Nghiên cứu tạo biosensor xác định kháng nguyên HER2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** ĐÀO MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU TẠO BIOSENSOR XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN HER2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn tạo điều kiện tận tình bảo động viên suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu kiến thức lẫn tinh thần từ tập thể phòng Công nghệ tế bào động vật, Trung tâm giám định ADN, Viện Công nghệ sinh học Nhân dịp em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô, bạn bè gia đình dẫn giúp đỡ em suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Đào Minh Đức i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii MỞ ĐẦU - CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 1 UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2 - 1.1.1 Ung thư vú - 1.1.2 HER2 - 1.1.2.1 Xác định biểu HER2 mức ADN - 1.1.2.2 Xác định biểu HER2 mức ARN - 1.1.2.3 Xác định biểu HER2 mức protein - 1.2 BIOSENSOR - 1.2.1 Giới thiệu chung Biosensor - 1.2.2 Lịch sử phát triển Biosensor - 10 1.2.3 Đặc điểm – Yêu cầu Biosensor - 11 1.2.4 Nguyên lý hoạt động chung Biosensor - 12 1.2.5 Ứng dụng Biosensor - 13 1.3 TỔNG QUAN VỀ APTAMER - 15 1.3.1 Khái niệm - 15 1.3.2 Lịch sử - 15 1.3.3 Đặc trưng Aptamer - 16 1.3.4 Ưu điểm Aptamer so với kháng thể - 17 - ii 1.3.5 Phương pháp thu nhận Aptamer – Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) - 18 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 23 VẬT LIỆU - 23 2.1.1 Sinh phẩm - 23 2.1.2 Hóa chất - 23 2.1.3 Trang thiết bị - 25 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 25 2.2.1 Sàng lọc Aptamer đặc hiệu HER2 (Phương pháp SELEX) - 25 2.2.1.1 Chuẩn bị thư viện - 25 2.2.1.2 Sàng lọc - 27 2.2.1.3 Phương pháp tách dòng giải trình tự - 29 2.2.1.3.1 Nhân Aptamer đặc hiệu với HER2 phương pháp PCR - 29 2.2.1.3.2 Phân tích điện di gel agarose - 31 2.2.1.3.3 Phương pháp tinh sản phẩm phản ứng PCR - 32 2.2.1.3.4 Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng - 33 2.2.1.3.5 Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α - 34 2.2.1.3.6 Phương pháp tách ADN plasmid từ vi khuẩn E coli - 35 2.2.1.3.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide - 36 2.2.1.4 Phương pháp gắn Aptamer lên hạt nano vàng - 37 2.2.2 Phương pháp gắn Aptamer lên bề mặt điện cực - 37 2.2.2.1 Xử lý làm điện cực Au - 38 2.2.2.2 Tạo lớp MPA bề mặt điện cực vàng - 38 2.2.2.3 Gắn NHS lên bề mặt điện cực xử lý với MPA - 39 2.2.2.4 Gắn NH2-Aptamer lên điện cực Au/MPA-NHS - 39 2.2.2.5 Định lượng HER2 mẫu điện cực Au/MPA-NHS - 39 2.2.2.6 Tái sử dụng điện cực Au/MPA-NHS - 39 2.2.2.7 Đánh giá hoạt động Aptasensor - 40 2.2.3 Phương pháp lai Dot blot - 40 - iii CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 41 3.1 SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU HER2 - 41 3.1.1 Kết thu nhận xác định trình tự Aptamer - 41 3.1.2 Kết xác định cấu trúc không gian Aptamer - 43 3.1.3 Xác định kết tạo phức hệ Aptamer-hạt nano vàng - 46 3.1.4 Xác định gắn kết Aptamer tế bào BT474 tế bào MCF7 - 48 3.1.5 Xác định gắn kết Aptamer với HER2 kỹ thuật Dot blot - 50 3.2 CHẾ TẠO BIOSENSOR ĐIỆN HÓA - 52 3.2.1 Làm hoạt hóa điện cực - 52 3.2.2 Tạo đơn lớp mỏng bề mặt điện cực vàng - 52 3.2.3 Gắn Aptamer lên điện cực tạo lớp màng mỏng bề mặt - 54 3.2.4 Phong tỏa vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt điện cực - 55 3.2.5 Định lượng kháng nguyên HER2 mẫu phân tích - 59 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 64 - iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Apt Aptamer Bp Cặp base BSA Bovine Serum Albumin ADN Axit deoxyribonucleic EDTA Axit ethyenediaminetetraacetic E.coli Vi khuẩn Escherichia coli SELEX Systematic Evolution of LigADNs by EXponential enrichment NST Nhiễm sắc thể dUTP 2´-Deoxyuridine, 5´-Triphosphate Kb Kilo base LB Môi trường LB PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp RT – PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực ARN Axit Ribonucleic mARN ARN thông tin PBS Phosphate Buffered Saline PVDF Polyvilidene Fluoride ssADN Sợi đơn ADN SDS Natri dodexyl sulphat TAE Tris – acetate – EDTA Taq polymerase Enzyme polymerase chịu nhiệt ddNTP dideoxynucleotide triphosphat HER Human epidermal growth factor receptor WHO Tổ chức y tế giới v MAPK Mitogen-activated protein kinase PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase FISH Fluorescence in situ hybridization CISH Chromogenic In Situ Hybridization SISH Silver In Situ Hybridization DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindol.2 HCl l IHC Immunohistochemocal technique DAB 3,3’-diaminobenzidine chromogen TE Tris – EDTA MPA 3-Mercaptopropionic acid MES 2-(N-morpholino) ethane-sulfonic acid NHS N-hydroxy-succinimide EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride KOH potassium hydroxide H2O2 hydrogen peroxide NaBH4 sodium borohydride Au Vàng CV Cyclic voltammetry SWV Square wave voltammetry DMSO Dimethyl sulfoxide DTT Dithiothreitol SB Selex Buffer vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Khảo sát mức độ khuyếch đại gen HER2 NST 17 tế bào mô vú phương pháp FISH Hình 1.2 Khảo sát biểu thụ thể HER2 phương pháp IHC Mức độ biểu thụ thể HER2 đánh giá theo phương pháp DAKO Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo Biosensor Hình 1.4 Các thành phần yếu tố nhận biết sinh học dạng Biosensor Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động chung Biosensor Hình 1.6: Quy trình Phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) Hình 1.7 Sơ đồ Aptamer ssADN Hình 2.1 Quy trình tách dòng giải trình tự oligonucleotide gắn đặc hiệu HER2 Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) Hình 2.3 Sơ đồ tạo lớp mỏng điện cực để gắn Aptamer Hình 3.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR tạo thư viện thứ cấp Hình 3.2 Kết kiểm tra sản phẩm PCR sau khuếch đại vòng sàng lọc thứ 12 sau vòng sàng lọc loại trừ Hình 3.3 Cấu hình không gian Aptamer-1 đặc hiệu HER2 Hình 3.4 Cấu hình không gian Aptamer-2 đặc hiệu HER2 Hình 3.5 Phổ hấp thụ Aptamer phức hệ Aptamer hạt nano vàng Hình 3.6 Phổ hấp thụ UV-Vis phức hệ Aptamer-hạt nano vàng Hình 3.7 Kết xác định lực phức hệ Apt-Au tế bào BT474 tế bào MCF7 Hình 3.8 Kết Dot Blot mẫu hạt vàng có gắn Aptamer hạt vàng không gắn Aptamer Hình 3.9 Kết Dot Blot tính đặc hiệu Aptamer với HER2 Hình 3.10 Thế vòng (CV-cyclic voltammetry) điện cực Au dung dịch H2SO4, nồng độ 0,5M Hình 3.11 Thế vòng (CV) sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au Au-MPA thời gian ủ khác Hình 3.12 Thế vòng (CV) sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au AuMPA-Apt nồng độ khác Hình 3.13 Thế vòng (CV- cyclic voltammetry) sóng vuông (square wave voltammetry - SWV) điện cực Au Au-MPA-Apt-BSA Hình 3.14 Thế vòng (CV) điện cực Au bước sửa đổi Hình 3.15 Đồ thị liên quan dòng đôi với điện cực có bề mặt biến đổi khác xác định theo kỹ thuật quét sóng vuông (SWV) điện cực vàng bước biến đổi Hình 3.16 Thế vòng (CV) sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au AuMPA-Apt-BSA ủ với nồng độ kháng nguyên HER2 khác vii 13 16 18 20 21 27 28 37 41 46 50 52 53 54 55 56 58 60 60 61 62 63 65 66 67 69 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh ưu điểm Aptamer kháng thể Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo sợi đơn ADN Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại trình tự gắn Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự gắn Bảng 2.6 Nồng độ gel sử dụng với kích thước ADN tương ứng Bảng 2.7 Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector PCR2.1 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ ADN sau sàng lọc bước Bảng 3.2 Kết đo nồng độ (ng/µL) ADN sau vòng sàng lọc Bảng 3.3 Kết xác định phổ UV-Vis phức hệ Aptamer-hạt nano vàng Bảng 3.4 Phổ hấp thụ hạt nano vàng phức hệ hạt nano vàngAptamer Bảng 3.5 Kết đo dòng (µA) điện cực sau xử lý MPA Bảng 3.6 Kết xác định dòng đối điện cực vàng sau bước xử lý 26 34 34 35 38 39 41 42 50 51 Bảng 3.7 Kết xác định dòng điện cực vàng bước xử lý BSA Bảng 3.8 Kết xác định dòng điện cực sau bước biến đổi Bảng 3.9 Kết xác định dòng điện cực ủ với dung dịch HER2 64 viii 55 56 62 63 66 68 MỞ ĐẦU Ung thư vú bệnh hiểm nghèo thường gặp phụ nữ, chiếm gần 30% số trường hợp mắc bệnh ung thư năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1.1 triệu ca 410,000 trường hợp tử vong bệnh ung thư Theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO), Mỹ nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao giới, trung bình phụ nữ có người mắc bệnh ung thư vú Các nước châu Âu có tỷ lệ mắc ung thư vú thấp Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 năm Ở châu Á số nước phát triển, tỷ lệ mắc ung thư vú thấp Mỹ châu Âu có xu hướng tăng nhanh, trung bình khoảng 40,5/100.000 dân năm (Farooq, 2005) Trong 15 năm qua Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú vượt qua ung thư cổ tử cung tiếp tục tăng cao năm tới Hiện nay, Hà Nội TP Hồ Chí Minh hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao Trong 100.000 phụ nữ Hà Nội có 30 phụ nữ mắc ung thư vú năm, TP Hồ Chí Minh tỷ lệ 20/100.000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010) Một thị ung thư vú quan tâm thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (Human epithelial growth factor receptor hay HER2) Tế bào vú bình thường có gen HER2 tế bào ung thư vú dương tính HER2, gen HER2 khuếch đại thành nhiều dẫn đến tượng HER2 biểu bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter, 1987) Bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu sống sót vài năm sau mắc bệnh Như vậy, việc xác định sớm hàm lượng HER2 thể có vai trò quan trọng chẩn đoán điều trị ung thư vú Hiện có nhiều phương pháp xác định mức độ biểu mức HER2 Tuy nhiên, phương pháp nêu có ưu điểm hạn chế định Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp để xác định -1- 0,20 15,5 6,77 7,44 7,49 8,64 0,25 9,39 0,465 0,347 1,97 4,23 0,30 2,2 0,3 0 0,775 0,35 1,46 1,19 0 1,44 0,40 2,05 1,16 0,348 1,35 1,69 0,45 1,7 0,913 1,46 1,42 1,38 0,50 1,48 1,09 1,34 1,23 1,26 3.2.4 Phong tỏa vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt điện cực Để phong tỏa vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt điện cực, sau gắn Aptamer đặc hiệu HER2 lên bề mặt điện cực kiểm tra biến đổi dòng bước trên, điện cực ngâm với BSA với nồng độ với thời gian ủ khác Kết phong tỏa BSA vị trí gắn kết không đặc hiệu kiểm tra khả biến đổi dòng điện tích quét vòng sóng vuông (Bảng 3.7, Hình 3.13) Bảng 3.7 Kết xác định dòng điện cực vàng bước xử lý BSA Current (µA) Potential Au-MPA-Apt- Au-MPA-Apt- Au-MPA-Apt- BSA1 BSA2 BSA3 0,767 0,881 0,475 0,752 0,05 1,15 1,25 0,81 0,705 0,1 2,54 2,46 2,16 1,04 0,15 11 6,3 5,37 2,31 0,20 15,5 6,63 6,23 5,17 0,25 9,39 1,92 2,59 5,83 (V) Au - 55 - 0,30 2,2 0,704 3,38 0,35 1,46 1,29 2,36 0,40 2,05 1,32 1,51 2,29 0,45 1,7 1,32 1,14 2,02 0,50 1,48 1,11 0,817 1,65 0,55 1,38 1,18 0,724 1,15 0,60 1,43 1,38 0,75 0,971 1 4 Hình 3.13 Thế vòng (CV- cyclic voltammetry) sóng vuông (square wave voltammetry - SWV) điện cực Au Au-MPA-Apt-BSA: (1).Điện cực Au; (2) Điện cực Au-MPA-Aptamer ủ BSA sau 20 phút; (3) Điện cực Au-MPA-Aptamer ủ với BSA sau 40 phút ; (4) Điện cực Au-MPA–apt ủ với BSA sau 60 phút Các thuộc tính bề mặt điện cực Au bước biến đổi đặc trưng tín hiệu điện hóa Kết đo quét vòng (CV) sóng vuông (SWV) dung dịch điện li ( 5mM K4Fe(CN)6 + mM K3Fe(CN)6 + 0,1 M KCl) với chế độ điện hóa U1=- 0,3V; U2=0,9V; v= 0,2V/s, vòng , độ nhạy (sensibility) = Tín hiệu điện hóa điện cực Au ban đầu cho ta thấy rõ oxi hóa khử K3Fe(CN)6 303 mV 209 mV (ΔEp = 94 mV, -Ipc =13,544 µA; Ipa =17,9 µA), hiệu đỉnh peak oxi hóa khử điện cực Au sau ngâm với dung dịch MPA, Aptamer HER-NH2 BSA tăng đáng kể, kết hình - 56 - thành liên kết Au-MPA, MPA-Aptamer liên kết ngăn chặn phản ứng oxi hóa khử K3Fe (CN)6 (Su et al., 2010) Sau điện cực vàng Biosensor gắn với Aptamer (Aptasensor) ủ với dung dịch PBS chứa nồng độ kháng nguyên HER2 hiệu điện đỉnh peak oxy hóa khử tiếp tục tăng, điều cho biết Aptasensor Au-MPA-Aptamer nhận biết gắn kết với kháng nguyên HER2 Liên kết đặc hiệu Aptamer kháng nguyên HER2 bước biến đổi góp phần ngăn chặn trình dịch chuyển electron môi trường chứa Fe (CN)63- bề mặt điện cực vàng Kết thể Hình 3.14 Bảng 3.8 Hình 3.14 Thế vòng (CV) điện cực Au bước sửa đổi (1) Điện cực Au; (2) Điện cực Au-MPA; (3) Điện cực Au-MPA-Apt; (4) Điện cực Au-MPA-Aptamer BSA; (5,6) Điện cực Au-MPA-Apt– BSA ủ với kháng nguyên HER2 Bảng 3.8 Kết xác định dòng điện cực sau bước biến đổi Trạng thái biến đổi điện cực Epa Epc ΔEp Ipa -Ipc Au 303 209 94 17,9 13,544 Au-MPA 284,8 184,8 100 16,3 12,1 Au-MPA 287,8 184,6 103,2 15,9 11,98 Au-MPA 290,8 184,8 106 16,01 11,7 Au-MPA-Apt 299,9 151,5 148,4 10,8 11,37 - 57 - Au-MPA-Apt 303 148,4 154,6 10,68 10,6 Au-MPA-Apt 324,2 166,2 158 10,3 9,528 Au-MPA-Apt-BSA 333,3 130,3 203 9,887 9,012 Au-MPA-Apt-BSA 372,7 118,1 254,6 8,93 8,298 Au-MPA-Apt-BSA 369,6 81,78 287,82 7,298 6,146 Au-MPA-Apt-BSA-HER2 (C1) 509 118,2 390,8 5,006 4,3 Au-MPA-Apt-BSA-HER2 (C2) 612 187,9 424,1 3,516 2,486 Au-MPA-Apt-BSA-HER2 (C3) 496,7 66,69 430,21 3,829 3,289 Khi xác định theo chế độ đo sóng vuông, đồ thị biểu diễn liên quan cường độ dòng hiệu điện điện cực vàng (điện cực hoạt động) sau bước biến đổi thể Hình 3.15 Hình 3.15 Đồ thị liên quan dòng đôi với điện cực có bề mặt biến đổi khác xác định theo kỹ thuật quét sóng vuông (SWV) điện cực vàng bước biến đổi (1).Điện cực Au; (2) Điện cực Au-MPA; (3) Điện cực Au-MPA-Apt; (4) Điện cực Au-MPA-Apt-BSA; (5) Điện cực Au-MPA-Apt–BSA ủ với HER2 Như vậy, điện cực vàng (điện cực hoạt động) chế tạo (biến đổi bề mặt) theo quy trình đề tài xây dựng cho thấy biến đổi dòng phù hợp với bước biến - 58 - đổi bề mặt so với điện cực vàng có bề mặt không biến đổi Hơn nữa, sau tạo đơn lớp mỏng bề mặt điện cực thay đổi dòng lớn nhất, sau bước biến đổi bề mặt có biến đổi dòng không nhiều, phân biệt rõ ràng đồ thị số liệu nhận Kết cho phép tiếp tục sử dụng điện cực biến đổi bước sau để xác định nồng độ HER2 mẫu phân tích 3.2.5 Định lượng kháng nguyên HER2 mẫu phân tích Định lượng HER2 mẫu phân tích tiến hành sau: Pha kháng nguyên HER2 (kháng nguyên HER2 tách tinh từ protein màng tế bào BT474 tế bào ung thư vú biểu mạnh HER2) với nồng độ 0,35 ng/mL; 3,5 ng/mL 35 ng/mL Kết xác định dòng kỹ thuật quét vòng sóng vuông mẫu có nồng độ kháng nguyên HER2 biết trước (nhằm mục đích xây dựng đường chuẩn) trình bày hình 3.16 bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết xác định dòng điện cực ủ với dung dịch HER2 Current (µA) Potential (V) Au Au- Au-MPA-Apt- Au-MPA-Apt- Au-MPA-Apt- MPA- BSA ủ với 0,35 BSA ủ với 3,5 BSA ủ với 35 Apt-BSA ng/ml HER2 ng/ml HER2 ng/ml HER2 0,767 0,936 0,449 0,48 0,307 0,05 1,15 1,05 0,524 0,628 0,355 0,1 2,54 1,35 0,733 0,774 0,505 0,15 11 2,1 1,41 1,39 0,877 0,20 15,5 3,01 2,12 1,92 1,29 0,25 9,39 3,24 2,65 2,28 1,65 0,30 2,2 3,22 2,89 2,61 1,98 0,35 1,46 3,06 2,86 2,71 2,29 - 59 - 0,40 2,05 2,62 2,59 2,67 2,12 0,45 1,7 2,1 2,27 2,39 1,69 0,50 1,48 1,66 1,81 2,07 1,76 0,55 1,38 1,34 1,36 1,44 1,59 0,60 1,43 1,12 1,1 1,21 1,24 Kết xác định đường hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan độ lớn dòng oxy hóa nồng độ kháng nguyên HER2 y = 2,9514 -0,0285x với hệ số tương quan r = -0,91587 Hệ số tương quan cho thấy hai đại lượng có tương quan mạnh khoảng nồng độ HER2 từ đến 50 ng/mL tương quan hai biến tương quan nghịch Ngưỡng xác định Biosensor ng/ml 1 5 Hình 3.16 Thế vòng (CV) sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au Au-MPA-AptBSA ủ với nồng độ kháng nguyên HER2 khác nhau: (1).Điện cực Au; (2) Điện cực Au-MPA-Apt-BSA ủ với dung dịch 0,35ng/ml HER2; (3) Điện cực Au-MPA-aptBSA ủ với dung dịch 3,5 ng/ml HER2; (4, 5) Điện cực Au-MPA–apt-BSA ủ với 35 ng/ml HER2 Như vậy: Biosensor điện hóa sử dụng Aptamer đặc hiệu HER2 ung thư vú gắn cộng hóa trị lên bề mặt điện cực thông qua lớp polymer mỏng chế tạo thành công Ngưỡng xác định Biosensor với kháng nguyên HER2 ng/ml - 60 - THẢO LUẬN Liu cộng (2012) sử dụng peptide NCTHSCVDLDDKGCPAEQR, đoạn ngoại bào kháng nguyên HER2 làm đích sàng lọc Aptamer Các tác giả thu Aptamer có khả gắn kết với HER2 gồm 86 nucleotide: 5’-AACCGCCCAA ATCCCTAAGA GTCTGCACTT GTCATTTTGT ATATGTATTT GGTTTTTGGC TCTCACAGAC ACACTACACA CGCACA-3’ Cấu trúc bậc Aptamer kiểm tra phần mềm mfold với lượng tự thấp ΔG = -0.90 kcal/mol Ái lực liên kết Aptamer có giá trị Kd = 18,9 nM với peptide sử dụng làmg đích sàng lọc lực gắn kết với giá trị Kd = 316 nM tới vùng ngoại bào HER2 Trong đó, Aptamer mà nhận với vòng sàng lọc dương tính tế bào BT474 vòng sàng lọc âm tính dòng tế bào MDAMB-231 gồm 88 nucleotide (bao gồm vùng bảo thủ, vùng gắn kết primer trình sàng lọc): 5’-AACCGCCCAA ATCCCTAAGA GTCGCAGCGG TGTGGGGGCA GCGGTGTGGG GGCAGCGGTG TGGGGCACAG ACACACTACA CACGCACA-3’ Khi phân tích cấu trúc bậc phần mềm mfold nhận cấu trúc đặc trưng Aptamer với lượng tự ΔG = 12.25 kcal/mol Theo chúng tôi, vùng ngẫu nhiên (40 nucleotide) vùng khác Aptamer thư viện ban đầu thư viện sử dụng để sàng lọc tế bào ung thư vú BT474 biểu mạnh HER2, đoạn nucleotide có khả nhận biết gắn kết đặc hiệu với HER2 tế bào BT474 phải nằm vùng ngẫu nhiên Do vậy, loại bỏ nucleotide vùng bảo thủ Aptamer bao gồm nucleotide thuộc vùng nhẫu nhiên sử dụng cho nghiên cứu tạo KIT tạo phức hệ dẫn thuốc Aptamer có trình tự nucleotide sau: 5’-GCAGCGGTGT GGGGGCAGCG GTGTGGGGGC AGCGGTGTGG GG-3’ Khi phân tích cấu hình không gian bậc Aptamer phần mềm mfold nhận - 61 - dạng cấu trúc với lượng tự thấp (ΔG = -5.63 kcal/mol) Ái lực liên kết Aptamer xác định với giá trị Kd = 100 nM Shu cộng (2013) chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên ung thư (Shu, 2013), phức hệ Aptamer kháng nguyên carcinoembryonic antigen (CEA) tạo đánh giá thông qua giá trị tổng trở EIS giá trị đo xung vi phân với việc sử dụng cặp chất dò oxy hóa khử [Fe(CN)6]-3/[Fe(CN)6]-4 Theo nguyên lý điện hóa mà tác giả khác sử dụng để định lượng protein, chế tạo Biosensor điện hóa sử dụng điện cực dạng ống, điện cực dạng chip (screen-printed electrode) để định lượng kháng nguyên HER2 Kết cho thấy Biosensor sử dụng điện cực dạng ống thiết bị CPA IoP HH5 xác định mối tương quan tuyến tính độ lớn dòng oxy hóa nồng độ HER2 y=2,9514 -0,0285x, hệ số tương quan r=-0,91587 Hệ số tương quan cho thấy hai đại lượng có tương quan mạnh khoảng nồng độ HER2 từ đến 50 ng/mL tương quan tương quan nghịch Ngưỡng xác định Biosensor ng/mL - 62 - CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã sàng lọc Aptamer Cả Aptamer thu nhận có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 kiểm tra Dot Blot, kiểm tra nhận biết tế bào BT474 biểu mạnh HER2; Sử dụng Aptamer số đặc hiệu HER2 chế tạo Biosensor điện hóa xác định HER2 với ngưỡng xác định Biosensor ng/ml KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện thử nghiệm Biosensor điện hóa xác định kháng nguyên HER2 mẫu bệnh phẩm để đánh giá tính khả dụng Biosensor thực tiễn lâm sàng - 63 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Chấn Hùng (2010) Hội thảo “Những tiến điều trị ung thư vú với hóa xạ trị” Tiếng Anh Baugh, C., D Grate, C.Wilson (2000), “2.8 angstrom crystal structure of the malachite green Aptamer.”, J Mol Biol 301 : 117–128 (9) Ciesiolka J, Gorski J & Yarus M (1995) Selection of an RNA domain that binds 2+ Zn RNA, 1, 538–550 David JH & Szostak JW (2002), “Isolation of high – affinity GTP Aptamer from partially structured ARN libraries.”, Proc Nalt Acad Sci USA 99, 1161611621 (16) Dieckmann T., E Fujikawa, X Xhao, J Szostak, J Feigon (1995), “Structural Investigations of ARN ADN ADN Aptamers in Solution”, JouARNl of Cellular Biochemistry : 56–56 (18) Dhillon N, Wolff R A, Abbruzzese J L, Hong D S, Camachi L H, and Li L (2006) Phase II clinical trial of curcumin in patients with advanced pancreatic cancer J Clin Oncol 24 14151 Drolet DW, Moon–McDermott L, & Romig TS, (1996) An enzyme–linked oligonucleotide assay Nat Biotechnol 14:1021–1025 Duconge F & Toulme JJ (1999) In vitro selection identifies key determinants for loop–loop interactions: RNA Aptamers selective for the TAR RNA element of HIV–1 RNA, 5, 1605–1614 - 64 - Ellington AD, Szostak JW, (1990): In vitro selection of ARN molecules that bind specific ligands Nature, 346:818-822 10 Ellington AD & Szostak JW (1992), “Selection In vitro of single – strand ADN molecules that fold into specific ligand – binding structures.”, Nature, 355, 850852 (22) 11 Famulok M (1999) Oligonucleotide Aptamers that recognize small molecules Curr Opin Struct Biol 9, 324–329 12 Farooq, S; Coleman, MP (2005) Breast cancer survival in South Asian women in England and Wales JouARNl of epidemiology ADN community health 59 (5) pp 402-406 ISSN 0143-005X 13 GEDDES M, FRANCESCHI S, BALZI D, ARNIANI S, GAFA L AND ZANETTI R ON BEHALF OF AIRT (1995) Birthplace AND classic Kaposi's sarcoma in Italy J Natl Cancer Inst., 87, 1015- 1017 14 Guerrier–Takada C & Altman S (1984) Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro Science, 223, 285–286 15 Green LS, Jellinek D, Jenison R, Ostman A, Heldin CH & Janjic N (1996) Inhibitory DNA ligANDs to platelet–derived growth factor B–chain Biochemistry, 35, 14413–14424 2+ 16 Hofmann HP, Limmer S, Hornung V, Sprinzl M (1997) Ni –binding RNA motifs with an asymmetric purine–rich internal loop and a G–A base pair RNA, 3, 1289–1300 17 Ikebukuro K, Kiyohara C, & Sode K, (2005) Novel electrochemical sensor system for protein using the Aptamers in sandwich manner Biosens Bioelectron 20:2168–2172 - 65 - 18 Lee ES, Oh KT, Kim D, Youn YS, Bae YH (2007) Tumor pH-responsive flower-like micelles of poly(Llactic acid)-b-poly (ethylene glycol)-b-poly(Lhistidine) JouARNl of Controlled Release;123(1): 19–26 19 Lin M, Cho M, Choe WS, Son Y, Lee Y, (2009) Electrochemical detection of copper ion using a modified copolythiophene electrode Electrochimica Acta 54:7012–7017 20 Liu M., T.Kagahara, H.Abe, Y.Ito (2009), “Direct In Vitro Selection of HeminBinding ADN Aptamer with Peroxidase Activity”, Bulletin of the Chemical Society of Japan 82 : 99–104 (45) 21 Liu Z, Duan JH, Song YM, Ma J, Wang FD, Lu X, Yang XD, (2012) Novel HER2 Aptamer Selectively Delivers Cytotoxic Drug to HER2-positive Breast Cancer Cells in Vitro JouARNl of Translational Medicine 10:148 doi:10.1186/1479-5876-10-148 22 Long S., M Long, R White, B Sullenger (2008), “Crystal structure of an ARN Aptamer bound to thrombin” ARN 14 (2): 2504–2512 (46) 23 Moelans CB, deWeger RA, VanderWall E, vADNiest PJ, (2011) Current technologies for HER2 testing in breast cancer Crit.Rev.Oncol Hematol 80380–392 24 Pyle AM (1993) Ribozymes: a distinct class of metalloenzymes Science, 261, 709–714 25 Sassolas, A, Blum, L J, Leca, Bouvier B.D (2011): Immobilization Strategies to Develop Enzymatic Biosensors Biotechnology Advances, 30, 3:489-571 26 Shu H, Wen W, Xiong H, Zhang X, Wang S, (2013) Novel electrochemical Aptamer Biosensor based on gold nanoparticles signal amplification for the - 66 - detection of carcinoembryonic antigen Electrochemistry Communications 37: 15-19 27 Stoltenburg R, Reinemann C & Strehlitz B SELEX–A (r)evolutionary method to generate high–affinity nucleic acid ligands (2007) Biomolecular Engineering, 24, 381–403 28 Tan L-D, Xu Y-Y, Yu Y, Li X-Q, Chen Y, et al (2011) Serum HER2 Level Measured by Dot Blot: A Valid and Inexpensive Assay for Monitoring Breast Cancer Progression PLoS ONE 6(4): e18764 doi:10.1371/jouARNl.pone.0018764 29 Tombelli S, Minunni M, & Mascini M, (2005) Analytical applications of Aptamers Biosens Bioelectron 20:2424–2434 30 Toulme JJ, Darfeuille F, Kolb GL, Chabas S & Staedel C (2003) Modulating viral gene expression by Aptamers to RNA structures Biol Cell, 95, 229–238 31 Tuerk C, Gold L, (1990): Systematic evolution of ligands by exponential enrichment — ARN ligands to bacteriophage-T4 ADN-polymerase Science, 249:505-510 32 Venter DJ, Tuzi NL, Kumar S, Gullick WJ (1987) Overexpression of the cerbB-2 oncoprotein in human breast carcinomas: Immunohistological assessment correlates with gene amplification Lancet ii: 69-72 33 Willner I, & Zayats M, (2007) Electronic Aptamer-based sensors Angew Chem Int Ed Engl 46:6408–6418 34 Witton CJ, Reeves JR, Going JJ et al (2003) Expression of the HER1–4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer J Pathol 200:290–297 35 Zaug AJ & Cech TR (1986) The intervening sequence RNA of Tetrahymena is an enzyme Science, 231, 470–475 - 67 - Tài liệu Internet 36 http://www.aptagen.com/home.aspx - 68 - VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** ĐÀO MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU TẠO BIOSENSOR XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN HER2 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ QUANG HUẤN Hà Nội – 2014 ... văn: Nghiên cứu chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2 mẫu phân tích theo nguyên lý điện hóa Các nội dung nghiên cứu luận văn: Nghiên cứu sàng lọc Aptamer đặc hiệu kháng nguyên HER2 Ứng dụng... hóa (Biosensor điện hóa) cho phép xác định nhanh, xác hàm lượng HER2 máu dịch thể Vì vậy, tiến hành đề tài luận văn Nghiên cứu tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2 .Mục tiêu luận văn: Nghiên. .. HIỆN HER2 - 1.1.1 Ung thư vú - 1.1.2 HER2 - 1.1.2.1 Xác định biểu HER2 mức ADN - 1.1.2.2 Xác định biểu HER2 mức ARN - 1.1.2.3 Xác định