Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học dịch chiết chloroform và butanol của hoa đu đủ đực thu hái tại quảng nam – đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT CHLOROFORM VÀ BUTANOL HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (Carica papaya L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN CỬ NHÂN HOÁ HỌC Sinh viên thực : NGÔ THỊ THANH Ý Lớp : 14CHD Giảng viên hướng dẫn : Th.S ĐỖ THỊ THÚY VÂN Đà nẵng - năm 2018 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Đu đủ 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Đu đủ nước gần 1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Đu đủ ngồi nước gần 1.4 Những nghiên cứu hoạt tính sinh học Đu đủ .7 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 10 2.2.1 Phương pháp xác định các tiêu hóa lý 10 2.2.2 Phương pháp khảo sát các điều kiện chiết tách các hợp chất hữu từ hoa Đu đủ đực dung môi Chloroform Butanol 12 2.2.3 Định tính số lớp chất hoa đu đủ đực 14 2.3 Định danh thành phần hóa học dịch chiết Chloroform Butanol……17 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD 2.4 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn Chloroform từ số dịch chiết hoa Đu đủ đực 18 2.4.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư 18 2.4.2 Các dòng tế bào 18 2.4.3 Phương pháp 18 2.4.4 Thử độc tế bào 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết xác định tiêu hóa lý hoa Đu đủ đực 20 3.3.1 Độ ẩm hàm lượng tro 20 3.3.2 Hàm lượng kim loại nặng 20 3.2 Kết khảo sát điều kiện chiết tách hợp chất hữu từ hoa Đu đủ đực dung môi Chloroform Butanol 21 3.2.1 Kết khảo sát các điều kiện chiết tách các hợp chất hữu phương pháp chiết ngâm dầm 21 3.2.2 Kết khảo sát thời gian chiết tách các hợp chất hữu phương pháp chiết Soxhlet 26 3.2.3 Kết khảo sát các điều kiện chiết tách các hợp chất hữu phương pháp chiết siêu âm 28 3.3 Kết định tính nhóm hợp chất có hoa Đu đủ đực 32 3.4 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết Chloroform Butanol 34 3.4.1 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết Chloroform 34 3.4.2 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết Butanol .40 3.5 Kết thử hoạt tính gây độc từ phân đoạn Chloroform dịch chiết tổng 44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Kết luận 46 Kiến nghị 47 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD TÀI LIÊỤ THAM KHẢO 45 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cảm ơn đến cô giáo Th.S Đỗ Thị Thúy Vân giúp đỡ hướng dẫn em nhiệt tình suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Hóa, đặc biệt thầy cơng tác phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm – đại học Đà Nẵng tạo điều kiện thuận lợi trình nghiên cứu thực đề tài Trong trình thực hiện, bước đầu làm quen với việc nghiên cứu nên khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận góp ý thầy để luận văn hồn thiện Đà Nẵng, ngày 12 tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Ngô Thị Thanh Ý GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng bảng 3.1 Kết khảo sát độ ẩm hàm lượng tro 3.2 Kết khảo sát hàm lượng kim loại hoa 3.3 Kết định tính nhóm hợp chất chí 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 Kết khảo sát thời gian chiết Soxhlet t Butanol Kết khảo sát thời gian chiết ngâm dầ Butanol Kết khảo sát tỉ lệ chiết Rắn/Lỏng (R/ Butanol Kết khảo sát thời gian chiết siêu âm t Butanol Kết khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm t Butanol 3.9 Kết thành phần hóa học dịch chi 3.10 Kết thành phần hóa học dịch chi 3.11 Hoạt tính độc tế bào phân đoạn dịch đực GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu hình 1.1 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Luận văn tốt nghiệp Số hiệu hình 3.11 12 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân HC H3 C H3C Trang: 41 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD 1,43 16,2 73 16,26 n- Hexadecanoic acid; C16H32O2 9,12- Octadecanoic acid; C18H32O2 9-Octadecenoic acid- (Z); C18H34O2 Hexa decanoic acid butyl este (CAS); C20H40O2 HC H3C Ethyl linoleate; C20H36O2 H3C H3C CH3 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 42 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD 14 15 Hình 3.12 Sắc ký đồ GC dịch chiết hoa Đu đủ đực dung môi Butanol Nhận xét: Qua bảng 3.10 thấy, phương pháp GC – MS so sánh với thư viện chuẩn định danh 15 chất có dịch chiết hoa Đu đủ đực.Thành phần hóa học chủ yếu có dịch chiết hoa đu đủ đực acid hữu cơ, phytosterol Trong đó: Các cấu tử có hàm lượng ≥ 5% bao gồm: Butanoid acid (24,98%), nHexadecanoic acid (16,26%), -Sitosterol (14,33%), 9,12- Octadecanoic acid (11,36%), Ethyl linoleate (5,89%),… Các cấu tử có hàm lượng ≤ 5% bao gồm Hexa decanoic acid butyl este (CAS) (4,57%), 2,3- Đimethylbenzaldehyde (4,16%), 9-Octadecenoic acid- (Z) (3,5%), Stigmasterol (3,03%),… GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 43 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD Các hợp chất có hoạt tính sinh học cao đáng quan tâm Butanoid acid, Sitosterol , Stigmasterol, n-Hexadecanoic acid , 9,12-Octadecadienoic acid:  -Sitosterol , Stigmasterol phytosterol có phổ hoạt tính rộng nên sử dụng để làm thuốc kháng viêm, có tác dụng chống oxi hóa, tác nhân kháng nấm, tăng sức đề kháng cho thể  Butanoid acid acid có khả kháng khuẩn, cải thiện đường ruột dày, có tác dụng lợi tiều, nhuận tràng,…  n-Hexadecanoic acid , 9,12-Octadecadienoic acid có vai trò quan trọng việc tăng cường trí não, bảo vệ tim mạch, ngồi có tác dụng giảm sưng đau bệnh viêm khớp,vảy nến,… 3.5 Kết thử hoạt tính gây độc từ phân đoạn Chloroform dịch chiết tổng Kết hoạt tính độc tế bào từ phân đoạn Chloroform dịch chiết tổng trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Hoạt tính độc tế bào từ phân đoạn Chloroform dịch chiết tổng Mẫu Control E/C N/C M/C Camptothecin GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Luận văn tốt nghiệp Mẫu Kýhiêu: ̣ E/C: phân đoaṇ cao chiết Chloroform từ cao tổng Ethanol N/C: phân đoaṇ cao chiết Chloroform từ cao tổng nước M/C: phân đoaṇ cao chiết Chloroform từ cao tổng Methanol Nhận xét: Dựa vào bảng 3.11 ta thấy, phân đoạn Chloroform từ dịch chiết tổng thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ thử nghiệm: - Phân đoạn E/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư gan với phần trăm tế bào sống sót 49.91± 2.22 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn N/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư phổi tế bào ung thư vú với phần trăm tế bào sống sót 39.73 ± 0.33 48.03± 1.24 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn M/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư gan tế bào ung thư vú với phần trăm tế bào sống sót 35.76 ± 2.50; 46.81 ± 3.75 38.24 ± 1.60 nồng độ 100 µg/mL GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 45 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thực nghiệm đưa đến số kết sơ hoa Đu đủ đực: - Các tiêu hóa lý hoa Đu đủ đực: Độ ẩm trung bình 22,58%; hàm lượng -4 tro 15,95%; hàm lượng kim loai nặng gồm: Pb (Chì) 6,335.10 mg/kg, Cu (Đồng) 7,842 10 -4 mg/kg, Zn (Kẽm) 3,833.10 -3 mg/kg, Cd (Cadimi) 0,52042 mg/kg, Hg (Thủy ngân) 0,03806 mg/kg, As (Asen) 0,34090 mg/kg không vượt qua giới hạn cho phép nên an toàn cho sức khỏe người - Các nhóm hợp chất thiên nhiên có mẫu hoa Đu đủ đực là: Alkaloid, Flavonoid, Saponin steroid, đường khử, Polyphenol, Steroid, Coumarin, Polysaccarid, Carotene, chất béo - Các điều kiện ảnh hưởng đến kết chiết tách hợp chất hoa Đu đủ đực trong dung môi Chloroform Butanol: + Thời gian chiết tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết tối ưu dung môi phương pháp ngâm dầm ngày tỉ lệ R/L=1/20 + Thời gian chiết tối ưu dung môi phương pháp Soxhlet 8h + Thời gian chiết nhiệt độ chiết tối ưu dung môi phương pháp siêu âm lần lươt 90 phút 50 C - Định danh sơ thành phần hóa học cao Chloroform Butanol phương pháp phổ GC/MS có 27 cấu tử định danh chủ yếu : Sitosterol; Stigmasterol; Desmosterol; n-Hexadecanoic acid; 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z); L(+)Milchasaeure; 6,6 -Dimethyl-1-ethynyl-7-oxabicyclo[4.1.0]; heptan2-one; 8-Octadecenal; Butanoid acid; Ethyl linoleate; 9-Octadecenoic acid- (Z) Ngồi có cấu tử khác như: Campesterol, 2,3-pyrenedicarboxylic acid; Propanoic acid; 2-hydroxy butyl ester; 3,5,6-tri-O-acetyl-2-deoxy- / -D-glucofuranose; Benzotroponethyleneketal; Hexa decanoic acid butyl este (CAS); 2,3Đimethylbenzaldehyde; 4-(2-hydroxyethyl) morpholin-3-one; 4-(2’,2’-Dimethyl-6’methylidenecyclohexyl) butanal; 1-Iodo-2-methylundecane;; 1- Butyl - 1- isobutoxy GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 46 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD butane; 2,2,4,4 – Tetramethyl pentanenoid acid; L – proline – 1- acetyl – (CAS); Silicic acid, tetrabutyl ester; Tetradecanoic acid; Ethyl linoleate - Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết Chloroform hoa Đu đủ đực dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư gan (Hep 3B), ung thư vú (MCF-7) thể hoạt tính tốt Kiến nghị Tiếp tục định danh hợp chất hóa học hoa Đu đủ đực dung môi khác Nghiên cứu, khảo sát phương pháp chiết tách để tìm phương pháp tối ưu Thăm dò hoạt tính sinh học khác chất phân lập dịch chiết khác Phâp lập, tìm chất xác định cấu trúc chất phân lập từ phân đoạn lại dịch chiết Chloroform hoa Đu đủ đực GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 47 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD TÀI LIÊỤ THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827 [2] Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012) “Hai cycloratane triterpene lần phân lập từ Đu đủ (carica papaya L.)“, Tạp chí hóa họctập 50 (4A), pp 166169 [3] HồThi H ̣ à(2014), Nghiên cứu hoat tính sinh hocc môt sốhơpc chất chiết tách từ lá Đu đủ(Carica papaya Linn), Luận án tiến sĩ Đaịhoc ̣ Bách khoa Hànôị [4] Giang Thị Kim Liên Đỗ Thị Lệ Uyên (2015),“Khảo sát thành phần hoáhoc ̣ số dịch chiết từ hoa Đu đủđưc ̣ thu hái taịĐàNẵng“, Tạp chí Khoa học Công nghệ ĐHĐN; Số 03(88) ; Trang 119 [5] Đỗ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội,Trang 360-362 [6] Phạm Kim Mãn cộng (2001),“Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế u dùng điều trị ung thư“, Tạp chí dược liệu, 6(2+3), pp 58-62 [7] Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004),Cây Đu đủ kỹ thuật trồng, Nxb lao động xã hội [8] Đỗ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu xác định khả phòng chống ung thư chất hóa học số thuốc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học [9] Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật- Hà Nội Tiếng Anh [10] Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002) “Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines”,Journal of Medical Sciences, vol 2.Isuae 2.page 55-58 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 48 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD [11] Antonella Canini, Daniela Alesiani, Giuseppe D’Arcangelo, Pietro Tagliatesta (2007) “Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from carica papaya L leaf”,Journal of food composition and analysis, vol 20, pp 584-590 [12] Bamidele V, Owoyele, Olubori M, Adebukola, Adeoye A, Funmilayo and Ayodele O, Soladoye (2008) “Anti - inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leave”, Inflammopharmacology, 16 (2008), pp 168 – 173 [13] Moses Alo (2012) “New macrocyclic Δ1–piperideine alkaloids from papaya leaves: dehydrocarpaine I and II”,Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-652 [14] Gopalakrishnan M, Rajasekharasetty MR., (1978 ), “Effect of papaya(Carica papaya Linn) on pregnancy and estrous cycle in albino rats of Wistar strain”, Indian J Physiol Pharmacol, Jan-Mar;22(1):66-70 [15] Giordani R., Cardenas M.L., Moulin-Traffort J., Regli P., (1996), “Fungicidal activity of latex sap from Carica papaya and antifungal effect of D(+)glucosamine on Candida albicans growth”, Mycoses, 39, 103-110 [16] Krishna K.L., Paridhavi M and Jagruti A Patel (2018) “Review on nutritional, maducinal and pharmacological properties of papaya ( Caria papaya Linn.)”, Natural product radiance, vol 7(4), pp 364-373 [17] Kermanshai R, McCarry BE, Rosenfeld J, Summers PS, Weretilnyk EA, Sorger GJ (2001), “Benzyl isothiocyanate is the chief or sole anthelmintic in papaya seed extracts”,Phytochemistry, Jun; 57(3):427-35 [18] Lohiya NK, Kothari LK, Manivannan B, Mishra PK, Pathak N, (2000), “Human sperm immobilization effect of Carica papaya seed extracts: an in vitro study”,Asian J Androl Jun;2(2):103-9 [19] Maisarad A.M., Nurul Amira B., Asmah R and Faizial O (2013) “Antioxidant analysis of different parts of Carica papaya”, International Food Research Journal, 20 (3), pp 1043-1048 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 49 Luận văn tốt nghiệp [20] SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD Satrija F, Nansen P, Bjorn H, Bjorn H, Murtini S, He S, (1994), “Effect of papaya latex, against Ascaris suum in naturally infected pigs”, J Helminthol Dec; 68(4); 343-6 GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Trang: 50 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân SVTH: Ngô Thị Thanh Ý - 14CHD Trang: 51 ... , tơi định choṇ đềtài Nghiên cứu phương pháp chiết tách , xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học dịch chiết Chloroform Butanol của hoa Đu đu đưcc̣ thu hái taịQuảng Nam – ĐàNẵng”... định danh thành phần hóa học dịch chiết Chloroform Butanol 34 3.4.1 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết Chloroform 34 3.4.2 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết Butanol. .. tiêu nghiên cứu - Lựa chọn phương pháp chiết tách hiệu nhất, bước đầu khái quát thành phần hóa học hoa Đu đủ đực có dịch chiết Chloroform Butanol Thử hoạt tính gây độc tế bào hoa Đu đủ đực từ