002-03 9,6ij 5,43f 6,0m VIN002-04 17,8fgh 5,73f 18,2hijkl VIN002-05 23,4de 10,23ab 33,7de VIN002-06 29,6bc 8,00cd 40,0cd VIN002-07 21,3fg 9,43b 32,2ef VIN002-08 8,4j 9,67b 15,8jkl VIN002-09 16,6gh 11,20a 25,4fgh VIN002-10 13,0hij 7,63de 15,8jkl VIN002-11 13,7hi 5,60f 12,9lm VIN002-12 34,8a 9,37b 57,9a VIN002-13 17,2gh 6,47ef 14,2kl VIN002-14 30,1bc 9,03bc 43,1bc VIN002-15 26,3cd 5,77f 21,3hijk VIN002-16 14,6h 10,13ab 24,3ghi VIN002-17 22,3def 7,80cd 31,1efg VIN002-18 36,6a 9,07bc 50,3b VIN002-19 15,1h 9,37b 23,8ghij VIN002-20 20,4fg 7,17de 20,7hijkl Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 So sánh khả phát triển sinh tổng hợp alkaloid nhóm dòng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN005 Dòng rễ tơ FGI malkaloid (mg/g DW) Yalkaloid (mg/g FWi) VIN005-01 26,5bc 5,13ghij 17,6efg VIN005-02 22,1de 4,07j 12,6gh VIN005-03 11,4j 7,07bc 6,8i VIN005-04 13,9hi 7,40b 17,7ef VIN005-05 24,5bc 5,10ghij 17,1efg VIN005-06 24,2cd 7,73b 35,0c VIN005-07 31,1a 10,60a 58,4a VIN005-08 10,5j 4,73hij 5,0i VIN005-09 19,8efg 6,77bcde 20,8e VIN005-10 15,5gh 5,23fghi 8,8hi VIN005-11 12,3ij 4,80hij 8,9hi VIN005-12 25,5bc 6,83bcd 27,5d VIN005-13 18,6f 5,77efgh 14,4fg VIN005-14 18,6f 4,37ij 14,8fg VIN005-15 21,6e 6,87bcd 21,7e VIN005-16 7,8k 7,40b 6,6i VIN005-17 19,8ef 5,73efgh 16,9efg VIN005-18 26,8bc 11,13a 42,3b VIN005-19 17,5f 5,93defg 13,4fgh VIN005-20 31,8a 6,23cdef 27,9d Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 So sánh khả phát triển sinh tổng hợp alkaloid nhóm dịng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN072 Dòng rễ tơ FGI malkaloid (mg/g DW) Yalkaloid (mg/g FWi) VIN072-01 19,2bcd 11,43cd 30,6c VIN072-02 22,9b 6,93h 15,4fgh VIN072-03 13,8fgh 7,67gh 11,8h VIN072-04 11,6ghi 8,83ef 13,8h VIN072-05 20,9bc 12,83b 30,6c VIN072-06 21,1bc 9,60e 28,5cd VIN072-07 13,5fgh 7,37gh 18,0efgh VIN072-08 16,0def 12,20bc 31,7c VIN072-09 11,3ghi 13,10b 13,4h VIN072-10 10,7hij 9,63e 14,5gh VIN072-11 19,5bcd 7,33gh 18,1efgh VIN072-12 7,3j 14,90a 15,2gh VIN072-13 12,1ghi 8,33fg 20,3efg VIN072-14 14,9efg 11,33cd 17,1fgh VIN072-15 30,2a 11,13cd 57,7a VIN072-16 17,9cde 12,07bc 33,8bc VIN072-17 8,6ij 9,50e 12,3h VIN072-18 20,4bc 10,77d 38,2b VIN072-19 13,6fgh 11,63cd 21,6ef VIN072-20 17,8cde 9,57e 24,0de Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 So sánh khả phát triển sinh tổng hợp alkaloid nhóm dịng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN077 Dòng rễ tơ FGI malkaloid (mg/g DW) Yalkaloid (mg/g FWi) VIN077-01 17,4c 6,63fg 11,2f VIN077-02 7,5ij 6,60fg 4,4g VIN077-03 17,6c 8,67bcd 18,2e VIN077-04 9,1hij 9,43b 11,3f VIN077-05 26,8a 7,07efg 27,2c VIN077-06 20,8b 9,53b 27,4c VIN077-07 11,1fgh 8,07cde 19,1e VIN077-08 14,6de 6,93efg 11,1f VIN077-09 27,5a 8,93bc 54,2a VIN077-10 8,9hij 7,23efg 10,7f VIN077-11 12,0fg 6,40g 7,1fg VIN077-12 9,5ghij 8,73bcd 11,3f VIN077-13 15,7cd 7,20efg 9,5f VIN077-14 22,4b 6,37g 25,5cd VIN077-15 11,5efgh 8,77bcd 11,0f VIN077-16 6,9j 8,80bcd 7,5fg VIN077-17 10,2fghi 7,70def 11,7f VIN077-18 12,8ef 12,77a 21,1de VIN077-19 23,4b 7,63def 32,8b VIN077-20 15,1cde 7,90cde 16,6e Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 Phụ lục 4.3 Các kết xác định mơi trƣờng lỏng để ni cấy dịng rễ tơ chọn lọc Trường hợp rễ gãy vụn không phát triển (trái) phát triển thành chồi dịng rễ tơ VIN005-07 mơi trường lỏng MS Các trường hợp rễ phát triển thành sẹo VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09 Phụ lục 4.4 Các kết xác định pH ban đầu môi trƣờng lỏng để nuôi cấy dòng rễ tơ chọn lọc Sự phát triển dòng rễ tơ VIN077-09 mơi trường 1/2W có pH ban đầu khác pH 5,0 pH 5,7 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 Phụ lục 4.5 Các kết xác định đƣờng cong tăng trƣởng dòng rễ tơ chọn lọc So sánh số tăng trưởng dịng rễ tơ chọn lọc theo thời gian ni cấy Thời gian (ngày) 14 21 28 35 42 FGI VIN002-12 1,17e 1,17e 2,00e 5,45d 16,11c 20,41b 21,52a VIN005-07 1,19c 1,25c 2,70c 5,34b 20,13a 19,92a 21,32a VIN072-15 1,18d 1,17d 2,44c 6,69b 20,11a 20,74a 20,05a VIN077-09 1,16f 1,17f 2,03e 5,56d 13,59c 17,12b 17,99a Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 So sánh suất sinh khối khô dịng rễ tơ chọn lọc theo thời gian ni cấy Thời gian (ngày) 14 21 28 35 42 VIN002-12 0,17d 0,18d 0,32d 0,87c 2,46b 3,11a 3,22a Ydb (g/g FWi) VIN005-07 VIN072-15 c 0,17 0,17c 0,21c 0,17c 0,37c 0,35c 0,76b 1,02b 3,13a 3,05a a 3,10 3,18a 3,18a 3,03a VIN077-09 0,18d 0,18d 0,31d 0,84c 2,07b 2,61a 2,69a Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 PHỤ LỤC – XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ALKALOID Phục lục 5.1 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng A rhizogenes lên hàm lƣợng alkaloid Dừa cạn in vivo Các giống Dừa cạn trồng chậu nhựa có đường kính 15 cm nhà lưới Mỗi chậu trồng ba Đất Tribat dùng để trồng bổ sung suốt q trình thí nghiệm Mỗi chậu cho vào 300 g đất Hạt Dừa cạn ươm hai lớp giấy thấm đầy nước tối ngày Sau nẩy mầm, hạt chuyển vào chậu chuẩn bị Mỗi ngày tưới phun sương hai lần vào đầu buối sáng cuối buổi chiều Khi tháng tuổi (tính từ lúc nẩy mầm), chậu bổ sung 50 g đất 0,4 g phân hỗn hợp NPK 3-5-5 Sau đó, hai tuần bón bổ sung 50 g đất 0,4 g NPK 3-5-5 vào chậu thu hoạch Khi tuần tuổi, tiến hành gây nhiễm với Agrobacterium rhizogenes theo mục 2.3.4 Cây đối chứng tạo vết thương không gây nhiễm với vi khuẩn Mẫu trắng bình thường khơng tạo vết thương Mỗi nghiệm thức gồm 100 khác Thí nghiệm lặp lại ba lần Sau 90 ngày (kể từ nẩy mầm), toàn thu hoạch để xác định tiêu: chiều cao trung bình cây, trọng lượng tươi trọng lượng khô trung bình Tồn lá, thân rễ 100 lần lặp lại làm khô xay mịn trước xác định hàm lượng alkaloid tổng số alkaloid thành phần Khu vực thí nghiệm ảnh hưởng A rhizogenes Dừa cạn in vivo nhà lưới Bốn giống Dừa cạn in vivo VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 Phụ lục 5.2 Các kết xác định ảnh hƣởng A rhizogenes lên hàm lƣợng alkaloid tổng số Dừa cạn in vivo rễ tơ a) So sánh hàm lượng alkaloid tổng số (mg/g chất khô) mô Dừa cạn in vivo bình thường Giống Dừa cạn Rễ Thân c Lá b VIN002 5,85 6,68 11,83a VIN005 3,94c 6,48b 9,06a VIN072 4,59c 6,10b 10,87a VIN077 5,06c 7,14b 10,09a Ghi chú: Các trị trung bình dịng có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 b) So sánh hàm lượng alkaloid tổng số (mg/g chất khô) mô Dừa cạn in vivo bình thường Giống Dừa cạn Rễ Thân a VIN002 5,85 VIN005 3,94c VIN072 4,59b VIN077 5,06b Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 b Lá 6,68 11,83a 6,48bc 9,06d 6,10c 10,87b 7,14a 10,09c theo sau giống khác Phụ lục 5.3 Các kết xác định ảnh hƣởng A rhizogenes lên hàm lƣợng số alkaloid thành phần Dừa cạn in vivo rễ tơ Diện tích peak Đường tương quan diện tích peak bồng độ alkaloid 100.000.000 90.000.000 80.000.000 70.000.000 60.000.000 50.000.000 40.000.000 30.000.000 20.000.000 10.000.000 y = 170554x R² = 0,9984 100 200 300 400 500 600 Diện tích peak Ajmalicine (ppm) 80.000.000 y = 143579x R² = 0,9997 70.000.000 60.000.000 50.000.000 40.000.000 30.000.000 20.000.000 10.000.000 0 100 200 300 400 500 600 Catharanthine (ppm) 90.000.000 y = 156860x R² = 0,9936 80.000.000 Diện tích peak 70.000.000 60.000.000 50.000.000 40.000.000 30.000.000 20.000.000 10.000.000 0 100 200 300 400 500 600 Vinblastine (ppm) 45.000.000 y = 78829x R² = 0,9966 40.000.000 Diện tích peak 35.000.000 30.000.000 25.000.000 20.000.000 15.000.000 10.000.000 5.000.000 0 100 200 300 400 500 600 Vincristine (ppm) 30.000.000 y = 49343x R² = 0,9983 Diện tích peak 25.000.000 20.000.000 15.000.000 10.000.000 5.000.000 0 100 200 300 400 500 600 Vindoline (ppm) Phục lục 5.4 Hàm lƣợng alkaloid suy từ đƣờng chuẩn a) So sánh hàm lượng alkaloid thành phần (mg/g chất khô) rễ Dừa cạn VIN002 in vivo rễ tơ Mẫu Cat Ajm c Rễ đối chứng 0,112 Rễ nhiễm với chủng C18 0,281a VCR b 0,270 - 0,010a Vin VBL a 0,430b 0,017b 0,769a 0,057 Rễ tơ VIN002-12 0,243b 0,529a 0,006a 0,257c Ghi chú: Các trị trung bình số cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 -: khơng phát b) So sánh hàm lượng alkaloid thành phần (mg/g chất khô) rễ Dừa cạn VIN005 in vivo rễ tơ Mẫu Rễ đối chứng Cat 0,370a Ajm 0,458a VCR 0,011a Vin 0,031a VBL 0,080b Rễ nhiễm với chủng C18 0,192b 0,081b 0,001b 0,007b 0,110a Rễ tơ VIN005-07 0,411a Ghi chú: Các trị trung bình số cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 -: khơng phát c) So sánh hàm lượng alkaloid thành phần (mg/g chất khô) rễ Dừa cạn VIN072 in vivo rễ tơ Mẫu Cat Ajm VCR Vin VBL Rễ đối chứng 0,283a 0,159b - 0,069a 0,133b Rễ nhiễm với chủng C18 0,021b 0,105c 0,023a 0,077a 0,243a Rễ tơ VIN072-15 0,351a Ghi chú: Các trị trung bình số cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 -: khơng phát d) So sánh hàm lượng alkaloid thành phần (mg/g chất khô) rễ Dừa cạn VIN077 in vivo rễ tơ Mẫu Rễ đối chứng Cat 0,122a Ajm 0,336b VCR 0,022a Vin 0,081a VBL 0,086a Rễ nhiễm với chủng C26 0,106ab 0,255c 0,024a 0,057b 0,082a Rễ tơ VIN077-09 0,099b 0,495a 0,015b 0,026c 0,011b Ghi chú: Các trị trung bình số cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 -: không phát Phụ lục 5.5 Một số hình ảnh phân tích alkaloid thành phần HPLC a) Sắc ký đồ chất chuẩn Try Cat Ajm VCR VBL Vin Sec b) Sắc ký đồ số mẫu Rễ tơ VIN002-12 Sec Try Cat Ajm VCR Rễ tơ VIN005-07 Sec Try Ajm VBL Rễ tơ VIN072-15 Try Sec Ajm Rễ tơ VIN077-09 Try Sec Cat Ajm Sec VCR Vin VBL Lá VIN002 đối chứng Try Cat Ajm VCR Vin VBL Lá VIN002 thử không Sec Ajm Try Cat VCR Vin VBL Lá VIN002 thử thật Sec Ajm Try Cat VCR Vin VBL Rễ VIN002 đối chứng Sec Try Cat Ajm Vin VBL Rễ VIN002 thử không Sec Try Cat Ajm VCR Sec Vin VBL Rễ VIN002 thử thật Try Cat VCR Vin VBL c) Sinh khối tươi (trái) bột sau nghiền (phải) dịng rễ tơ sau ni cấy VIN002-12 VIN005-07 VIN002-12 VIN072-15 VIN072-15 VIN077-09 VIN005-07 VIN077-09 d) Dịch cao chiết alkaloid hòa methanol Lá đối chứng Rễ đối chứng Lá thử không Rễ thử không Rễ thử thật Lá thử thật VIN002 VIN005 VIN072 Giống dừa cạn VIN077 VIN002 VIN005 VIN072 Giống dừa cạn VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09 Dòng rễ tơ VIN077 ... NHIÊN NGUYỄN NHƯ NHỨT PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus) Ngành: Sinh học Mã số ngành:... rễ tơ từ Dừa cạn tiềm chọn lọc dịng rễ tơ thích hợp cho nghiên cứu có liên quan Mục tiêu Phân lập chủng A rhizogenes có tự nhiên, nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn đánh giá khả sinh tổng hợp. .. Nghiên cứu tạo rễ tơ từ Dừa cạn chủng A rhizogenes phân lập được, (3) Nghiên cứu bảo quản rễ tơ thu được, (4) Nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ (5) Xác định khả sinh tổng hợp alkaloid dòng rễ tơ thu