Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 310 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH AXIT HYDROXYCITRIC TRONG LÁ, VỎ QUẢ CỦA CÂY BỨA, ỨNG DỤNG TẠO MUỐI KALI HYDROXY CITRAT A STUDY ON THE EXTRACTION, SEPARATION AND DETERMINATION OF HYDROXYCITRIC ACID IN FRESH LEAVES AND DRIED RINDS OF THE FRUITS OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP. EX BENTH FOR MAKING POTASSIUM HYDROXYCITRATE SALT SVTH : NGUYỄN MINH HIỀN Lớp 04HH – Khoa Hóa – Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng GVHD: PGS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Khoa Hóa – Đại học Sư Phạm Đà Nẵng TÓM TẮT Sau khi chiết tách các axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô, kiểm tra mẫu chiết bằng phổ hồng ngoại IR, xác định HCA bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC), kết quả cho thấy chiết bằng dung môi nước cho lượng axit HCA là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, hàm lượng trong lá và vỏ quả bứa khô lần lượt là 2,663 và 15,221%, phần axit còn lại là lượng nhỏ axit citric. Bước đầu đã tạo được muối Kali hydroxy citrat. ABSTRACT After the extraction and separation of organic acids in fresh leaves and dried rinds of the fruits of Garcinia oblongifolia champ. ex benth, the examination of samples by infrared analysis, the determination of hydroxycitric acid (HCA) by high – performance liquid chromatography (HPLC), it is shown that the extraction with the use of water produces the highest amount of HCA, followed by aceton and methanol. By HPLC, the major organic acid found is hydroxycitric acid that constitutes 2.663% and 15.221% in the leaves and rinds of the fruits respectively, and citric acid makes up the minority. This provides the basic substance for making potassium hydroxycitrate salt. 1. MỞ ĐẦU Cây bứa là loại cây tương đối dễ trồng, cho năng suất cao và có mặt ở hầu hết trên các địa bàn Miền Trung, Tây Nguyên, Nam Bộ. Từ lâu, người Việt Nam ta đã dùng lá và quả bứa làm món ăn, vỏ bứa để trị một số bệnh ngoài da…Trên thế giới việc nghiên cứu cây bứa đã được chú trọng từ lâu, những nghiên cứu trong thời gian gần đây đã chứng minh tính hiệu quả của muối 60% canxi – kali của HCA được lấy từ Garcinia cambogia (trong các sản phẩm của HCA-SX hay Super CitriMax) trong việc khống chế cân nặng. Cho đến nay ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào mang tính cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng về các hợp chất hóa học có trong cây bứa. Với những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định axit hyđroxy citric trong lá, vỏ quả của cây bứa, ứng dụng tạo muối kali hidroxy citrat”. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu: Lá, vỏ quả của cây bứa (Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth.) tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang – TP. Đà Nẵng (hình 2.1). Hình 2.1: Cây, lá và vỏ quả bứa Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 311 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp trọng lượng Sử dụng chiết chưng ninh, chiết soxhlet để tách axit hydroxycitric Phương pháp chuẩn độ axit – bazơ để xác định tổng lượng axit Phương pháp xác định cấu trúc hóa học bằng phổ hồng ngoại IR. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) để định lượng các axit hữu cơ. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số đại lƣợng vật lí Dựa vào phương pháp trọng lượng có thể xác định được độ ẩm và hàm lượng tro trong lá, vỏ quả bứa như sau (bảng 3.1 và 3.2) Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả bứa Trong đó: m 0 : Khối lượng mẫu trước khi sấy m 1 : Khối lượng mẫu sau khi sấy m 2 : Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy W (%): độ ẩm của mẫu Nhận xét: Vậy độ ẩm trung bình trong lá là 70,90%; trong vỏ quả bứa là 84,34%. 3.1.2. Hàm lƣợng tro trong lá, vỏ quả bứa Bảng 3.2: Kết quả xác định hàm lượng tro trong lá, vỏ quả bứa sấy khô Trong đó: m 0 : Khối lượng cốc (g) m 1 : Khối lượng cốc và mẫu trước khi tro hóa (g) m 2 : Khối lượng mẫu m 3 : Khối lượng cốc và mẫu sau khi tro hóa Nhận xét: Hàm lượng tro trung bình trong lá bứa là 3,35%; trong vỏ quả khô là 1,5% 3.2. Chiết các axit hữu cơ Chiết Soxhlet: Cân khoảng 10g mẫu vỏ quả bứa dạng bột mịn chiết với 150ml axeton hay metanol ở 75 0 C trong vòng 8 tiếng. Lọc và cô đặc dịch chiết, sau đó xử lí bằng Mẫu STT mẫu m 0 m 1 m 2 W(%) Lá bứa 1 9,826 2,889 7,037 71,61 2 9,960 2,898 7,062 70,90 3 10,172 3,022 7,150 70,29 4 10,024 2,978 7,046 70,29 Vỏ quả bứa 1 10,601 1,676 8,925 84,19 2 10,596 1,646 8,950 84,47 3 10,593 1,646 8,947 84,46 4 9,865 1,613 8,252 83,65 Mẫu Stt mẫu m 0 m 1 m 2 m 3 Khối lƣợng tro (g) % tro Lá bứa 1 28,551 32,532 3,981 28,679 0,128 3,21 2 29,302 33,211 3,919 29,434 0,132 3,37 3 26,549 30,453 3,910 26,689 0,140 3,58 4 28,141 32,244 4,103 28,274 0,133 3,24 Vỏ quả bứa khô 1 30,924 34,356 3,432 30,978 0,054 1,57 2 26,946 30,662 3,676 27,003 0,057 1,55 3 26,897 31,071 4,174 26,958 0,061 1,46 4 28,564 32,550 3,986 28,620 0,056 1,40 Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 312 than hoạt tính để tẩy màu. Lọc bằng phễu buchne, dịch chiết được trộn chung và cô đặc còn lại 50ml, lưu giữ mẫu ở 4 0 C. Chƣng ninh trong nồi áp suất: Cân khoảng 10g mẫu lá hoặc vỏ quả tươi đã cắt nhỏ với 150ml nước cất trong nồi áp suất ở nhiệt độ 127 0 C, áp suất 0,15Mpa trong thời gian 1 giờ. Lọc bằng vải muslin và phần xác tiến hành chiết lần nữa cho đến khi dịch lọc không còn vị chua, kiểm tra bằng giấy pH cho môi trường trung tính. Xử lí bằng than hoạt tính, lọc bằng phếu buchne. Tiếp tục xử lí với 100ml cồn để kết tủa hết pectin. Ly tâm lọc kết tủa, cô đặc dịch nổi đến 50 ml, lưu giữ mẫu ở 4 0 C. 3.3. Kiểm tra mẫu chiết bằng phổ hồng ngoại (IR) Nhận xét: Kết quả chụp phổ IR (xem hình 3.1 và 3.2) cho thấy xuất hiện pic có bước sóng 1620 và 1750cm -1 , đó là phổ của nhóm C=O trong nhóm –COOH), có thể kết luận trong mẫu chiết từ nước của lá, vỏ quả bứa có sự tồn tại của các axit hữu cơ. 3.4. Xác định HCA trong mẫu chiết bằng sắc kí lỏng cao áp Axit HCA lại có khuynh hướng bị lacton hóa trong suốt quá trình gia nhiệt. Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit khác một cách riêng biệt mà không cần phải sấy, hóa hơi dịch chiết. 3.4.1. Xây dựng đƣờng chuẩn Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate Chuẩn bị HCA tự do và dung dịch chuẩn axit citric: Cho 50mg chất chuẩn hòa với 5ml nước, xử lí với 500 mg Dowes 50[H + ]. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm. Dung dịch chuẩn axit citric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ thay đổi từ 2 đến 30ppm. Kết quả xây dựng đường chuẩn được thể hiện qua hình 3.3 và 3.4. Hình 3.1: Phổ IR mẫu vỏ quả bứa chiết trong nước Hình 3.2: Phổ IR mẫu lá bứa chiết trong nước 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 Absorbance 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1) 3400 1750 1620 3450 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 Absorbance 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1) Hình 3.3: Đường chuẩn HCA Hình 3.4: Đường chuẩn axit citric Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 313 3.4.2. Kết quả xác định HCA trong lá, vỏ quả bứa Điều kiện sắc kí để xác định (-)-HCA và axit citric trên máy sắc kí lỏng cao áp Knauer, lắp cột sắc kí C18: 250mm x 4,6ID x 5μm. Quá trình dò được thực hiện bởi đetectơ UV: bước sóng 210nm. Pha động gồm (A) metanol và (B) là axit photphoric 0,01M với tốc độ dòng 1,5ml/m, B:A theo tỉ lệ 9:1. Nhận xét: Thời gian lưu của HCA và axit citric được tìm thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065; 5,609 ± 0,010 phút (hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9). Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA. Pic thứ yếu được xác định là axit citric. Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phƣơng pháp sắc kí lởng cao áp đƣợc tính bằng công thức sau: Công thức tính HCA: %HCA = (1,37*S – 6,88)*V đm *K pl /m*10000 Công thức tính axit citric: %AC = (2,55*S – 5,43)*V đm *K pl /m*10000 Trong đó: S : Diện tích pic sắc kí V cđ : Thể tích mẫu cô đặc (ml) K pl : Hệ số pha loãng m : Trọng lượng mẫu thử (g) Kết quả xác định HCA và axit citric trong lá, vỏ quả bứa bằng phương pháp HPLC được thể hiện ở bảng 3.3. Hình 3.5: Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit xitric chuẩn Hình 3.6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong metanol Hình 3.8: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong axeton Hình 3.7: Sắc kí đồ mẫu quả bứa khô chiết trong nước Hình 3.9: Sắc kí đồ mẫu lá bứa chiết trong nước Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 314 0 5 10 15 20 30 60 90 120 Tồng lƣợng axit TB (g/100g) Thời gian chiết (phút) Đồ thị thể hiện ảnh hƣởng của thời gian chiết vào tống lƣợng axit chiết đƣợc 0 5 10 15 20 50 100 150 200 250 300 Tồng lƣợng axit TB Thể tích nƣớc Đồ thị thể hiện ảnh hƣởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến tống lƣợng axit chiết đƣợc Bảng 3.3: Kết quả xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC Nhận xét: Khi dùng dung môi nước với phương pháp chưng ninh thu được hàm lượng HCA là cao nhất (15,2%), tiếp đến là axeton cuối cùng là metanol. 3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến tổng lƣợng axit hữu cơ trong phƣơng pháp chƣng ninh bằng nồi áp suất 3.5.1. Khảo sát thời gian chiết tối ƣu Cân khoảng 10g mẫu vỏ quả bứa khô chưng ninh trong nồi áp suất với 200ml nước tiến hành trong các khoảng thời gian: 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 phút. Nhận xét: Tổng lượng axit chiết được là lớn nhất ứng với thời gian chiết là 90 phút, về sau lượng axit thu được thay đổi không đáng kể. 3.5.2. Khảo sát tỉ lệ rắn/ lỏng tối ƣu Để tìm ra điều kiện chưng ninh tốt nhất, ta cố định thời gian chiết là 90 phút và thay đổi tỉ lệ dung môi chiết, cụ thể là nước lần lượt là: 50, 100, 150, 200, 250, 300 ml. Nhận xét: Tỉ lệ rắn – lỏng tối ưu là 10g/200ml nước. 3.6. Tạo muối Kali hydroxyl citrat Dựa vào kết quả khá khả quan về lượng HCA thu được bằng phương pháp chưng ninh, trên cơ sở đó xây dựng quy trình tạo muối kali hydroxyl citrat. Dịch chiết sau khi cô đặc được xử lí bằng dung dịch KOH 40%. Chất lỏng sánh như dầu lắng xuống dưới đáy phểu chiết Mẫu Dung môi chiết Stt mẫu m (g) Am V cđ K pl HCA (%) Axit xitric (%) HCA Axit xitric Lá bứa Nước 1 10,359 91,422 0 100 25 2,857 0 2 10,328 91,821 0 100 25 2,878 0 3 10,093 89,091 0 100 25 2,853 0 Vỏ quả bứa khô Axeton 1 10,087 198,414 4,188 50 100 13,133 0,260 2 10,199 199,457 4,042 50 100 13,059 0,239 3 10,086 193,552 3,854 50 100 12,804 0,218 Vỏ quả bứa Nước 1 10,513 238,573 5,602 50 100 15,218 0,421 2 10,086 229,983 5,358 50 100 15,278 0,408 3 10,000 226,488 5,187 50 100 15,170 0,390 Vỏ quả bứa khô Metanol 1 10,199 147,534 2,840 100 50 9,572 0,089 2 9,949 141,736 2,651 100 50 9,413 0,067 3 10,188 146,887 2,750 100 50 9,538 0,078 Hình 3.10: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của tổng lượng axit vào thời gian chiết Hình 3.11: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của tổng lượng axit vào thể tích nước Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 315 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000.0 0.3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18.2 cm-1 EGY MUOI KALI CUA AXIT HIDROXI CITRIC 3391.41,0.39 2941.46,7.29 1759.49,3.02 1622.62,0.29 1415.85,1.42 1330.93,5.59 1282.26,6.21 1268.96,6.20 1225.13,5.05 1181.95,9.98 1139.45,6.00 1049.20,2.14 được tách ra, xử lí bằng cồn tuyệt đối, cho phép lưu giữ qua đêm. Sau đó sấy ở nhiệt độ 90 0 C, trong vòng 48 giờ. Khối lượng muối tạo thành được thể hiện qua bảng 3.4. Bảng 3.4: Khối lượng muối tạo thành Nhận xét: Hiệu suất tạo muối ước đạt 80% - 82% Kiểm tra sản phẩm bằng phổ hồng ngoại IR KẾT LUẬN: Độ ẩm trung bình trong lá bứa là 70,90%, độ ẩm trung bình trong vỏ quả bứa là 84,34%. Hàm lượng tro trung bình trong lá là 3,35%, hàm lượng tro trung bình trong vỏ quả khô là rất thấp 1,49%. Nước là dung môi chiết tốt nhất. Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA, được thể hiện trên sắc kí đồ. Pic thứ yếu được xác định là pic của axit citric. Riêng đối với mẫu lá bứa chiết trong nước không xuất hiện pic của axit citric. So sánh với các kết quả của các tác giả nước ngoài thì hàm lượng axit HCA trong vỏ quả bứa là khá cao (15,17-15,21%).Với có những kết quả bước đầu trong việc tạo muối Kali của axit hidroxy citric đề tài sẽ tiếp tục khai thác theo hướng ứng dụng của HCA trong sản xuất dược liệu hoặc thực phẩm giảm cân – cụ thể là tạo muối kali và canxi. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc (2002), Cơ sở Hoá Học Phân Tích, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [2] S. Jena, Jayaprakasha, Kunnumpurath, Sakariah (2002), "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa", Journal of Agricultural and Food chemistry, 50(12), 3431-3434. [3] Lewis, Y. S.; Neelakantan, S. (1965), “(-)-Hydroxycitric acid – The principal acid in the fruits of Garcinia cambogia”, Phytochemistry, 4, 619-625. Mẫu Khối lượng mẫu Khối lượng muối tạo thành 1 50,019g 9,551g 2 49,901g 9,124g 3 50,134g 9,301g Nhận xét: Kết quả chụp phổ IR cho thấy xuất hiện pic có bước sóng 3391cm -1 , ứng với phổ dao động của nhóm –OH và có pic ứng với bước sóng 1622cm -1 ứng với nhóm C=O trong nhóm – COOH, nhưng có sự lệch tương đối do có nhóm –COOH đã chuyển thành nhóm –COOK. Hình3.12: Phổ IR của sản phẩm muối tạo thành . Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 310 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH AXIT HYDROXYCITRIC TRONG LÁ, VỎ QUẢ CỦA CÂY BỨA, ỨNG DỤNG TẠO MUỐI KALI HYDROXY CITRAT. năng ứng dụng về các hợp chất hóa học có trong cây bứa. Với những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: Nghiên cứu chiết tách, xác định axit hyđroxy citric trong lá, vỏ quả của cây bứa,. ẩm trung bình trong lá là 70,90%; trong vỏ quả bứa là 84,34%. 3.1.2. Hàm lƣợng tro trong lá, vỏ quả bứa Bảng 3.2: Kết quả xác định hàm lượng tro trong lá, vỏ quả bứa sấy khô Trong đó: m 0 :