Bai 2 MOI TRUONG DINH DUONG

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG Bài 2: 2.1 Mục tiêu: - Giúp sinh viên nắm vững cách pha, sử dụng, bảo quản hóa chất, môi trường dinh dưỡng, chất kích thích sinh trưởng (KTST) - Sinh viên tự pha thành thạo môi trường phục vụ cho thí nghiệm 2.2 Cơ sở lí thuyết: Thành công thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật tìm thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng phát triển Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài bộ phận nuôi cấy, tùy theo phát triển phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn trì mô trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh hoàn chỉnh Người ta đã đưa nhiều loại môi trường khác cho thí nghiệm nuôi cấy mô Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa chúng nghiên cứu để nuôi cấy mô đặc biệt Một số môi trường khác có ứng dụng rộng đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, nhiên chỉ dẫn chung cho rằng môi trường chúng bảo đảm sinh trưởng tốt Để bắt đầu, cần phải thử môi trường thông dụng đó, chẳng hạn môi trường Murashige-Skoog (1962) không thành công thì sau thử môi trường khác Tuy vậy, tất môi trường nuôi cấy cũng gồm năm thành phần chính: - (1) Đường cung cấp nguồn carbon: Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô trình quang hợp cung cấp mà đường có môi trường dinh dưỡng Hai dạng đường thường sử dụng saccharose glucose Nhưng saccharose sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng 2-3% - Các muối khoáng đa lượng: Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với trồng điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P, K, Ca, Mg S (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Các muối khoáng đa lượng dùng nuôi cấy mô Stt Nguyên tố đa lượng N (NO3-, NH4+) Dạng sử dụng Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3, NH4NO3, Nồng độ (mM) [NO3-, NH4+] (NH4)2SO4 khoảng 20 P NaH2PO4.7H2O, KH2PO4 khoảng K KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4 khoảng 10 Ca Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O hoặc khoảng CaCl2.6H2O Mg S MgSO4.7H2O 0,5-3 (NH4)2SO4 khoảng - Các muối khoáng vi lượng: Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật nuôi cấy lĩnh vực nghiên cứu Rất nguyên tố vi lượng đã chứng minh không thể thiếu đối với phát triển của mô tế bào nuôi cấy Tuy nhiên, đã sinh lý học thực vật chứng minh đối với hoàn chỉnh có thể sử dụng hầu hết nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cho mô tế bào nuôi cấy môi trường nhân tạo Vì vậy, cung cấp có tính kinh nghiệm trường hợp cụ thể có thể không cần thiết (Bảng 2.2) Bảng 2.2 Các muối khoáng vi lượng dùng nuôi cấy mô Stt Nguyên tố vi lượng Mn Dạng sử dụng Nồng độ (mg/L) MnSO4.4H2O 15-100 B H3BO3 6-100 Zn ZnSO4.7H2O 15-30 Cu CuSO4.5H2O 0,01-0,08 Mo Na2MoO4.2H2O 0,007-1 Co CoCl2.6H2O 0,1-0,4 I KI 2,5-20 Fe FeSO4.7H2O 15-27,9 - Các vitamin: Bảng 2.3 trình bày vitamin thường dùng môi trường nuôi cấy (chủ yếu bốn loại đầu) Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ điều kiện lạnh dưới 0oC (trong ngăn đá tủ lạnh) Bảng 2.3 Các loại vitamin thường dùng nuôi cấy mô Stt Nồng độ (mg/L) Tên vitamin myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5-1 Pyridoxine.HCl (Vit B6) 0,05-0,5 Thiamine.HCl (Vit B1) 10-50 Panthotenate calcium (Vit B5) 1-5 Riboflavin (Vit B2) 1-5 Biotin 0,1-1 Folic acid 0,1-1 - Các chất điều khiển sinh trưởng: Các chất KTST (Bảng 2.4) đóng vai trò quan trọng phân hóa, phát sinh hình thái của nuôi cấy mô tế bào thực vật Một số chất sinh trưởng không tan nước, pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cần ý: + Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA GA3: cân một lượng chất sinh trưởng đủ pha lượng thể tích dung dịch mẹ cần dùng vào một ly khô, thêm 2-3 mL cồn 90% rồi lắc đến tan hết, sau mới thêm nước cất đến thể tích cần pha + Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất vài giọt HCl 1N, hoặc NaOH 1N, lắc cho tan sau thêm nước cất đến thể tích cần pha + Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1N trước pha đến thể tích cần thiết Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng lọ kín (riêng IAA bảo quản lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản vậy một năm BAP, IBA, KIN, GA3 bảo quản từ đến tháng IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính Bảng 2.4 Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng Chữ viết tắt Chất kích thích sinh trưởng Chữ viết tắt Chất kích thích sinh trưởng BA Benzyladenin KIN Kinetin BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid GA3 Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin 2-iP 2-Isopentenyl adenin 2,4-D NOA Naphthoxyacetic acid Pic 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Picloram Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA ) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết cà chua ) Ngoài việc xác định thành phần môi trường phù hợp cho nuôi cấy mô tế bào thì việc chuẩn bị môi trường dinh dưỡng cách có ý nghĩa hết sức quan trọng nghiên cứu Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy tiến hành theo bước: (1) Chuẩn bị dung dịch stock; (2) Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng nuôi cấy Trong giới hạn của thực hành lựa chọn môi trường MS làm nuôi cấy Các hóa chất môi trường MS, chất KTST thường sử dụng với nồng độ tương đối nhỏ Để thuận tiện cho việc pha môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc (stock), sau chỉ cần pha loãng sử dụng Các dung dịch đậm đặc bảo quản dài ngày tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy Tùy theo mỗi quan nghiên cứu mà việc phân nhóm dung dịch stock MS nồng độ pha khác đều đảm bảo độ hòa tan bền vững của dung dịch 2.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị a Hóa chất: - Các hóa chất MS - Chất KTST: BAP, NAA, 2,4D - Nước dừa: 500ml - NaOH 0.1N NaOH 1N - HCl 10% - Agar - Đường succrose b Dụng cụ: - Chai sirum: 60 - Bình tam giác: 20 - Giấy nhôm - Xi lanh 50ml - Cốc đong, ống đong loại 50ml,100ml 1000ml c Thiết bị: - Nồi hấp khử trùng - Máy đo pH - Cân phân tích - Micropipet 0.5ml, 1.0 ml - Microwave 2.4 Tiến hành thí nghiệm 2.4.1 Pha dung dịch stock a/ Dung dịch stock MS Trong thí nghiệm này, sẽ tiến hành pha dung dịch stock MS theo bảng 2.5 sau: Bảng 2.5: Hướng dẫn cách pha, sử dụng bảo quản các dung dịch stock MS Lượng sử Stock MS Tên hóa chất dụng Lượng pha Cách pha cho lít (g) Bảo quản pha lít môi trường (ml) KNO3 95 Cân dùng nước cất hoà Bảo quản 40C KH2PO4 8.5 tan lần lượt từng chất trong thời gian bécher cho tan hoàn toàn -5 tháng 20 Tiến hành tương tự Bảo quản 40C 10 thời gian MS1 MS2 NH4NO3 82.5 MgSO4.7H2O CaCl2.2H20 18.5 33.2 Dùng ống đong 1L điều chỉnh cho đủ lít MS3 H3BO3 MnSO4.H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H20 ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2 O KI 0.62 1.69 0.0025 0.0025 1.3042 Tiến hành tương tự -5 tháng Bảo quản 40C thời gian -5 tháng 10 0.025 0.083 Cân hoà tan từng chất Bảo quản 40C bằng 100mL nước cất trong thời gian mỗi bécher riêng Đặt -5 tháng bécher dung dịch nuwocs FeSO4.7H2O 2.78 ấm gia nhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có MS4 nóng bốc lên 10 Khuấy đều đổ dung dịch Na2EDTA vào ống đong 1L, rồi cho từ từ dung dịch Na2-EDTA 4.09 FeSO4 vào, vừa cho vừa khuấy đều Bổ sung nước MS5 Myo-inositol B1 (Thiamin) B6 Nicotinic acid Glycine 10 0.01 0.05 0.05 0.2 cất thể tích lít Cân dùng nước cất hoà Bảo quản 40C tan lần lượt từng chất hoặc ngăn đá bécher cho tan hoàn toàn thời gian Dùng ống đong 1L điều -5 tháng 10 chỉnh bằng nước cất cho đủ lít b/ Pha dung dịch stock chất KTST Để tiện sử dụng dung địch stock chất KTST thường pha nồng độ 1,0 mg/ml theo bảng 2.6: Bảng 2.6: Hướng dẫn cách pha, sử dụng bảo quản các dung dịch stock KTST Dung dịch stock KTST BAP (1,0mg/ml) Cách pha Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan Bảo quản Bảo quản 40C, Kinetin NAA IBA 2,4 – D 5ml NaOH 1N, lắc tan Cho thêm nước cất cho đủ 100 tháng ml Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan Bảo quản 40C, 5ml NaOH 1N, lắc tan Cho thêm nước cất cho đủ 100 tháng ml Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan Bảo quản 40C, 5ml NaOH 1N, lắc tan Cho thêm nước cất cho đủ 100 12 tháng ml Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan Bảo quản 40C, 5ml NaOH 1N, lắc tan Cho thêm nước cất cho đủ 100 tháng ml Cân 100mg 2,4-D (2,4 dichlorophenoxyacetic acid) Bảo quản 40C, hòa 12 tháng tan 30ml ethanol 50%, lắc tan Cho thêm nước cất cho đủ 100ml 2.4.2 Pha môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng lan Dendrobium (kí hiệu:MT1) * Công thức môi trường bao gồm: - MS + 8,0 g/l agar + 30g/l sucrose + 15% (v/v) nước dừa (CW) + 2,0 mg/l BAP (tham khảo P.H.Vĩnh) * Cách pha (pha lít): - Bước 1: Đong lần lượt dung dịch dịch stock (MS1: 20ml, MS2: 10ml, MS3: 10ml, MS4: 10ml, MS5: 10ml) cho vào cốc đong lít đã có sẵn 200ml nước cất Tiếp tục cho lần lượt 30g sucrose, 150 ml CW, 2.0 ml BAP (lấy bằng micropipette) vào cốc đong rồi dùng đũa thủy tinh khuấy tan hết đường, cho nước cất lên đến lít rồi đem điều chỉnh giá trị pH (pH =5.8 ÷ 5.9) Dùng dung dịch NaOH (0.1N, 1N) hoặc HCl (5%,10% ) để điều chỉnh giá trị pH tùy theo giá trị pH của dung dịch - Bước 2: Cho 8g agar vào đem nấu môi trường để hòa tan agar nồi áp suất với thời gian (7-10 phút) - Bước 3: Dùng xi lanh phân phối môi trường (khoảng 45÷50ml/ chai) sau nấu vào chai sirum thể tích 500ml, làm nút kẽm Xếp môi trường vào giỏ đem hấp nồi hấp vô trùng 121 0C/1atm, 20 phút Sau hấp vô trùng đặt chai đựng môi trường lên giá, để nguội Chú ý: Trong trường hợp vì một vài trục trặc gì không thể hấp vô trùng thì có thể bảo quản chai môi trường điều kiện nhiệt độ 4-20 0C 12 Môi trường nuôi cấy phôi lúa (Oryza sativa L), kí hiệu MT2 * Công thức môi trường bao gồm: - MS + 8.0 g/l agar + 30g/l sucrose + 5.0 mg/l BAP + 1.0mg/l casein (tài liệu thực hành a khánh), pH= 5.8 * Cách pha (pha lít): thao tác tương tự MT1 Môi trường nuôi cấy phát sinh callus Ba kích (Morinda officinalis How), kí hiệu: MT3 * Công thức môi trường bao gồm: - MS + 8.0 g/l agar + 30g/l sucrose +3,0 mg/l 2,4-D, pH= 5.8 * Cách pha (pha lít): thao tác tương tự MT1 Nuôi cấy huyền phù tế bào Ba kích (Morinda officinalis How), kí hiệu: MT4 * Công thức môi trường bao gồm: - MS + 30g/l sucrose + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, pH= 5.8 * Cách pha (pha lít): thao tác tương tự MT1 ý không bổ sung agar phân phối vào chai tam giác 250ml 2.5 Đánh giá kết - Quy trình pha chế loại dung dịch stock MS2,MS3,MS5 chất KTST - Quy trình pha chế môi trường MT2, MT3, MT4 ... (NH4)2SO4 khoảng 20 P NaH2PO4.7H2O, KH2PO4 khoảng K KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4 khoảng 10 Ca Ca(NO3 )2. 4H2O, CaCl2.2H2O hoặc khoảng CaCl2.6H2O Mg S MgSO4.7H2O 0,5-3 (NH4)2SO4 khoảng - Các muối khoáng... lít MS3 H3BO3 MnSO4.H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H20 ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2 O KI 0. 62 1.69 0.0 025 0.0 025 1.30 42 Tiến hành tương tự -5 tháng Bảo quản 40C thời gian -5 tháng 10 0. 025 0.083 Cân hoà tan... Zn ZnSO4.7H2O 15-30 Cu CuSO4.5H2O 0,01-0,08 Mo Na2MoO4.2H2O 0,007-1 Co CoCl2.6H2O 0,1-0,4 I KI 2, 5 -20 Fe FeSO4.7H2O 15 -27 ,9 - Các vitamin: Bảng 2. 3 trình bày vitamin thường dùng môi trường nuôi