ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NHƯ NHỨT PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN NHƯ NHỨT
PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes
VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ
CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus)
Ngành: Sinh học
Mã số ngành: 62 42 30 15
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Tp Hồ Chí Minh – Năm 2018
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
- PTN Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương
- PTN LabB, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật và Chuyển hóa thứ cấp, trường ĐH KHTN – ĐHQG.HCM
vào hồi … giờ … ngày … tháng … năm 2018
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1 Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM
2 Thư viện trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG.HCM
Trang 3- 1 -
CHƯƠNG MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Nuôi cấy rễ tơ được chuyển gen bằng Agrobacterium rhizogenes là kỹ
thuật đang được sử dụng phổ biến nhằm thay thế cho kỹ thuật nuôi cấy sẹo
và nuôi cấy huyền phù cho nhiều loài thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp (Doran, 2013) Kỹ thuật này cũng đã được áp dụng trên cây Dừa cạn cho các mục đích chất thứ cấp từ những năm 1980 Tuy nhiên không may mắn khi hầu hết các dòng rễ tơ cây Dừa cạn có tốc độ tăng trưởng thấp (Peebles, 2008) Mặc dù vậy, cho đến nay các nghiên cứu không ngừng được thực hiện nhằm tìm ra dòng rễ tơ có khả năng tổng hợp hợp chất đích mong muốn Gần đây, Hanafy và cộng sự (2016) cũng đã tiến hành nghiên cứu
cảm ứng tạo rễ tơ cây Dừa cạn bằng chủng A rhizogenes K599 Cơ sở để
các các nhà khoa học tin tưởng tiếp tục nghiên cứu là do đặc điểm chuyển
gen của A rhizogenes là quá trình chèn các gen trên plasmid Ri của nó vào
vị trí ngẫu nhiên trên bộ gen của tế bào thực vật dẫn đến các dòng rễ tơ thu được sẽ có đặc điểm tăng trưởng khác nhau (Chandra và cộng sự, 2013) Cũng chính vì lý do đó mà việc nghiên cứu sản xuất được nhiều dòng rễ tơ khác nhau và sau đó là sàng lọc được dòng rễ tơ mong muốn gặp nhiều khó khăn và tốn nhiều thời gian Mặt khác, cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu
trên rễ tơ cây Dừa cạn vẫn còn hạn chế khi chỉ vận dụng vài chủng A rhizogenes nhất định Trong khi đó, loài vi khuẩn này phổ biến rộng rãi
trong đất (Wang, 2006; Murugesan và cộng sự, 2010) Do đó, việc khai
thác các chủng A rhizogenes hoang dại được phân lập từ đất sẽ mang đến
cơ hội thu được nhiều dòng rễ tơ mới từ cây Dừa cạn cũng như tiềm năng chọn lọc được dòng rễ tơ thích hợp cho các nghiên cứu có liên quan
Trang 4- 2 -
Mục tiêu
Phân lập các chủng A rhizogenes có trong tự nhiên và đánh giá ảnh hưởng của các chủng A rhizogenes thu được lên khả năng sinh tổng hợp Vinca alkaloid của cây Dừa cạn thông qua gây nhiễm trực tiếp lên cây in vivo như yếu tố ngoại sinh và thông qua rễ tơ được cảm ứng bằng A rhizogenes như yếu tố nội sinh
Ý nghĩa khoa học
Luận án nhằm ghi nhận sự hiện diện của A rhizogenes trong đất vùng rễ
của một số cây trồng ở Việt Nam và khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ
tơ của chúng trên cây Dừa cạn cũng như ảnh hưởng của chúng lên khả năng sinh tổng alkaloid của cây Dừa cạn và rễ tơ
Ý nghĩa thực tiễn
Luận án góp phần thu thập được A rhizogenes bản địa làm công cụ cho
các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào thực vật Ngoài ra, kết quả của luận
án giúp sản xuất được nhiều dòng rễ tơ khác nhau từ cây Dừa cạn phục vụ
cho các nghiên cứu sau này hướng đến sản xuất Vinca alkaloid
Nội dung nghiên cứu
1 Phân lập A rhizogenes từ mẫu đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt
Nam có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn
2 Sàng lọc chủng A rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cao ở
cây Dừa cạn và nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp để cảm ứng cho chủng vi khuẩn đã chọn lọc
Trang 5- 3 -
3 Nghiên cứu chọn lọc một số điều kiện để bảo quản rễ tơ Dừa cạn
4 Sàng lọc dòng rễ tơ có khả năng tăng trưởng và sinh tổng hợp alkaloid cao và nghiên cứu chọn lọc điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ trong môi trường lỏng
5 Khảo sát hàm lượng alkaloid tổng số và một số alkaloid có giá trị
trong rễ tơ và rễ cây in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A rhizogenes
chọn lọc
Trang 6- 4 -
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu sơ lược về Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm, hiện diện phổ biến trong đất Chúng cùng họ với Rhizobium và có khả năng
xâm nhiễm vào vết thương của thực vật gây ra triệu chứng bệnh rễ tơ (Tzfira và Citovsky, 2008) Tình trạng phân loại đến loài và dưới loài của
chúng còn rất phức tạp nên vẫn được gọi là R rhizogenes Chúng có khả
năng chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo thành rễ tơ nhờ có mang plasmid Ri Quá trình chuyển gen của chúng vào tế bào thực vật vẫn
chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn và có nhiều điểm giống với A tumefaciens
1.2 Giới thiệu sơ lược về cây Dừa cạn
Cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) có nguồn gốc ở Madagascar và
được trồng như cây cảnh ở nhiều nơi trên thế giới Chúng được sử dụng như dược liệu nhờ khả năng sinh tổng hợp những hợp chất có giá trị Trong
đó gồm các Vinca alkaloid có hoạt tính chống ung thư trên người Tuy
nhiên, hàm lượng của chúng trong cây Dừa cạn rất thấp nên các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu các kỹ thuật sản xuất nhằm nâng cao sản lượng của chúng (Peebles, 2008)
1.3 Sơ lược về rễ tơ
Rễ tơ thu được từ sự chuyển gen của A rhizogenes vào tế bào thực vật
có đặc điểm phát triển nhanh không cần hormone, ổn định về mặt di truyền,
có khả năng tổng hợp hợp chất thứ cấp cao hơn cây chủ Do đó, rễ tơ được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như sản xuất hợp chất đích, xử lý môi trường, nghiên cứu các con đường chuyển hóa và sinh lý rễ, tạo giống cây trồng…
Trang 7- 5 -
1.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng A rhizogenes trong khai thác rễ
tơ Dừa cạn
Quá trình chuyển gen của A rhizogenes vào tế bào thực vật xảy ra ngẫu
nhiên nên vị trí chèn các gen từ vi khuẩn vào bộ gen tế bào chủ cũng như số lượng bản sao được chèn cũng không giống nhau Do đó, các dòng rễ tơ thu được có đặc điểm tăng trưởng vào biến dưỡng cũng không giống nhau Không may mắn là rễ tơ cây Dừa cạn có khả năng tăng trưởng thấp hơn rễ
tơ từ nhiều loài thực vật khác Trong khi đó, hầu hết các nghiên cứu chỉ sử
dụng vài chủng A rhizogenes nhất định và chủ yếu chúng mang plasmid tái
tổ hợp để làm sáng tỏ con đường biến dưỡng Mặt khác, dù có tính di truyền ổn định hơn so với nuôi cấy tế bào, vài dòng rễ tơ có thể mất đặc điểm mong muốn sau một thời gian cấy chuyền Vì thế, cho đến nay, các nhà khoa học không ngừng nổ lực sản xuất các dòng rễ tơ mới cũng như tìm kiếm các biện pháp khác nhau để can thiệp nhằm khai thác tối đa kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất các dược chất có giá trị
Trang 8- 6 -
CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Luận án nhằm nghiên cứu khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ của
A rhizogenes hiện diện trong đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam trên cây Dừa cạn in vivo và in vitro Qua đó, đánh giá ảnh hưởng của chúng lên
khả năng sinh tổng hợp alkaloid tổng số và một số alkaloid thành phần của
cây in vivo và rễ tơ thu được trong in vitro
2.2 Vật liệu
Các mẫu đất được lấy từ vùng rễ của một số loại cây trồng ở Việt Nam
được dùng để phân lập A rhizogenes
Chủng A rhizogenes ATCC 15834 và các chủng vi khuẩn làm đối chứng cho các kiểm tra sinh hóa nhận diện A rhizogenes
Các cây họ đâu và cây Dừa cạn in vivo và cây Dừa cạn in vitro
Các hóa chất, môi trường, dụng cụ và thiết bị để phân lập A rhizogenes,
nuôi cấy vi khuẩn, nuôi cấy mô thực vật và tách chiết cũng như xác định hàm lượng alkaloid
2.3 Phương pháp
Các phương pháp được sử dụng chủ yếu:
- Các phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc trên môi trường MG-Te; các phương pháp kiểm tra các đặc điểm hình thái
và sinh hóa của vi khuẩn Emanuel và Lorrence (2009), Murugesan
và cộng sự (2010) và José (2012); phương pháp kiểm tra bệnh học
in vivo theo Georgina và cộng sự (2007) và Kereszt và cộng sự (2007); PCR nhận diện các gen rolABC và gởi mẫu giải trình tự
16s rDNA
Trang 9- 7 -
- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng
- Phương pháp gây nhiễm cảm ứng tạo rễ tơ in vitro; phương pháp
nhận diện rễ tơ chuyển gen bằng phân tích PCR sự hiện diện của
gen rolB trong rễ và các phương pháp nuôi cấy rễ tơ trên môi
trường thạch và môi trường lỏng
- Các phương pháp sinh hóa như phương pháp xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô, phương pháp OTT để tách chiết alkaloid tổng số và phương pháp sắc ký lỏng cao áp phân tích các alkaloid
- Phương pháp xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences)20.0, phép thử Duncan
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu
Mẫu đất
1 Phân lập, nhận diện A rhizogenes
- Phân lập trên môi trường chọn lọc; nhận diện bằng kiểm tra hình thái và sinh hóa, sinh học phân
tử và kiểm tra bệnh học in vivo
2 Nghiên cứu thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ
- Sàng lọc chủng vi khuẩn, lựa chọn loại mô và xác định các điều kiện gây nhiễm (thời gian ngâm mẫu, mật độ tế bào, thời gian ủ cảm ứng, chất cảm ứng, chế độ chiếu sáng, môi trường khoáng cơ bản, nguồn carbon)
4 Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ cây dừa cạn
- Sàng lọc dòng rễ tơ có khả năng sinh tổng hợp alkaloid cao; xác định các điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối (môi trường khoáng cơ bàn, pH ban đầu, nguồn và nồng độ đường) và xác định đường con tăng trưởng.
5 Xác định hàm lượng các alkaloid thành phần có trong cây dừa cạn in vivo và rễ tơ
3 Nghiên cứu nuôi cấy bảo quản rễ tơ cây dừa cạn
- Xác định điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ (môi trường khoáng cơ bản, nhiệt độ và ánh sáng) và
xác định tỷ lệ dòng rễ tơ bảo rồn được gene rol.
Trang 10- 8 -
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập Agrobacterium rhizogenes
Từ 235 mẫu đất vùng rễ của mười loài cây trồng khác nhau (gồm dưa hấu, dưa leo, đậu bắp, đậu đen, đậu đũa, đậu nành, đậu phộng, đậu que, đậu xanh và lúa nước) đã phân lập được 274 dòng khuẩn lạc có đặc điểm tương
tự với Agrobacterium trên môi trường MG-Te với 3 dạng khuẩn lạc khác
nhau (Hình 3.1) Có ba mươi bốn dòng khuẩn lạc có những đặc điểm sinh
hóa giống với loài A rhizogenes
Hình 3.1 Ba dạng khuẩn lạc khác nhau trên môi trường MG-Te đặc trưng
của Agrobacterium
Hình 3.5 Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên bốn giống Dừa cạn in vivo khi
được xâm nhiễm bằng dòng C18 đã phân lập được sau 3 tuần gây nhiễm
Trang 11- 9 -
Kiểm tra bệnh học cho thấy có mười ba dòng khuẩn lạc có khả năng
xâm nhiễm tạo rễ tơ trên bốn giống cây Dừa cạn in vivo VIN002, VIN005,
VIN072 và VIN077 (Hình 3.5) Cả mười ba dòng này đều được nhân diện
thuộc loài A rhizogenes dựa trên trình tự 16S ribosome DNA và đều có
chứa plasmid Ri mang các gen rolABC (Bảng 3.4 và Hình 3.6) Hầu hết
các dòng trong số mười ba dòng đã phân lập được sử dụng cao nấm men 1% làm nguồn nitrogen để phát triển với nguồn carbon thay đổi (glucose,
lactose, mannitol hoặc sucrose) 1-1,5% ở pH 6,5-7,5 (Bảng 3.5) Dựa vào
nguồn gốc phân lập được và điều kiện tăng trưởng đã cho thấy mười ba
dòng này là mười ba chủng A rhizogenes khác nhau
gene rolABC trong
plasmid của mười ba dòng vi khuẩn đã
sàng lọc được
C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang rolA rolB rolC nước thang
C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang
C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang
Trang 12- 10 -
Bảng 3.4 Kết quả so sánh bắt cặp đoạn gen 16s ribosome trên ngân hàng
dữ liệu NCBI và nhận diện gen rolABC ở 13 dòng vi khuẩn có khả năng
tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn
Bảng 3.5 Bảng tổng hợp nguồn gốc và một số điều kiện tăng trưởng của
13 chủng A rhizogenes đã thu nhận được có khả năng chuyển gen cảm ứng
rễ tơ trên cây Dừa cạn
Môi trường pH Nguồn carbon Nguồn nitrogen
C02 VBa2
Đậu bắp 2 MT2 7,0 Mannitol 1,5% Cao nấm men 1% C04 VBa9 3 MT2 7,5 Mannitol 1,5% Cao nấm men 1% C09 VĐu23
Đậu đũa 3 MT4 6,5 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C10 VĐu24 2 MT5 6,5 Sucrose 1,5% Peptone 1%
C12 VHa7 Dưa hấu 3 MT5 7,0 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C15 VLe12 Dưa leo 1 MT5 6,5 Sucrose 1,5% Peptone 1%
C18 VLu14 Lúa nước 3 MT4 6,5 Lactose 1,5% Cao nấm men 1% C20 VNa11 Đậu nành 3 MT4 6,5 Lactose 1,5% Cao nấm men 1% C24 VPh11
Đậu phộng
2 MT2 6,0 Mannitol 1,0% Cao nấm men 1% C26 VPh22 3 MT5 6,5 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C29 VPh56 3 MT2 6,5 Mannitol 1,0% Cao nấm men 1% C32 VXa5
Đậu xanh 2 MT5 6,5 Glucose 1,0% Cao nấm men 1% C34 VXa21 3 MT5 7,0 Glucose 1,0% Cao nấm men 1%
Trang 13- 11 -
3.2 Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn in vitro
Ở điều kiện in vitro, cả 13 chủng đã phân lập được đều có thể cảm ứng
tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn Rễ tơ do 13 chủng vi khuẩn cảm ứng đều có
mang các gen rol thông qua kết quả phân tích PCR (Hình 3.8) So với
chủng A rhizogenes ATCC 15834 và 12 chủng còn lại, chủng A rhizogenes C18 có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất trên cả ba giống
Dừa cạn VIN002, VIN005 và VIN072 (Bảng 3.6) Trong khi đó, chủng A
rhizogenes C26 có khẳng năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất trên
giống Dừa cạn VIN077 Điều kiện thích hợp để thu nhận rễ chuyển Dừa
cạn bằng hai chủng A rhizogenes C18 và C26 thay đổi tùy theo giống Dừa
cạn (Bảng 3.7) Rễ tơ thu được phát triển nhanh hơn rễ thường và có nhiều lông rễ bao quanh (Hình 3.9)
Bảng 3.6 Tỷ lệ mẫu hình thành rễ trên bốn giống Dừa cạn được cảm ứng
C18 59,4 a 50,3 a 40,0 a 20,2bC20 0i 31,4e 23,5c 0gC24 40,7d 47,5b 14,4e 7,2e
C26 38,1e 43,2c 10,6f 26,7 a
C29 24,8g 46,4b 0,8h 3,8fC32 55,0b 45,6bc 0h 0gC34 45,8c 29,3e 31,5b 21,4bATCC15834 29,3f 30,3e 32,5b 21,7b
Trang 14- 12 -
Hình 3.8 Sự hiện diện của gen rolB được chuyển từ A rhizogenes vào rễ
tơ
Bảng 3.19 Tóm tắt các yếu tố thích hợp được đề xuất khi cảm ứng tạo rễ
tơ trên bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 và VIN077
VIN002 VIN005 VIN072 VIN077
trong tối 5 ngày 6 ngày 6 ngày 6 ngày
Ủ loại nhiễm 1000 lux,
16h/ngày
1000 lux, 16h/ngày
1000 lux, 16h/ngày
1000 lux, 16h/ngày Môi trường
nuôi cấy 1/2W 1/2W 1/2W 1/2W Nguồn carbon Mal 3% Mal 3% Suc 2% Suc 2%
Rễ tơ do các chủng khuẩn
cảm ứng từ giống dừa cạn VIN072
Rễ tơ do các chủng khuẩn cảm ứng từ giống dừa cạn VIN077
Trang 15- 13 -
3.3 Điều kiện nuôi cấy và bảo quản rễ tơ cây Dừa cạn trên môi trường thạch
Các dòng rễ tơ thu được sau khi chuyển gen từ A rhizogenes vào các
giống Dừa cạn có điều kiện để nuôi cấy bảo quản thích hợp được trình bày
trong Bảng 3.22 Các dòng rễ tơ có khả năng giữ được gen rolB sau 12
tháng Khi được nuôi cấy bảo quản trên môi trường thạch và nhiệt độ không phù hợp hoặc được chiếu sáng, rễ tơ có xu hướng chuyển thành sẹo
tự phát, ít phân nhánh hơn hoặc thoái hóa chóp rễ
Bảng 3.22 Tỷ lệ dòng rễ tơ giữ được gen rol (%) sau 12 tháng cấy chuyền
bảo quản liên tục trên môi trường thạch
Nhóm dòng
rễ tơ Điều kiện bảo quản thích hợp
Gene rol
Kết quả khảo sát trên 30 dòng rễ phát triển bình thường (không tạo sẹo, không tạo chồi) cho mỗi nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn
3.4 Nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn
Kết quả thu được cho thấy chỉ số tăng trưởng FGI không giống nhau giữa các dòng rễ từ cùng một giống Dừa cạn Ngoài ra, FGI cũng thay đổi
lớn giữa các nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn (Bảng 3.23) Hàm
lượng alkaloid tổng số (mg/g trọng lượng rễ khô) không giống nhau giữa các dòng rễ tơ được cảm ứng từ cùng một giống Dừa cạn và giữa các giống
Dừa cạn (Hình 3.12 - 3.15) Dòng rễ có hàm lượng alkaloid tổng số cao
hơn không hoàn toàn tương đồng với dòng có chỉ số tăng trưởng cao hơn Hầu hết những dòng rễ có chỉ số tăng trưởng cao sẽ có năng suất alkaloid tổng số cao Kết quả trên đã giúp chọn lọc được bốn dòng rễ tơ có khả năng tổng hợp alkaloid cao tương ứng cho bốn giống Dừa cạn gồm các dòng VIN002-12, VIN005-07, VIN072-15 và VIN077-09