Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh học dịch chiết n hexane và ethyl acetate hoa đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM MAI THỊ HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC CAR

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

MAI THỊ HOÀNG YẾN

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI

TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HOÁ HỌC

Đà Nẵng - Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

MAI THỊ HOÀNG YẾN

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI

TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS ĐỖ THỊ THÚY VÂN

Đà Nẵng - Năm 2018

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực

Mai Thị Hoàng Yến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC 5

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC 5

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ 5

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 6

1.5.1 Phương pháp MTT 6

1.5.2 Phương pháp SRB 7

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 8

2.1.1 Nguyên liệu 8

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 8

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.2.1 Xác định chỉ số vật lí 8

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 10

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 11

2.3 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 12

2.3.1 Alcaloid 12

2.3.2 Flavonoid 12

2.3.3 Coumarin 12

2.3.4 Saponin 13

2.3.5 Đường khử 13

2.3.6 Polyphenol 13

2.3.7 Steroid 13

2.3.8 Acid hữu cơ 14

2.3.10 Carotene 14

2.3.11 Polysaccharide 14

2.3.12 Iridoid 14

2.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE 15

2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư 15

2.5.2 Các dòng tế bào 15

2.5.4 Phương pháp thử độc tế bào 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 17 3.1.1 Độ ẩm 17

3.1.2 Hàm lượng tro 17

3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại 18

3.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 19

3.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm 19

3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết Soxhlet 23

3.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm 25

3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC30 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 32

3.4.1 Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết n-hexane hoa Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS 32

3.4.2 Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS 35

3.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu

3.3 Hàm lượng một số kim loại trong hoa Đu đủ đực 18

3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong

3.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong

3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung

3.7 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung

3.8 Kết quả khảo sát thời gian chiết Soxhlet tối ưu dung môi

3.9 Kết quả khảo sát thời gian chiết Soxhlet tối ưu bằng dung

3.10 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm bằng dung môi

ethyl acetate 3.14 Định tính các lớp chất trong hoa Đu đủ đực 31

3.15 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane trong hoa

3.1 Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo tỉ lệ

3.4 Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời

3.5 Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết n-hexane theo thời

3.6 Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo

3.7 Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết n-hexane theo nhiệt

3.8 Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo

3.9 Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo thời gian

3.10 Mối quan hệ giữa khối lượng cao n-hexane theo thời gian

3.11 Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexane hoa Đu đủ đực 32

hình

3.13 Phổ MS của 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) 35

3.15 Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ

3.18 Phổ MS của 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) 39

Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Đỗ Thị Thúy Vân người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình làm khoá luận

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Hóa Trường Đại học Sư Phạm

Đà Nẵng đã giảng dạy cho em kiến thức về các môn đại cương cũng như các môn chuyên ngành, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đã luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Một lần nữa xin gửi đến thầy cô, bạn bè cùng các cô chú, anh chị tại các doanh nghiệp lời cảm ơn chân thành và tốt đẹp nhất!

Đà Nẵng, 15 tháng 4 năm 2018

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta

Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi

có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C Sản lượng Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [9]

Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở khắp cả nước, trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [9] Cây Đu đủ = là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích chữa bệnh khác nhau

Quả Đu đủ là nguồn cung cấp nhiều loại enzyme khác nhau Papain, pepsin có trong quả xanh giúp tiêu hóa protein trong thức ăn ở môi trường acid, kiềm và trung tính Lipase, một enzyme hydrolase liên kết chặt chẽ với phần không tan trong nước của quả xanh, là một chất xúc tác sinh học cố định Folic acid trong quả Đu đủ là chất chuyển đổi homocysteine thành các acid amin như cysteine hoặc methionine Nếu không chuyển đổi, homocysteine có thể trực tiếp làm hỏng các thành mạch máu, dẫn đến nguy cơ đau tim hoặc đột quỵ Quả Đu đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột hoạt động bình thường [20]

Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán, Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [12, 13] Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [16] Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 2

dương, các loại nấm [1, 10] Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [12, 19]

Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7] Người dân nước Úc đã dùng lá

Đu đủ chữa trị bệnh ung thư [14] Ngoài ra, dịch chiết từ lá Đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u [15]

Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam-Đà Nẵng sử dụng hoa cây Đu đủ đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho, mất tiếng, khản tiếng,…; các bệnh về hệ bài tiết như đái rắt, đái buốt, đau niệu đạo,…; chữa sỏi thận; tác dụng kích thích tiêu hóa Ngoài ra, hoa Đu đủ đực còn được coi như thần dược để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, ưng thư vú và ung thư gan,…[8, 10]

Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về các bộ phận khác như rễ, thân và hoa của chúng

Việc sử dụng hoa Đu đủ đực hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian, nhiều người còn e ngại vì chưa có các cơ sở khoa học để chứng minh Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh học dịch chiết n-hexane và ethyl acetate hoa Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến các phương pháp chiết (ngâm, soxhlet, siêu âm), khảo sát thành phần hóa học vàn hoạt tính sinh học của hoa Đu đủ đực góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 3

- Hoa Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng

- Chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực bằng các dung môi khác nhau Từ các dịch chiết này, tiến hành khảo sát thành phần các hợp chất hoá học

- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của một số phân đoạn dịch chiết từ hoa Đu

đủ đực

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng

dụng của hoa Đu đủ đực

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;

- Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm;

- Các phương pháp định danh thành phần hóa học;

- Các phương pháp nghiên cứu xác định công thức cấu tạo hợp chất hóa học: Sắc

ký khí-khối phổ (GC-MS),

- Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học hoạt tính gây độc tế bào;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học

5 Bố cục của luận văn

Luận văn gồm 44 trang, 17 bảng, 18 hình ảnh, 20 tài liệu tham khảo

Với:

Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1 – Tổng quan (4 trang)

Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (9 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (24 trang)

Kết luận (1 trang)

Tài liệu tham khảo (3 trang)

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae) Nguồn gốc Châu Mỹ

được trồng khắp nơi ở nước ta Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [17] Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta có một chi và một loài [1]

Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4

mét, thân thẳng, không phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1] Cây Đu đủ còn được gọi Thù

đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành

3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây Đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1) Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [6]

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

Hình 1.1 Hình ảnh Đu đủ

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 5

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC

Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa Đu đủ đực Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [5]

Năm 2016, Trần Thanh Hải đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid từ phân đoạn ethyl acetatee trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn tỉnh Quảng Nam [4]

Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và sitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng [12]

β-1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC

Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố thành phần hóa học của hoa

Đu đủ ở Nigeria Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0,07%), alcaloid (0,05%), tannin (0,002%) và flavonoid (2,8%) Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca,

Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [11]

Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố kết quả trong

hoa Đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoid, steroid, flavonoid, tannin,

glycoside và saponin [14]

Tóm lại đã phân lập được Kaempferol, Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid

(Glucosinolate), β-sitosterol glucoside (Sterol) trong hoa Đu đủ đực Như vậy, thành

phần hóa học hoa Đu đủ đực đã được nghiên cứu Tuy nhiên các công trình nghiên cứu còn khá ít

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ

 Tác dụng chống ung thư

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 6

Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol của hoa Đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung thư

vú [14]

Năm 2017, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã công bố kết quả sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dịch chiết từ hoa Đu đủ đực thu hái ở Quảng Nam-Đà Nẵng Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết chloroform có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên 3 dòng ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B và ung thư

vú MCF-7 ở hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100 µg/mL

 Tác dụng chống oxy hóa

Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong

cơ thể, trong đó có ung thư Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh,

 Công dụng trong dân gian

Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ

em Ngoài ra hoa Đu đủ đực được dùng để chữa sỏi thận hiệu quả [6,11]

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A và cộng

sự [18] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia

(NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu tả

trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai phương

pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB

1.5.1 Phương pháp MTT

Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [9] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 7

hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

1.5.2 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường acid nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và

đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 8

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu hoa của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017 Hoa Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu

Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 2,0 m có nhiều lá và hoa Hoa Đu đủ đực nở theo chùm, màu trắng, hoa nở nhiều, còn nhiều nụ, không bị sâu Cuống hoa hình trụ, màu xanh lục, thân xốp

Bột hoa Đu đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm

Hình 2.1 Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dung môi chiết n-hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, ethanol và nước cất

Một số hóa chất khác cũng được sử dụng

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, tủ sấy, tủ nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc,…

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xác định chỉ số vật lí

 Độ ẩm

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 9

Tiến hành:

Chuẩn bị các cốc được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong tủ sấy đến khối lương không đổi m0 Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ

Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu hoa Đu đủ đực, cân lấy khối lượng chính xác m1

trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ 1000C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2

Cách tính độ ẩm:

Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu

Độ ẩm được tính theo công thức sau

Trong đó: m0: Khối lượng cốc sứ (g)

m1: Mẫu bột hoa Đu đủ đực (g)

m2: Cốc sứ chứa bột hoa đu đủ sau khi sấy (g) W: Độ ẩm của mẫu (%)

Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 10

Sau đó cho vào nung 2 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi

Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy, là hiệu

số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung

Cách tính kết quả:

Hàm lượng tro được tính bằng công thức:

Trong đó:

m0: Khối lượng cốc sứ

m1: Mẫu hoa Đu đủ đực sau khi sấy khô (g)

m2: Khối lượng của cốc sứ và hoa Đu đủ đực sau khi tro hóa (g) Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên

 Xác định hàm lượng kim loại

Mẫu hoa đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu bột hoa Đu đủ đực thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng Trong nghiên cứu này tiến hành 3 phương pháp chiết: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm

Chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu bột hoa Đu đủ đực trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc

thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả

Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, với thể tích dung môi n-hexane/ethyl acetate thay đổi

từ 100mL đến 300mL, ngâm trong thời gian 1 ngày Tiến hành chiết 5 mẫu với tỉ lệ Rắn/Lỏng khác nhau, lần lượt là 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 11

Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với tỉ lệ R/L = 1/20 gồm khoảng 10g bột hoa Đu đủ đực và 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 1, 2, 3, 4, 5 ngày Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân

Chiết Soxhlet:

Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng bộ Soxhlet Sử dụng phương pháp chiết Soxhlet với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng10g, 200mL dung môi n-hexane ở nhiệt độ 78oC (dung môi ethyl acetate ở nhiệt độ 87,1oC) Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 2, 4, 6, 8, 10 giờ Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân

Chiết siêu âm:

Khảo sát nhiệt độ: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm Sử dụng phương pháp chiết siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate trong 30’ Tiến hành chiết 5 mẫu với nhiệt độ khác nhau, lần lượt là 30, 40, 50,

60 và 700C Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân

Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm Sử dụng phương pháp chiết siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate ở 500C Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 30, 60, 90,

120 và 150 phút Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết được

thực hiện thông qua việc đo phổ GC-MS

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 12

2.3 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

2.3.1 Alcaloid

Cân 5g bột hoa Đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 95 độ : NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, môi trường phải có tính base Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn

Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử với 2 loại thuốc thử Mayer, Wagner

Sau khi thử dịch chiết với:

Thuốc thử Mayer: Xuất hiện kết tủa vàng, phản ứng dương tính

Thuốc thử Wagner: Xuất hiện kết tủa nâu, phản ứng dương tính

từ cam đến đỏ

Phản ứng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavone, isoflavone, isoflavanone, flavanone, chalcone, Leucoanthocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam aurone cho màu tím đến đỏ tím

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 13

2.3.4 Saponin

Cân 1g bột hoa Đu đủ đực, cho vào cốc và 5mL ethanol đun cách thủy 5 phút, lọc

lấy dung dịch để thử nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích thước bằng nhau

̵ Ống 1: 5mL HCl 0,1N (pH=1) + 3giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử

̵ Ống 2: 5mL NaOH 0,1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử

Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bọt bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:

Nếu cột bọt trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid

Nếu ống 2 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid

2.3.7 Steroid

Phản ứng Libermann-Burchard

Cho vào ống nghiệm 1mL acetic anhydride, 1mL chloroform làm lạnh ống nghiệm

và thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc, sau đó cho dịch lọc ngâm trong chloroform, nếu sung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu bền không đổi thì có sterol

Phản ứng Salkowski

Ngâm 2g bột hoa Đu đủ đực trong chloroform Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, phản ứng dương tính là dung dịch chuyển thành màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 14

2.3.8 Acid hữu cơ

Cân 3g hoa Đu đủ đực cho vào cốc, thêm 10 mL nước cất đem đun sôi 10 phút Để nguội, đem lọc lấy dịch Cho 2-3 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1 ít tinh thể

Na2CO3 Quan sát hiện tượng, nếu có bọt khí thoát ra có acid hữu cơ

Ống 1: 2 mL dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 2 mL nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 15

2.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HEXANE VÀ ETHYL ACETATE

N-Các phân đoạn n-hexane và ethyl acetate từ dung môi ethanol 80%, methanol, nước được xác định hoạt tính độc tế bào tại Phòng thử hoạt tính sinh học - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư

Lấy 3 mẫu, mỗi mẫu 100 g hoa Đu đủ đực khô, chiết với 3 dung môi khác nhau: ethanol 80%, methanol, nước

Chiết bằng ethanol 80% và methanol: tiến hành chiết hồi lưu cách thủy (hoặc Soxhlet), gia nhiệt 40-50o chiết 3-4 lần, lấy kiệt

Chiết bằng nước: Ngâm chiết kiệt mẫu bằng đun sôi nhẹ

Cô đuổi dung môi được 3 cặn dịch chiết Ba cặn chiết được phân bố vào nước và chiết phân đoạn lần lượt với n-hexane, chloroform, ethyl acetate ta được phân đoạn dịch chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate và lớp nước còn lại, cô đuổi dung môi ta được các cặn phân đoạn dịch chiết Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi lựa chọn các cặn phân đoạn dịch chiết chiết n-hexane và ethyl acetate (E/Et: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng ethanol 80%, N/E: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng nước, M/E: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng methanol, M/H: Phân đoạn cao chiết n-hexane từ cao tổng methanol) để thử tác dụng ức chế tế bào ung thư trên các dòng: Dòng tế bào ung thư phổi, dòng tế bào ung thư gan, dòng tế bào ung thư

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 16

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RMPI 1640 hoặc DMEM

có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), 100 U/mL penicillin, và 100 µg/mL streptomycin ở 37 ºC trong tủ ấm 5% CO2

Các tế bào được cấy chuyển vào trong phiến 96 giếng (mật độ tế bào 1×105 tế bào/giếng) với và được xử lý với các nồng độ khác nhau của mẫu thử

Sau 48h ủ, thêm 20 μL 3-(4,5- dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL) vào các giếng và ủ tiếp 4h

Sau đó gạn bỏ môi trường và hòa tan tinh thể formazan trong 100 μL isopropanol

và giá trị mật độ quang (OD) được đo bằng máy đọc Elisa (xMark Pro, Biorad, USA)

ở bước sóng 570 nm

SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

Nhận xét: Độ ẩm trung bình của hoa Đu đủ đực khoảng 22,58% Độ ẩm của

nguyên liệu bột hoa Đu đủ khá cao, cẩn thận trong bảo quản, phòng ẩm mốc

3.1.2 Hàm lượng tro

Kết quả hàm lượng tro của hoa Đu đủ đực được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Hàm lượng tro hoa Đu đủ đực