Phân lập agrobacterium rhizogenes và nghiên cứu ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp vinca alkaloid của rễ tơ cây dừa cạn (catharanthus roseus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NHƯ NHỨT PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus) Ngành: Sinh học Mã số ngành: 62 42 30 15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2018 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: - PTN Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tƣờng tỉnh Bình Dƣơng - PTN LabB, Bộ mơn Cơng nghệ sinh học thực vật Chuyển hóa thứ cấp, trƣờng ĐH KHTN – ĐHQG.HCM - TT Sâm dƣợc liệu, trƣờng ĐH Y dƣợc Tp.HCM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS BÙI VĂN LỆ Phản biện 1: PGS TS DƢƠNG TẤN NHỰT Phản biện 2: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN Phản biện 3: TS PHAN TƢỜNG LỘC Phản biện độc lập 1: PGS TS DƢƠNG TẤN NHỰT Phản biện độc lập 2: TS PHAN TƢỜNG LỘC Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Cơ sở đào tạo họp Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG.HCM, vào hồi … … ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Thƣ viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM Thƣ viện trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG.HCM CHƢƠNG MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nuôi cấy rễ tơ chuyển gen Agrobacterium rhizogenes kỹ thuật sử dụng phổ biến nhằm thay cho kỹ thuật nuôi cấy sẹo ni cấy huyền phù cho nhiều lồi thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp (Doran, 2013) Kỹ thuật áp dụng Dừa cạn cho mục đích chất thứ cấp từ năm 1980 Tuy nhiên không may mắn hầu hết dòng rễ tơ Dừa cạn có tốc độ tăng trưởng thấp (Peebles, 2008) Mặc dù vậy, nghiên cứu không ngừng thực nhằm tìm dòng rễ tơ có khả tổng hợp hợp chất đích mong muốn Gần đây, Hanafy cộng (2016) tiến hành nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn chủng A rhizogenes K599 Cơ sở để các nhà khoa học tin tưởng tiếp tục nghiên cứu đặc điểm chuyển gen A rhizogenes trình chèn gen plasmid Ri vào vị trí ngẫu nhiên gen tế bào thực vật dẫn đến dòng rễ tơ thu có đặc điểm tăng trưởng khác (Chandra cộng sự, 2013) Cũng lý mà việc nghiên cứu sản xuất nhiều dòng rễ tơ khác sau sàng lọc dòng rễ tơ mong muốn gặp nhiều khó khăn tốn nhiều thời gian Mặt khác, nay, hầu hết nghiên cứu rễ tơ Dừa cạn hạn chế vận dụng vài chủng A rhizogenes định Trong đó, lồi vi khuẩn phổ biến rộng rãi đất (Wang, 2006; Murugesan cộng sự, 2010) Do đó, việc khai thác chủng A rhizogenes hoang dại phân lập từ đất mang đến hội thu nhiều dòng rễ tơ từ Dừa cạn tiềm chọn lọc dòng rễ tơ thích hợp cho nghiên cứu có liên quan -1- Mục tiêu Phân lập chủng A rhizogenes có tự nhiên đánh giá ảnh hưởng chủng A rhizogenes thu lên khả sinh tổng hợp Vinca alkaloid Dừa cạn thông qua gây nhiễm trực tiếp lên in vivo yếu tố ngoại sinh thông qua rễ tơ cảm ứng A rhizogenes yếu tố nội sinh Ý nghĩa khoa học Luận án nhằm ghi nhận diện A rhizogenes đất vùng rễ số trồng Việt Nam khả chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ chúng Dừa cạn ảnh hưởng chúng lên khả sinh tổng alkaloid Dừa cạn rễ tơ Ý nghĩa thực tiễn Luận án góp phần thu thập A rhizogenes địa làm công cụ cho nghiên cứu chuyển gen vào tế bào thực vật Ngoài ra, kết luận án giúp sản xuất nhiều dòng rễ tơ khác từ Dừa cạn phục vụ cho nghiên cứu sau hướng đến sản xuất Vinca alkaloid Nội dung nghiên cứu Phân lập A rhizogenes từ mẫu đất vùng rễ số trồng Việt Nam có khả cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn Sàng lọc chủng A rhizogenes có khả cảm ứng tạo rễ tơ cao Dừa cạn nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp để cảm ứng cho chủng vi khuẩn chọn lọc -2- Nghiên cứu chọn lọc số điều kiện để bảo quản rễ tơ Dừa cạn Sàng lọc dòng rễ tơ có khả tăng trưởng sinh tổng hợp alkaloid cao nghiên cứu chọn lọc điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ môi trường lỏng Khảo sát hàm lượng alkaloid tổng số số alkaloid có giá trị rễ tơ rễ in vivo gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes chọn lọc -3- CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu sơ lƣợc Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm, diện phổ biến đất Chúng họ với Rhizobium có khả xâm nhiễm vào vết thương thực vật gây triệu chứng bệnh rễ tơ (Tzfira Citovsky, 2008) Tình trạng phân loại đến loài loài chúng phức tạp nên gọi R rhizogenes Chúng có khả chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo thành rễ tơ nhờ có mang plasmid Ri Q trình chuyển gen chúng vào tế bào thực vật chưa làm sáng tỏ hồn tồn có nhiều điểm giống với A tumefaciens 1.2 Giới thiệu sơ lƣợc Dừa cạn Cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) có nguồn gốc Madagascar trồng cảnh nhiều nơi giới Chúng sử dụng dược liệu nhờ khả sinh tổng hợp hợp chất có giá trị Trong gồm Vinca alkaloid có hoạt tính chống ung thư người Tuy nhiên, hàm lượng chúng Dừa cạn thấp nên nhà khoa học không ngừng nghiên cứu kỹ thuật sản xuất nhằm nâng cao sản lượng chúng (Peebles, 2008) 1.3 Sơ lƣợc rễ tơ Rễ tơ thu từ chuyển gen A rhizogenes vào tế bào thực vật có đặc điểm phát triển nhanh khơng cần hormone, ổn định mặt di truyền, có khả tổng hợp hợp chất thứ cấp cao chủ Do đó, rễ tơ ứng dụng nhiều lĩnh vực sản xuất hợp chất đích, xử lý mơi trường, nghiên cứu đường chuyển hóa sinh lý rễ, tạo giống trồng… -4- 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng A rhizogenes khai thác rễ tơ Dừa cạn Quá trình chuyển gen A rhizogenes vào tế bào thực vật xảy ngẫu nhiên nên vị trí chèn gen từ vi khuẩn vào gen tế bào chủ số lượng chèn khơng giống Do đó, dòng rễ tơ thu có đặc điểm tăng trưởng vào biến dưỡng không giống Không may mắn rễ tơ Dừa cạn có khả tăng trưởng thấp rễ tơ từ nhiều loài thực vật khác Trong đó, hầu hết nghiên cứu sử dụng vài chủng A rhizogenes định chủ yếu chúng mang plasmid tái tổ hợp để làm sáng tỏ đường biến dưỡng Mặt khác, dù có tính di truyền ổn định so với ni cấy tế bào, vài dòng rễ tơ đặc điểm mong muốn sau thời gian cấy chuyền Vì thế, nay, nhà khoa học không ngừng nổ lực sản xuất dòng rễ tơ tìm kiếm biện pháp khác để can thiệp nhằm khai thác tối đa kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ sản xuất dược chất có giá trị -5- CHƢƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Luận án nhằm nghiên cứu khả chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ A rhizogenes diện đất vùng rễ số trồng Việt Nam Dừa cạn in vivo in vitro Qua đó, đánh giá ảnh hưởng chúng lên khả sinh tổng hợp alkaloid tổng số số alkaloid thành phần in vivo rễ tơ thu in vitro 2.2 Vật liệu Các mẫu đất lấy từ vùng rễ số loại trồng Việt Nam dùng để phân lập A rhizogenes Chủng A rhizogenes ATCC 15834 chủng vi khuẩn làm đối chứng cho kiểm tra sinh hóa nhận diện A rhizogenes Các họ đâu Dừa cạn in vivo Dừa cạn in vitro Các hóa chất, mơi trường, dụng cụ thiết bị để phân lập A rhizogenes, nuôi cấy vi khuẩn, nuôi cấy mô thực vật tách chiết xác định hàm lượng alkaloid 2.3 Phƣơng pháp Các phương pháp sử dụng chủ yếu: - Các phương pháp phân lập môi trường chọn lọc môi trường MG-Te; phương pháp kiểm tra đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn Emanuel Lorrence (2009), Murugesan cộng (2010) José (2012); phương pháp kiểm tra bệnh học in vivo theo Georgina cộng (2007) Kereszt cộng (2007); PCR nhận diện gen rolABC gởi mẫu giải trình tự 16s rDNA -6- - Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn môi trường lỏng - Phương pháp gây nhiễm cảm ứng tạo rễ tơ in vitro; phương pháp nhận diện rễ tơ chuyển gen phân tích PCR diện gen rolB rễ phương pháp nuôi cấy rễ tơ môi trường thạch môi trường lỏng - Các phương pháp sinh hóa phương pháp xác định trọng lượng tươi trọng lượng khô, phương pháp OTT để tách chiết alkaloid tổng số phương pháp sắc ký lỏng cao áp phân tích alkaloid - Phương pháp xử lý thống kê phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 20.0, phép thử Duncan 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu Mẫu đất Phân lập, nhận diện A rhizogenes - Phân lập môi trường chọn lọc; nhận diện kiểm tra hình thái sinh hóa, sinh học phân tử kiểm tra bệnh học in vivo Nghiên cứu thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ - Sàng lọc chủng vi khuẩn, lựa chọn loại mô xác định điều kiện gây nhiễm (thời gian ngâm mẫu, mật độ tế bào, thời gian ủ cảm ứng, chất cảm ứng, chế độ chiếu sáng, mơi trường khống bản, nguồn carbon) Nghiên cứu nuôi cấy bảo quản rễ tơ dừa cạn - Xác định điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ (mơi trường khống bản, nhiệt độ ánh sáng) xác định tỷ lệ dòng rễ tơ bảo rồn gene rol Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ dừa cạn - Sàng lọc dòng rễ tơ có khả sinh tổng hợp alkaloid cao; xác định điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối (mơi trường khống bàn, pH ban đầu, nguồn nồng độ đường) xác định đường tăng trưởng Xác định hàm lƣợng alkaloid thành phần có dừa cạn in vivo rễ tơ Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt q trình nghiên cứu -7- CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập Agrobacterium rhizogenes Từ 235 mẫu đất vùng rễ mười loài trồng khác (gồm dưa hấu, dưa leo, đậu bắp, đậu đen, đậu đũa, đậu nành, đậu phộng, đậu que, đậu xanh lúa nước) phân lập 274 dòng khuẩn lạc có đặc điểm tương tự với Agrobacterium môi trường MG-Te với dạng khuẩn lạc khác (Hình 3.1) Có ba mươi bốn dòng khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống với loài A rhizogenes Dạng Dạng Dạng Hình 3.1 Ba dạng khuẩn lạc khác mơi trường MG-Te đặc trưng Agrobacterium Hình 3.5 Sự xuất triệu chứng rễ tơ bốn giống Dừa cạn in vivo xâm nhiễm dòng C18 phân lập sau tuần gây nhiễm -8- Kiểm tra bệnh học cho thấy có mười ba dòng khuẩn lạc có khả xâm nhiễm tạo rễ tơ bốn giống Dừa cạn in vivo VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 (Hình 3.5) Cả mười ba dòng nhân diện thuộc lồi A rhizogenes dựa trình tự 16S ribosome DNA có chứa plasmid Ri mang gen rolABC (Bảng 3.4 Hình 3.6) Hầu hết dòng số mười ba dòng phân lập sử dụng cao nấm men 1% làm nguồn nitrogen để phát triển với nguồn carbon thay đổi (glucose, lactose, mannitol sucrose) 1-1,5% pH 6,5-7,5 (Bảng 3.5) Dựa vào nguồn gốc phân lập điều kiện tăng trưởng cho thấy mười ba dòng mười ba chủng A rhizogenes khác C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang rolA rolB rolC nước thang Đối chứng rolA C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang rolB C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang rolC -9- Hình 3.6 Kết phân tích PCR xác nhận diện gene rolABC plasmid mười ba dòng vi khuẩn sàng lọc Bảng 3.4 Kết so sánh bắt cặp đoạn gen 16s ribosome ngân hàng liệu NCBI nhận diện gen rolABC 13 dòng vi khuẩn có khả tạo rễ tơ Dừa cạn Trình tự 16S ribosom DNA Sự diện gen rol Dòng Lồi tƣơng đồng Độ tƣơng đồng A B C C02 A rhizogenes 99% Có Có Có C04 A rhizogenes 99-100% Có Có Có C09 A rhizogenes 100% Có Có Có C10 A rhizogenes 100% Có Có Có C12 A rhizogenes 99% Có Có Có C15 A rhizogenes 100% Có Có Có C18 A rhizogenes 100% Có Có Có C20 A rhizogenes 100% Có Có Có C24 A rhizogenes 100% Có Có Có C26 A rhizogenes 99% Có Có Có C29 A rhizogenes 99-100% Có Có Có C32 A rhizogenes 100% Có Có Có C34 A rhizogenes 100% Có Có Có Bảng 3.5 Bảng tổng hợp nguồn gốc số điều kiện tăng trưởng 13 chủng A rhizogenes thu nhận có khả chuyển gen cảm ứng rễ tơ Dừa cạn Ký hiệu Ký hiệu chủng khuẩn lạc C02 VBa2 C04 VBa9 C09 VĐu23 C10 VĐu24 Đất vùng rễ Đậu bắp Đậu đũa Dạng Môi khuẩn trƣờng lạc MT2 pH Nguồn carbon Nguồn nitrogen 7,0 Mannitol 1,5% Cao nấm men 1% MT2 7,5 Mannitol 1,5% Cao nấm men 1% MT4 6,5 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% MT5 6,5 Sucrose 1,5% Peptone 1% C12 VHa7 Dưa hấu MT5 7,0 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C15 VLe12 Dưa leo MT5 6,5 Sucrose 1,5% Peptone 1% C18 VLu14 Lúa nước MT4 6,5 Lactose 1,5% Cao nấm men 1% C20 VNa11 Đậu nành MT4 6,5 Lactose 1,5% Cao nấm men 1% C24 VPh11 MT2 6,0 Mannitol 1,0% Cao nấm men 1% C26 VPh22 MT5 6,5 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C29 VPh56 MT2 6,5 Mannitol 1,0% Cao nấm men 1% C32 VXa5 MT5 6,5 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C34 VXa21 MT5 7,0 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% Đậu phộng Đậu xanh - 10 - 3.2 Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn in vitro Ở điều kiện in vitro, 13 chủng phân lập cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn Rễ tơ 13 chủng vi khuẩn cảm ứng có mang gen rol thơng qua kết phân tích PCR (Hình 3.8) So với chủng A rhizogenes ATCC 15834 12 chủng lại, chủng A rhizogenes C18 có khả cảm ứng tạo rễ tơ cao ba giống Dừa cạn VIN002, VIN005 VIN072 (Bảng 3.6) Trong đó, chủng A rhizogenes C26 có khẳng chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ cao giống Dừa cạn VIN077 Điều kiện thích hợp để thu nhận rễ chuyển Dừa cạn hai chủng A rhizogenes C18 C26 thay đổi tùy theo giống Dừa cạn (Bảng 3.7) Rễ tơ thu phát triển nhanh rễ thường có nhiều lơng rễ bao quanh (Hình 3.9) Bảng 3.6 Tỷ lệ mẫu hình thành rễ bốn giống Dừa cạn cảm ứng chủng A rhizogenes Chủng A rhizogenes C02 I (%) VIN002 de 39,6 g VIN005 11,0 g 39,3 d VIN072 VIN077 d 4,6f g 17,5c 18,0 C04 26,7 C09 16,3h 40,0d 15,7e 21,1b C10 e 38,1 28,9 e e 13,6 17,5c C12 47,7c 23,2f 10,2fg 14,2d C15 17,8 h f h 3,3f C18 59,4a 50,3a 40,0a 20,2b C20 i e c 0g C24 40,7d 47,5b 14,4e 7,2e C26 e 38,1 43,2 c f 10,6 26,7a C29 24,8g 46,4b 0,8h 3,8f C32 55,0 b c h 0g C34 45,8c 29,3e 31,5b 21,4b f e b 21,7b ATCC15834 29,3 22,2 31,4 45,6b 30,3 - 11 - 8,1 23,5 32,5 C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 nước rễ thang thường C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C24 C26 C29 C32 C34 rễ thang thường Rễ tơ chủng khuẩn cảm ứng từ giống dừa cạn VIN002 Rễ tơ chủng khuẩn cảm ứng từ giống dừa cạn VIN005 C02 C04 C09 C10 C12 C18 C20 C24 C26 C29 C34 rolB rễ thang thường C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C24 C26 C29 C34 rolB rễ thang thường Rễ tơ chủng khuẩn cảm ứng từ giống dừa cạn VIN077 Rễ tơ chủng khuẩn cảm ứng từ giống dừa cạn VIN072 Hình 3.8 Sự diện gen rolB chuyển từ A rhizogenes vào rễ tơ Bảng 3.19 Tóm tắt yếu tố thích hợp đề xuất cảm ứng tạo rễ tơ bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 Yếu tố A rhizogenes Vi khuẩn OD600 nm Phenol Thực vật Loại mô Thời gian gây nhiễm Ủ cảm ứng tối Điều Ủ loại nhiễm kiện nuôi cấy Môi trường mẫu nuôi cấy Nguồn carbon Tỷ lệ mẫu hình thành rễ (%) Giống Dừa cạn VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 C18 C18 C18 C26 0,4 Res 100 µM Lá 0,4 Res 100 µM Lá 0,2 Res 50 µM Lá 0,2 Ace 50 µM Lá phút 10 phút phút 10 phút ngày ngày 1000 lux, 16h/ngày 1000 lux, 16h/ngày 1000 lux, 16h/ngày 1000 lux, 16h/ngày 1/2W 1/2W 1/2W 1/2W Mal 3% Mal 3% Suc 2% Suc 2% 79,9 73,0 69,6 58,3 Res: Resorcylic acid; Ace: Acetosyringone; Mal: Maltose; Suc: Sucrose - 12 - 3.3 Điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ Dừa cạn mơi trƣờng thạch Các dòng rễ tơ thu sau chuyển gen từ A rhizogenes vào giống Dừa cạn có điều kiện để ni cấy bảo quản thích hợp trình bày Bảng 3.22 Các dòng rễ tơ có khả giữ gen rolB sau 12 tháng Khi nuôi cấy bảo quản môi trường thạch nhiệt độ không phù hợp chiếu sáng, rễ tơ có xu hướng chuyển thành sẹo tự phát, phân nhánh thối hóa chóp rễ Bảng 3.22 Tỷ lệ dòng rễ tơ giữ gen rol (%) sau 12 tháng cấy chuyền bảo quản liên tục mơi trường thạch Nhóm dòng rễ tơ Điều kiện bảo quản thích hợp Gene rol rolA rolB rolC o VIN002 Môi trường B5, tối, 25 – 27 C 93,3 90,0 96,7 VIN005 Môi trường B5, tối, 25 – 27oC 90,0 93,3 93,3 VIN072 Môi trường W, tối, 25 – 27oC 90,0 80,0 86,7 o VIN077 Môi trường W, tối, 25 – 27 C 93,3 93,3 90,0 Kết khảo sát 30 dòng rễ phát triển bình thường (khơng tạo sẹo, khơng tạo chồi) cho nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn 3.4 Nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn Kết thu cho thấy số tăng trưởng FGI không giống dòng rễ từ giống Dừa cạn Ngoài ra, FGI thay đổi lớn nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn (Bảng 3.23) Hàm lượng alkaloid tổng số (mg/g trọng lượng rễ khơ) khơng giống dòng rễ tơ cảm ứng từ giống Dừa cạn giống Dừa cạn (Hình 3.12 - 3.15) Dòng rễ có hàm lượng alkaloid tổng số cao khơng hồn tồn tương đồng với dòng có số tăng trưởng cao Hầu hết dòng rễ có số tăng trưởng cao có suất alkaloid tổng số cao Kết giúp chọn lọc bốn dòng rễ tơ có khả tổng hợp alkaloid cao tương ứng cho bốn giống Dừa cạn gồm dòng VIN002-12, VIN005-07, VIN072-15 VIN077-09 - 13 - 70 60 50 40 30 20 10 FGI (g/g FWi) Alkaloid tổng số (mg/g DW) Y alkaloid (mg/g FWi) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN002 Hình 3.12 Biểu đồ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số khả sinh tổng hợp alkaloid nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn VIN002 70 60 50 40 30 20 10 FGI (g/g FWi) Alkaloid tổng số (mg/g DW) Y alkaloid (mg/g FWi) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN005 Hình 3.13 Biểu đồ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số khả sinh tổng hợp alkaloid nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn VIN005 70 60 50 40 30 20 10 FGI (g/g FWi) Alkaloid tổng số (mg/g DW) Y alkaloid (mg/g FWi) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN072 Hình 3.14 Biểu đồ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số khả sinh tổng hợp alkaloid nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn VIN072 - 14 - 70 60 50 40 30 20 10 FGI (g/g FWi) Alkaloid tổng số (mg/g DW) Y alkaloid (mg/g FWi) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN077 Hình 3.15 Biểu đồ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số khả sinh tổng hợp alkaloid nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn VIN077 Bảng 3.23 Chỉ số tăng trưởng khả sinh tổng hợp alkaloid bốn nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn Nhóm dòng rễ Min tơ VIN002 8,4 VIN005 7,8 VIN072 7,3 VIN077 6,9 FGI Max 36,6 31,8 30,2 27,5 Trung bình 21,4 20,0 16,2 15,0 malkaloid (mg/g DW) Trung Min Max bình 4,23 10,20 7,96 4,07 11,13 6,45 6,93 14,9 10,3 6,37 12,77 8,07 Yalkaloid (mg/g FWi) Trung Min Max bình 6,0 57,9 27,6 5,0 58,4 19,7 11,8 57,7 23,3 4,4 54,2 17,4 Kết thu từ khảo sát 20 dòng khác nhóm dòng rễ tơ Tương tự nuôi cấy môi trường thạch, nuôi cấy môi trường lỏng môi trường khơng phù hợp, dòng rễ bị gãy vụn, hóa nâu khơng phát triển, vài trường hợp tạo sẹo tự phát chồi tự phát Hai dòng rễ tơ VIN002-12 VIN005-07 tăng trưởng tốt mơi trường lỏng 1/2B5 hai dòng rễ VIN072-15 VIN077-09 tăng trưởng tốt môi trường lỏng 1/2W - 15 - FGI 25 VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09 20 15 10 0 14 21 28 35 42 Ydb (g/g FWi) Thời gian (ngày) 3 2 1 VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09 14 21 28 35 42 Thời gian (ngày) Hình 3.17 Đồ thị đường cong tăng trưởng dòng rễ tơ chọn lọc theo trọng lượng tươi (trên) trọng lượng khơ (dưới) Nguồn carbon thích hợp cho bốn dòng rễ tơ chọn lọc phát triển sucrose 2% pH ban đầu môi trường nuôi cấy bốn dòng rễ tơ cần kiểm sốt dãy 6,0-6,5 Ở điều kiện nuôi cấy chọn lọc, bốn dòng rễ có pha thích nghi kéo dài đến ngày thứ 14 sau cấy (Hình 3.17) Dòng rễ VIN002-12 VIN077-09 có pha tăng trưởng kết thúc ngày thứ 35 hai dòng rễ VIN005-07 VIN072-15 kết thúc ngày thứ 28 sau cấy Khi kết thúc pha tăng trưởng, dòng rễ tơ chọn lọc VIN00212, VIN005-07, VIN072-15 VIN077-09 đạt số tăng trưởng FGI tương ứng 20,41, 20,13, 20,11 17,12; suất sinh khối khô Ydb tương ứng 3,11, 3,13, 3,05 2,61 (g/g FWi) - 16 - 3.6 Ảnh hƣởng A rhizogenes khả sinh tổng hợp alkaloid Dừa cạn in vivo rễ tơ Khi áp dụng A rhizogenes yếu tố ngoại sinh cách gây nhiễm lên thân in vivo, hai chủng A rhizogenes C18 C26 không ảnh hưởng lên tăng trưởng Dừa cạn Tuy nhiên, khả sinh tổng hợp alkaloid phận lá, thân rễ tăng lên đáng kể so với đối chứng Phân tích alkaloid thành phần có rễ cho thấy chúng thay đổi không giống (Bảng 3.40) thay đổi không phụ thuộc vào chủng vi khuẩn Kết cho thấy ứng dụng chủng C18 để tăng cường sinh tổng hợp alkaloid có giá trị Dừa cạn VIN005 Bảng 3.40 So sánh khả sinh tổng hợp alkaloid rễ Dừa cạn bị A rhizogenes xâm nhiễm so với đối chứng sau 90 ngày gieo hạt Giống Dừa cạn Chủng A rhizogenes Bộ phận Cat So sánh với đối chứng Ajm VCR Vin VBL Lá thử thật =     VIN002 C18 Rễ thử thật =     Lá thử thật =     VIN005 C18 Rễ thử thật =     Lá thử thật =     VIN072 C18 Rễ thử thật =     Lá thử thật =     VIN077 C26 Rễ thử thật = = =   : giảm, : tăng, =: không thay đổi mức ý nghĩa 0,05; Cat: catharanthine, Ajm: ajmalicine, VCR: vincristine, Vin: vindoline, VBL: vinblastine Khi áp dụng A rhizogenes yếu tố nội sinh thông qua dòng rễ tơ, rễ tơ Dừa cạn chọn lọc cảm ứng hai chủng C18 C26 (được thu nhận kết thúc pha tăng trưởng) có khả sinh tổng hợp alkaloid cao đáng kể so với rễ gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes Phân tích HPLC cho thấy hàm lượng alkaloid thành phần dòng rễ khơng giống Trong đó, dòng rễ VIN002-12 khơng chứa Vindoline hai dòng VIN005-07 VIN072-15 chứa - 17 - Ajmalicine Dòng VIN077-09 có đầy đủ alkaloid khảo sát, nhiên có số tăng trưởng FGI suất sinh khối khơ Ydb thấp Ba dòng rễ VIN002-12, VIN005-07 VIN072-15 có FGI Ydb tương đương So sánh áp dụng A rhizogenes yếu tố nội sinh (gây nhiễm trực tiếp lên thân in vivo) yếu tố nội sinh (thông qua rễ tơ chuyển gen rol) cho thấy rễ tơ có biểu tăng khả sinh tổng hợp alkaloid cao rễ gây nhiễm trực tiếp (Bảng 3.44) Đáp ứng tăng biểu sinh tổng hợp alkaloid phụ thuộc vào giống Dừa cạn Ngoài ra, kết so sánh cho thấy rễ tơ có khả tổng hợp Ajmalicine cao Catharanthine, Vindoline, Vinblastine Vincristine thấp rễ gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes Bảng 3.44 So sánh hàm lượng alkaloid tổng số rễ tơ rễ in vivo gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes với rễ đối chứng Giống Dừa Rễ thử thật so với đối Rễ tơ so với đối cạn chứng chứng VIN002 + 1,51b + 2,26b VIN005 + 2,69a + 5,15a VIN072 + 1,76b + 5,89a c VIN077 + 0,40 + 3,18b Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 So sánh tiềm bốn dòng rễ tơ chọn lọc (Bảng 3.45) cho thấy hai dòng VIN002-12 VIN077-09 có tiềm ứng dụng cao nhờ vào khả sinh tổng hợp nhiều thành phần alkaloid với hàm lượng cao Ngoài ra, kết cho thấy giống Dừa cạn VIN005 có hàm lượng alkaloid tổng số rễ thấp gây nhiễm với chủng C18 có biểu đáp ứng tăng sinh tổng hợp alkaloid nhiều bốn giống Qua cho thấy dòng rễ tơ VIN005-07 mang đặc điểm đáp ứng tăng biểu sinh tổng hợp alkaloid (trong có Ajm) sử dụng yếu tố ngoại sinh để kích thích ni cấy dòng rễ tơ - 18 - Bảng 3.45 So sánh đặc điểm, điều kiện nuôi cấy khả sinh tổng hợp Vinca alkaloid dòng rễ tơ chọn lọc Đặc điểm Nguồn gốc Giống Dừa cạn Chủng A rhizogenes cảm ứng Hình thái Đặc điểm tăng trƣởng mơi trƣờng thạch Đặc điểm tăng trƣởng môi trƣờng lỏng Môi trường Điều kiện nuôi cấy FGI (g/g FWi) Alkaloid tổng số (mg/g DW) Dòng rễ tơ chọn lọc VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09 VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 C18 C18 C18 C26 Nhánh rễ dày đều, khơng phình to chóp rễ, phân nhánh đều, thẳng không cuộn B5 B5 W W 25-27 oC, tối 34,8a 31,1ab 30,2b 27,5b 9,37bc 10,60ab 11,13a 8,93c Yalkaloid (mg/g FWi) 57,9ns 58,4ns 57,7ns 54,2ns Môi trường pH Nguồn carbon Thời gian kết thúc pha tăng trưởng FGI cuối pha tăng trưởng (g/g FWi) 1/2B5 1/2B5 1/2W 6,0 – 6,5 Sucrose 2% 1/2W 35 ngày 28 ngày 28 ngày 35 ngày 20,41a 20,13a 20,11a 17,12b Ydb (g/g FWi) 3,11a 3,13a 3,05a 2,61b Alkaloid tổng số (mg/g DW) Yalkaloid (mg/g FWi) 8,11c 9,09b 10,47a 8,24c 25,29b 28,46b Ajm 1,287b - 31,94a 21,51c Cat 0,756a Năng suất Ajm 1,648a alkaloid thành phần VCR 0,020b (mg/g FWi) VBL 0,801a Cat 0,258b c Ajm 1,069 Ajm 1,296b VCR 0,040a Vin 0,068a VBL 0,030b FGI: số tăng trưởng trọng lượng tươi, Yalkaloid: suất alkaloid tổng số, Ydb: suất sinh khối khô, FWi: trọng lượng tươi rễ nguồn Các trị trung bình số dòng có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 - 19 - CHƢƠNG – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Dựa kết thảo luận trên, chúng tơi có kết luận sau: - Phân lập 13 chủng A rhizogenes có khả cảm ứng rễ tơ Dừa cạn - Xác định số điều kiện thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 đạt 79,9%, 73% 69,6% 58,3% tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ tương ứng - Điều kiện để nuôi cấy bảo quản thạch dòng dòng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN002 VIN005 môi trường Gamborg’s B5 (B5) tối 25-27 oC Điều kiện để nuôi cấy bảo quản thạch dòng dòng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN072 VIN077 tương tự môi trường thạch White Ở điều kiện này, tỷ lệ số dòng rễ tơ giữ gen rolB đạt 90,0%, 93,3%, 80,0% 93,3% tương ứng sau 12 tháng bảo quản - Sàng lọc bốn dòng rễ tơ VIN002-12, VIN005-07, VIN072-15 VIN077-09 có khả tăng trưởng sinh tổng hợp alkaloid cao Hai dòng VIN002-12 VIN005-07 tăng trưởng tốt mơi trường 1/5B5 hai dòng VIN072-15 VIN077-09 tăng trưởng tốt môi trường 1/2W với pH ban đầu môi trường 6,0 – 6,5 nguồn carbon thích hợp sucrose 2% - Rễ tơ Dừa cạn mang gen rol chuyển từ A rhizogenes C18 C26 có khả sinh tổng hợp alkaloid cao rễ in vivo gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes Trong đó, khả sinh tổng hợp Ajmalicine rễ tơ cao rễ in vivo gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes khả sinh tổng hợp Catharanthine, Vindoline, Vinblastine Vincristine ngược lại - 20 - - Chủng A rhizogenes C18 có tiềm ứng dụng để làm tăng khả sinh tổng hợp Ajmalicine, Vindoline, Vincristine Vinblastine giống Dừa cạn VIN005 cách gây nhiễm trực tiếp lên thân - Hai dòng rễ tơ VIN002-12 VIN077-09 có diện nhiều alkaloid có giá trị có khả tăng trưởng cao mà khơng cần bổ sung hormone có tiềm ứng dụng nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ tơ giàu Ajmalicine, Catharanthine, Vindoline, Vincristine Vinblastine 4.2 Đề nghị Từ kết thu bước đầu luận án dựa phân tích tổng quan ban đầu, nhận thấy cấp thiết giải vấn đề sau: - Nghiên cứu bảo tồn chủng A rhizogenes phân lập nhằm bào tồn công cụ chuyển gen phục vụ cho nghiên cứu rễ tơ - Nghiên cứu thêm điều kiện khác phương pháp khác để bảo quản bốn dòng rễ chọn lọc nói riêng rễ tơ từ Dừa cạn để phục vụ việc bảo tồn dòng rễ mục tiêu sau - Nghiên cứu nuôi cấy bốn dòng rễ chọn lọc hướng đến mục tiêu thu nhận alkaloid, đặc biệt hai dòng VIN002-12 VIN077-09 Ngoài ra, dựa kết bước đầu này, chúng tơi cho triển khai nghiên cứu ứng dụng sau: - Dựa khả cảm ứng tạo rễ tơ, việc triển khai nghiên cứu liên quan đến đặc điểm hứa hẹn có nhiều ứng dụng - Ngồi ra, nghiên cứu sản xuất polysaccharide ngoại bào (curdlan) từ chủng dương tính với thuốc thử vanillin - 21 - CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2017), “Nghiên cứu bước đầu nuôi cấy bảo quản dòng rễ tơ từ Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) cảm ứng Agrobacterium rhizogenes phân lập Việt Nam”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, Đã đƣợc chấp nhận đăng Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2017), “Nghiên cứu tăng trưởng môi trường lỏng rễ tơ Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) cảm ứng Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, Đã đƣợc chấp nhận đăng Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2017), “Phân lập nhận diện Agrobacterium rhizogenes có khả cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn (Catharanthus roseus) in vivo”, Tạp chí phát triển Khoa học Cơng nghệ, Tạp chí phát triển Khoa học Cơng nghệ, tập 20(T1), 48-59 Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2016), “Khả cảm ứng hình thành rễ chuyển gen từ Dừa cạn (Catharanthus roseus) chủng Agrobacterium rhizogenes phân lập Việt Nam”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, tập 19(T3), 44-52 Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2016), “Ảnh hưởng yếu tố nuôi cấy lên cảm ứng rễ chuyển gen từ giống Dừa cạn (Catharanthus roseus) chủng Agrobacterium rhizogenes C18”, Tạp chí KHKTNLN, Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM, tập 2, 26-33 Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2016), “Ảnh hưởng yếu tố nuôi cấy lên cảm ứng rễ chuyển gen từ Dừa cạn (Catharanthus roseus) chủng Agrobacterium rhizogenes C26”, Tạp chí Khoa học, Trường ĐH Cần Thơ, tập 44b 96-103 - 22 - Nguyễn Nhƣ Nhứt Bùi Văn Lệ (2015), “Ảnh hưởng hợp chất phenol huyền phù Agrobacterium rhizogenes lên khả cảm ứng hình thành rễ chuyển gen từ Dừa cạn (Catharanthus roseus)”, Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP TPHCM, tập 12(78), 152160 - 23 - ... lượng alkaloid tổng số khả sinh tổng hợp alkaloid nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn VIN077 Bảng 3.23 Chỉ số tăng trưởng khả sinh tổng hợp alkaloid bốn nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn Nhóm... dòng rễ tơ từ Dừa cạn tiềm chọn lọc dòng rễ tơ thích hợp cho nghiên cứu có liên quan -1- Mục tiêu Phân lập chủng A rhizogenes có tự nhiên đánh giá ảnh hưởng chủng A rhizogenes thu lên khả sinh tổng. .. rhizogenes đất vùng rễ số trồng Việt Nam khả chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ chúng Dừa cạn ảnh hưởng chúng lên khả sinh tổng alkaloid Dừa cạn rễ tơ Ý nghĩa thực tiễn Luận án góp phần thu thập A rhizogenes