Sự lan tơ và hình thành quả thể của nấm cordyceps militaris trên ký chủ nhộng tằm (bombyx mori) trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỰ LAN TƠ VÀ HÌNH THÀNH QUẢ THỂ CỦA NẤM Cordyceps militaris TRÊN KÝ CHỦ NHỘNG TẰM (Bombyx mori) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Giảng viên hƣớng dẫn : Th.S Văn Hồng Cầm Sinh viên thực : Vũ Thái Thân Mã số sinh viên : 55133514 Khánh Hòa, tháng 7/2017 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỰ LAN TƠ VÀ HÌNH THÀNH QUẢ THỂ CỦA NẤM Cordyceps militaris TRÊN KÝ CHỦ NHỘNG TẰM (Bombyx mori) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Giảng viên hƣớng dẫn : Th.S Văn Hồng Cầm Sinh viên thực : Vũ Thái Thân Mã số sinh viên : 55133514 Khánh Hòa, tháng 7/2017 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Th.S Văn Hồng Cầm, tận tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài viết Báo cáo tốt nghiệp Em xin cảm ơn Cô TS Khúc Thị An Viện Công nghệ Sinh học Môi trường giúp đỡ tạo điều kiện để em thực đề tài Ngoài em xin cám ơn quý Thầy, Cô Viện Công Nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nha Trang tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức tiếp thu trình học không tảng cho trình nghiên cứu đề tài mà hành trang quý báu để em bước vào đời cách vững tự tin Em chân thành cám ơn thầy cô Khu Công nghệ cao Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập Trường Và cám ơn bạn sinh viên Bùi Thị Thúy Kiều, Huỳnh Thị Ngọc Hằng sinh viên Khóa 56 ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nha Trang hỗ trợ giúp đỡ em trình thực đề tài Cuối em kính chúc quý Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao quý Xin chân thành cám ơn ! iii LỜI MỞ ĐẦU Cordyceps militaris, loài nấm ký sinh côn trùng, thuộc ngành nấm túi Ascomycota, có khả hình thành thể kéo dài từ thể ấu trùng côn trùng nhộng (Buenz cộng sự, 2005) Đặc biệt nước Đông Nam Á, C militaris sử dụng cách truyền thống loại thuốc bổ thuốc thuốc dân gian truyền thống (Ying cộng sự, 1987; Holliday Cleaver, 2008) C militaris nhiều công trình công bố khả chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống lại tế bào ung thư in-vitro (Yang cộng sự, 2014; Rao cộng sự, 2010; Reis cộng sự, 2012; Lê Thị Hoàng Yến, 2008), tăng cường tiết insulin chuột (Choi cộng sự, 2004) Hoạt chất cordycepin (3′-deoxyadenosine – đồng dạng nucleoside) có khả kháng tế bào ung thư, chống di căn, hoạt chất kháng khuẩn kháng côn trùng (Song cộng sự, 1998) Trong năm gần C militaris nuôi cấy môi trường lỏng môi trường rắn (Das cộng sự, 2010) loài nuôi cấy thành công loài thuộc chi Cordyceps (Kobayashi, 1941; Sung, 1996) Cho đến nay, số nơi giới, bao gồm Việt Nam, nuôi cấy sản xuất thành công C militaris có hoạt tính sinh học cao giá thể gạo lứt có bổ sung thêm dưỡng chất khác Tuy nhiên, nghiên cứu phát triển quả thể ký chủ nhộng tằm (dạng tự nhiên chúng môi trường sống) lại có công bố sản phẩm C militaris nhộng tằm thương mại hóa với giá thành cao Tại viện Bảo Vệ Thực Vật, giá tiền cho 100 gram khô khoảng triệu VNĐ/80 cá thể nhộng có nấm thân Công ty Biofun bán triệu VNĐ/20 gram tươi Công Ty Cổ Phần Đông Trùng Hạ Thảo Trường An bán triệu VNĐ/ 10 gram khô Báo cáo phát triển C militaris ký chủ nhộng tằm điều kiện in vitro giúp nhà nghiên cứu có thêm thông tin số liệu giá thể khác cho nấm ký sinh giá thể gạo lứt có Từ sở lý luận khoa học thực ti n n i trên, đề tài: “SỰ LAN TƠ VÀ HÌNH THÀNH QUẢ THỂ CỦA NẤM Cordyceps militaris TRÊN KÝ CHỦ iv NHỘNG TẰM TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO” tiến hành với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả lan tơ chủng nấm Cordyceps militaris G, M, N - Khảo sát tốc độ lan tơ chủng nấm Cordyceps militaris G, M, N ký chủ nhộng tằm (B mori) - Khảo sát hình thành thể nấm Cordyceps militaris chủng G, M, N ký chủ nhộng tằm (B mori) - Khảo sát ảnh hưởng cường độ màu sắc ánh sáng đến hình thành thể nấm Cordyceps militaris chủng M, N ký chủ nhộng tằm (B mori) - Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp gây nhi m đến hình thành thể nấm Cordyceps militaris chủng M ký chủ nhộng tằm (B mori) Ý nghĩa thực tiễn - Xác định phương pháp gây nhi m tốt để nghiên cứu nấm Cordyceps militaris ký chủ côn trùng - Xác định chủng nấm Cordyceps militaris có khả sinh trưởng tốt ba chủng nấm khảo sát nghiệm thức khác - Ngoài ra, kết đề tài góp phần củng cố bổ sung cho nghiên cứu điều kiện sinh trưởng, phát triển Cordyceps millitaris ký chủ nhộng tằm trước Cùng với đ , nghiên cứu góp phần tạo nên nguồn sở liệu cho nghiên cứu nước Nhân giống chủng Cordyceps nói chung Cordyceps militaris nói riêng tạo nguồn nguyên liệu thô phục vụ cho công nghiệp dược dể sản xuất từ nấm Cordyceps phù hợp với điều kiện địa lí khí hậu Việt Nam v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii LỜI MỞ ĐẦU iii MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ vii DANH MỤC BẢNG .ix CH VI T T T VÀ KÝ HIỆU x CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học nấm Cordyceps militaris 1.1.1 Phân loại mô tả nấm Cordyceps militaris 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Chu trình sống nấm Cordyceps militaris 1.1.4 Ký chủ 1.2 Giá trị dược liệu 1.3 Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps giới .5 1.4 Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps Việt Nam 1.5 Các phương pháp nuôi cấy C militaris 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris 10 CHƢƠNG II: V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P 12 2.1 Vật liệu đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm .13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 hh g ủ hi t g t ủ hủ g ấ Cordyceps militaris G, M, N 14 Khả s t tố t ủ hủ g ấ Cordyceps militaris G, M, N hi t C 14 Sự hì h h thể ủ ấ Cordyceps militaris hủ g G, M, N trê h g tằ .15 ủ hh g ủ àu sắ g hs g hì h h thể ấ Cordyceps militaris trê h g tằ 15 2.3.5 h h g ủ ph g ph p gây hiễ hì h h thể ủ ấ Cordyceps militaris trê h g tằ .16 CHƢƠNG III: K T QUẢ VÀ THẢO LU N 18 vi 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả lan tơ nấm Cordyceps militaris 18 3.2 Khảo sát tốc độ lan tơ chủng nấm Cordyceps militaris G, M, N nhiệt độ 200C 20 3.3 Khảo sát hình thành thể nấm Cordyceps militaris chủng G, M, N nhộng tằm 21 3.4 Ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến hình thành thể chủng nấm Cordyceps militaris M N .23 3.5 Ảnh hưởng phương pháp gây nhi m đến hình thành thể nấm Cordyceps militaris nhộng tằm 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC .36 vii DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1: Nấm Cordyceps militaris kí sinh sâu tự nhiên Hình 1.2: Vòng đời gây nhi m nấm Cordyceps militaris Hình 1.3: Nuôi cấy dịch huyền phù tơ nấm C militaris Hình 1.4: Nấm C militaris nuôi cấy giá thể gạo lứt Hình 1.5: Nấm C militaris ký chủ nhộng tằm (B mori) Hình 2.1: Ống thạch nghiêng giống nấm C militaris 12 Hình 2.2: Nhộng tằm B mori tươi 12 Hình 2.3: Quy trình nghiên cứu lan tơ hình thành thể nấm Cordyceps militaris 13 Hình 3.1: Quá trình lan tơ chủng C militaris M ủ 150C, 200C, 250C độ ẩm 90% 19 Hình 3.2: Đồ thị biểu di n tốc độ lan tơ chủng Cordyceps militaris G, M, N 20 Hình 3.3: Quá trình lan tơ nấm C militaris M 21 Hình 3.4: Quá trình hình thành phát triển thể nấm C militaris M nhộng tằm giai đoạn sáng 21 Hình 3.5: Lát cắt nhộng tằm kính hiển vi soi độ ph ng đại 10X 23 Hình 3.6: Đồ thị biểu di n kích thước trung bình thể nấm C militaris chủng M N điều kiện loại ánh sáng khác 21 Hình 3.7: Đặc điểm thể chủng C militaris M N điều kiện loại ánh sáng khác 21 Phụ lục 1.1: Nồi hấp tiệt trùng 36 Phụ lục 1.2: Tủ ấm vi sinh 36 Phụ lục 1.3: Tủ sấy dụng cụ 37 Phụ lục 1.4: Máy đo cường độ ánh sáng 37 Phụ lục 1.5: Kính hiển vi soi 37 Phụ lục 1.6: Buồng đếm hồng cầu 39 viii Phụ lục 1.7: Kích thước ô buồng đếm hồng cầu 39 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ lan tơ chủng C militaris G, M, N nhiệt độ khác 18 Bảng 3.2 Đặc điểm thể chủng nấm C militaris G, M, N nhộng tằm 22 Bảng 3.3 Đặc điểm thể chủng C militaris M & N điều kiện loại ánh sáng khác 25 Bảng 3.4 Đặc điểm thể chủng C militaris chủng M phương pháp gây nhi m 27 35 38 Sung, G.H., Shrestha, y 39 ., Sung, J.M (2010) Characteristics of Met rdy eps g u e sis, a new species from Korea Mycobiology; 38:171–175 Sung, G.H., Spatafora, J.W (2004) Cordyceps cardinalis sp nov., a new species of Cordyceps with an east Asian-eastern North American distribution Mycologia 96: 658–666 40 Sung, J.M (1996) The insects-born fungus of Korea in color Seoul: Kyohak Publishing Co., Ltd 41 Sung, J.M., Choi, Y.S., Shrestha, , Park, Y.J (2002) Investigation on artificial fruiting of C rdy eps i it ris Korean Journal of Mycology 30: 6-10 42 Sung, J.M., Shrestha, , Han, S.K., Kim, S.Y., Park, Y.J., Lee, W.H., Jeong, K.Y., Choi, S.K (2005) C rdy eps diversity in Korea Inoculum; 56(4):3–4 43 Won, S.Y., Park, E.H (2005) Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruitingbodies of Cordyceps militaris J Ethnopharmacol; 96:555–61 44 Yahagi, N., Yahagi, R., Takano, F (2004) Growth of ascoscraps from cultured from cultured Cordyceps militaris (L.:Fr.) Fr Cordyceps formicarum Kobayasi in an agar medium Nippon Kingakukai Kaiho, 45: 15-19 45 Ying, J., Mao, X., Mao, Q., Zong, Y., Wen, H (1987) Icons of medicinal mushroom from China Science, Beijing, pp 151-155 46 Zhang, J.Y., Wu, K.L., uan, J (2010) Influence of air permeability on growth of C rdy eps i it ris Guangdong gricultural Science 4:45–47 47 Zhang, X.K., Liu W.K (1997) Experimental studies on planting C rdy eps i it ris (L ex Fr.) Link with different culture materials Edible Fungi China, 16(2): 21-22 36 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Vật liệu thành phần môi trƣờng M t số h - hất Một số h a chất, môi trường vi sinh thương mại tự pha: S , P (Himedia, Ấn Độ), PDB - Một số h a chất khác: cồn 96o, cồn 70o, nước cất b Dụ g ụ thi t bị - bả Các thiết bị bản: tủ cấy vi sinh (SANYO BIO CLEAN BENCH MODEL: MCV - 9BS0), tủ sấy (BINDER ED 115), nồi hấp tiệt trùng (HIRAYAMA MODEL: HV-50), tủ ấm vi sinh (SANYO INCUBATOR), máy đo cường độ ánh sáng (SPER SCIENTIFIC 850008), kính hiển vi soi (Olympus SZ 61) Phụ ụ : Nồi hấp ti t trù g Phụ ụ : Tủ ấ vi si h 37 Phụ ụ 3: Tủ sấy dụ g ụ Phụ ụ Phụ ụ 4: M y g hs 5: Kí h hiể vi s i ổi (http://maydoyte.vn/hang-san-xuat/Olympus-2086.html) Nguyê i u - Thành phần môi trường: Khoai tây (tươi, không sâu bệnh, không mọc mầm) - Vật chủ ký sinh: nhộng tằm (B mori) tươi nguyên Được mua Đà Lạt - Môi trường P (Potato dextrose agar):  20% khoai tây g 38  2% dextrose  1% agar - Môi trường P :  Khoai tây: 200 g/L  Đường sucrose: 20 g/L - Môi trường S (Sabouraud dextrose agar):  Mycological, pepton: 10 g/L  Agar: 15 g/L  Dextrose: 40 g/L  pH: 5,6 ± 0,2 250C  DistilLED water: L Phụ lục 2: Phương pháp xác định mật độ bào tử nấm - Cấu tạo buồ g m hồng cầu Buồng đếm hồng cầu phiến kính dày hình chữ nhật phần lỏm phẳng có kẻ lưới Trong đ , diện tích ô vuông lớn 1mm2, thể tích 1mm3 Trong buồng đếm có khu vực đếm, diện tích khu 1mm2, thể tích 1mm3 khu vực góc, khu vực có 16 ô vuông nhỏ Khu vực có 25 ô vuông nhỏ, ô vuông nhỏ đ , c 16 ô vuông nhỏ Tổng số ô vuông khu vực đếm 400 ô vuông Diện tích ô vuông thể hình 4.7 Tùy theo kích thước mật độ tế bào, người làm thí nghiệm chọn cách đếm nhóm ô vuông khác (Ví dụ : Với tế bào nhỏ dày đặc đếm theo ô vuông nhỏ (như hồng cầu) Với tế bào lớn thưa thớt đếm theo ô vuông lớn (như bạch cầu) 39 Phụ ụ 6: Buồ g m hồng cầu https://www.thegioicongnghiep.com/index.php Phụ ụ 7: Kí h th ớc ô buồ g m hồng cầu (http://nghetomtep.com/ky-thuat-lab-phuong-phap-xac-dinh-mat-do-tao-trong-nuoc4387.aspx) 40 - X ịnh mật bào tử có dịch nuôi cấy ước 1: Hút ml dịch nuôi cấy tơ nấm + Tween 80 cho vào ống eppendorf, dùng micropipet trộn hỗn hợp dung dịch ước 2: Ly tâm hỗn hợp dung dịch 13000 vòng/phút thu cặn ước 3: Phần cặn pha loãng gấp 4, 8, 16, 32 lần ước : Chọn độ pha loãng cho buồng đếm có – 10 bào tử/1 ô lớn ước 5: Chọn ô lớn góc ô lớn trung tâm đếm ô ước 6: Trong ô lớn, đếm số bào tử nấm quy định theo đường dzích dzắc từ trái sang phải dải ô nhỏ bào tử nấm nằm cạnh bên phải cạnh đáy ô vuông nhỏ thuộc ô đ ước 7: Lấy số trung bình cộng số bào tử nấm ô lớn (A) tính theo công thức ta số lượng bào tử nấm có ml dịch nuôi cấy tơ nấm Trong đ :  A số tế bào đếm 80 ô  4000*10 (1/400 mm2: diện tích ô nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến lammelle)  PL độ pha loãng 41 Phụ lục 3: Kết th nghiệm Phụ lục 3.1: Kết lan tơ sau ngày nuôi cấy tơ nhộng chủng C militaris G, M, N Chủng G Nhiệt độ Số sâu lan tơ Số sâu lan tơ lần (n=20) 40C lần (n=20) Số Sâu lan tơ lần (n=20) Tỷ lệ sâu lan tơ trung bình 0 0% 80C 7 31,67 ± 1,91%a 150C 20 20 20 100%b 200C 20 20 20 100%b 250C 20 20 20 100%b 300C 0 0% 370C 0 0% 400C 0 0% Tỷ lệ sâu lan tơ trung bình Chủng M Nhiệt độ Số sâu lan tơ Số sâu lan tơ lần (n=20) lần (n=20) Số Sâu lan tơ lần (n=20) 40C 0 0% 80 C 10 8 43,33 ± 1,92%a 150C 20 20 20 100%b 200C 20 20 20 100%b 250C 20 20 20 100%b 300C 0 0% 370C 0 0% 400C 0 0% 42 Chủng N Số sâu lan tơ Số sâu lan tơ lần (n=20) 40C lần (n=20) Số Sâu lan tơ lần (n=20) Tỷ lệ sâu lan tơ trung bình 0 0% 80C 8 38,33 ± 0,96%a 150C 20 20 20 100%b 200C 20 20 20 100%b 250C 20 20 20 100%b 300C 0 0% 370C 0 0% 400C 0 0% Nhiệt độ * Số i u ợ xử ý bằ g phầ ề St tgr phi s e turi giá trị phân hạng biểu diễn khác bi t mẫu XV I (với P