Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh học dịch chiết n hexane và ethyl acetate hoa đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM MAI THỊ HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN CỬ NHÂN HOÁ HỌC Đà Nẵng - Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM MAI THỊ HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG Chuyên ngành : Hóa hữu LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS ĐỖ THỊ THÚY VÂN Đà Nẵng - Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực Tác giả luận văn Mai Thị Hoàng Yến MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC 1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO .6 1.5.1 Phương pháp MTT 1.5.2 Phương pháp SRB CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .8 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu .8 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xác định số vật lí .8 2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 10 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 11 2.3 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC .12 2.3.1 Alcaloid 12 2.3.2 Flavonoid 12 2.3.3 Coumarin 12 2.3.4 Saponin 13 2.3.5 Đường khử 13 2.3.6 Polyphenol 13 2.3.7 Steroid 13 2.3.8 Acid hữu 14 2.3.9 Chất béo 14 2.3.10 Carotene 14 2.3.11 Polysaccharide 14 2.3.12 Iridoid .14 2.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NHEXANE VÀ ETHYL ACETATE 15 2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư 15 2.5.2 Các dòng tế bào 15 2.5.4 Phương pháp thử độc tế bào .15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HĨA LÍ CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 17 3.1.1 Độ ẩm .17 3.1.2 Hàm lượng tro 17 3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại 18 3.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HĨA HỌC TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 19 3.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm 19 3.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết Soxhlet .23 3.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm .25 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC30 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 32 3.4.1 Kết khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết n-hexane hoa Đu đủ đực phương pháp GC-MS .32 3.4.2 Kết khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực phương pháp GC-MS 35 3.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên 3.1 Độ 3.2 Hàm 3.3 Hàm 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Kết dun Kết dun Kết môi Kết môi Kết bằn Kết môi Kết hexa Kết ethy 3.12 Kết n-he 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Kết ethy Địn Thà Đu Thà hoa Hoạ e DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu hình 1.1 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 Hoa Mối Rắn/L Mối Rắn/L Mối Mối Mối Mối thời g Mối Mố Mối Mối 3.11 Sắc k SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân 10 11 16-Pregnen12 42,55 55 12,58 3,20-dione; C21H30O2 9,10-Dideutero 13 44,43 57 5,32 octadecanal; C18H34D2O Từ bảng 3.15 cho thấy, cấu tử định danh với hàm lượng lớn bao gồm: – Sitosterol (29,96%); 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) (15,21%); n-Hexadecanoic acid (12,71%) Hình ảnh phổ MS cấu tử chiếm tỉ lệ phần trăm diện tích peak lớn trình bày hình từ 3.12 đến 3.14 SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp Hình 3.12 Phổ MS GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân – Sitosterol Hình 3.13 Phổ MS 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) Hình 3.14 Phổ MS n-Hexadecanoic acid 3.4.2 Kết khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực phương pháp GC-MS Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực trình bày hình 3.15 SVTH: Mai Thị Hồng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân Hình 3.15 Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực Kết phân tích sắc kí đồ GC-MS so sánh với thư viện chuẩn cho thấy có 10 cấu tử định danh Thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực trình bày qua bảng 3.16 Bảng 3.16 Thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa Đu đủ đực Peak TR 10,02 12,55 16,08 SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 41,65 55 34,83 -Sitosterol; C29H50O SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 10 Từ bảng 3.16 cho thấy, cấu tử định danh với hàm lượng lớn bao gồm: – Sitosterol (34,83%); n-Hexadecanoic acid (15,53%); 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) (14,33%) Hình ảnh phổ MS cấu tử chiếm tỉ lệ phần trăm diện tích peak lớn trình bày hình từ 3.16 đến 3.18 Hình 3.16 Phổ MS – Sitosterol Hình 3.17 Phổ MS n-Hexadecanoic acid SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân Hình 3.18 Phổ MS 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) Hoạt tính sinh học chất có hàm lượng cao dịch chiết n-hexane ethyl acetate: – Sitosterol: Là loại phytosterol có ích việc ức chế ung thư phổi, dày, buồng trứng ung thư vú, cholesterol, giảm nồng độ cholesterol máu giảm nguy bệnh tim mạch n-Hexadecanoic acid: Là loại acid béo no, giá trị sinh học thấp acid béo khơng no, có vai trò lơn cấu tạo màng tế bào, hỗ trợ phát triển xương 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z): Là acid béo khơng no, có chức điều hòa thành mạch máu Khi kết hợp với cholesterol tạo ester động, giảm nguy xơ vữa động mạch, tạo điều kiện chuyển hóa cholesterol xuất khỏi thể, có tác dụng chống oxi hóa cao 3.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NHEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC Kết hoạt tính độc tế bào cao chiết n-hexane ethyl acetate trình bày bảng 3.17 Bảng 3.17 Hoạt tính độc tế bào phân đoạn dịch chiết n-hexane ethyl acetat Mẫu Control SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp N/E E/E(T) M/E M/H Camptothecin Ký hiệu: M/E: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng methanol N/E: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng nước E/E(T): Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng ethanol M/H: Phân đoạn cao chiết n-hexane từ cao tổng methanol Kết luận: Tất phân đoạn n-hexane ethyl acetate có hoạt tính sinh học kiềm hãm tế bào ung thư Trong có phân đoạn cao chiết n-hexane từ cao tổng methanol hoa Đu đủ có hoạt tính sinh học tốt kìm hãm tế bào ung thư phổi Cụ thể: Phân đoạn cao chiết n-hexane từ cao tổng methanol có tác dụng mạnh tế bào ung thư phổi (A549) với tỉ lệ phẩn trăm tế bào sống sót 29,69% SVTH: Mai Thị Hồng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.KẾT LUẬN - Đã định tính sơ lớp chất thường gặp thực vật phản ứng hóa học cho kết quả: Mẫu hoa Đu đủ đực dùng nghiên cứu có lớp chất là: alcaloid, flavonoid, saponin steroid, đường khử, polyphenol, sterol, coumarin, polysaccharide, carotene, chất béo - Đã thử hoạt độc tế bào phân đoạn n-hexane ethyl acetate dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư gan (Hep 3B), ung thư vú (MCF-7), kết cho thấy phân đoạn n-hexane thể hoạt tính tốt, cụ thể phân đoạn cao chiết nhexane từ cao tổng methanol có tác dụng mạnh tế bào ung thư phổi (A549) - Đã định danh sơ thành phần hóa học cao n-hexane phương pháp phổ GC/MS có 13 cấu tử định danh với hàm lượng lớn bao gồm: – Sitosterol (29,96%); 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) (15,21%); n-Hexadecanoic acid (12,71%) - Đã định danh sơ thành phần hóa học cao ethyl acetate phương pháp phổ GC-MS có 10 cấu tử định danh với hàm lượng lớn bao gồm: – Sitosterol (34,83%); n-Hexadecanoic acid (15,53%); 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) (14,33%) 2.KIẾN NGHỊ - Phâp lập xác định cấu trúc chất phân lập từ phân đoạn n- hexan ethyl acetate dịch chiết hoa Đu đủ đực - Thăm dò hoạt tính sinh học chất phân lập dịch chiết hợp chất phân lập khác SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội [3] Nguyễn Văn Đàm, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, Nxb Y học, Hà Nội [4] Trần Thanh Hải (2016) Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học hoa Đu đủ đực, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Học viện Quân Y, Bộ Quốc phòng [5] học Giang Thị Kim Liên Đỗ Thị Lệ Uyên (2015), “Khảo sát thành phần hoá số dịch chiết từ hoa đu đủ đực thu hái Đà Nẵng”, Tạp chí Khoa học Công nghệ ĐHĐN, Số 03 (88), tr 119 [6] Đỗ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [7] Phạm Kim Mãn cộng (2001), “Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế u dùng điều trị ung thư”, Tạp chí dược liệu, (2+3), tr 58-62 [8] Lê Thị Thanh Phương (2017) Nghiên cứu phân lập số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết Chloroform hoa Đu đủ đực thu hái Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận văn Thạc sĩ Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng [9] Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004), Cây đu đủ kỹ thuật trồng, Nxb Lao động Xã hội, Hà Nội Tiếng Anh [10] Adeolu Alex, Adedapo and Vivian Eguonor, Orherhe (2013), “Antinociceptive and anti-inflammatory studies of the aqueous leaf extract of Carica papaya in laboratory animals” Asian J.EXP.BIOL.SCI, Vol 4(1), pp 89-96 SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân [11] Stephen Chinwendu, Ukpabi Emmanuel O., Chukwu Henry C., Ezikpe Chizaram (2015), Chemical Composition Of Carica Papaya Flower (Paw-Paw), International Journal of Scientific Research and Engineering Studies (IJSRES), Volume 2, Issue [12] Ayoola G.A., Coker H.A.B., Adesegun S.A., Adepoju-Bello A.A., Obaweya K., Ezennia E.C., Atangbayila T.O (2008), “Phytochemical screening and antioxidant activities of some selected medicinal plants used for malaria therapy in southwestern Nigeria”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7(3), pp 1019-1024 [13] Srikanth G.S., Manohar Babu S., Kavitha CH.N., Bhanoji Rao M.E., Vijaykumar N., Pradeep CH (2010), “Studies on in - vitro antioxidant activities of Carica papaya aqueous leaf extract”, Research journal of pharmaceutical, Biological and Chemical sciences, Vol 1, pp 59-65 [14] Marline Nainggolan and Kasmirul (2015), “Cytotoxicity activity of male Carica papaya L flowers on MCF-7 breast cancer cells” Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 7(5), pp 772-775 [15] T Oduola, T.O Idowu, I.S Bello, F.A Adeniyi, E.O Ogunyemi (2012), “Heamatological respone to intake of unpripe Carica papaya fruit extract and the isolation and characterization of Caricapinoside: A new antisickling agent from the extract”, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, Vol 5(3), pp 77-81 [16] Noriko Otsuki, Nam H Dang, Emi Kumagai, Akira Kondo, Satoshi Iwata, Chikao Morimoto (2010), “Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti tumor activity and immunomodulatory effects”, Journal of Ethnopharmacology, 127, pp 760 - 767 [17].Giordani R., Cardenas M.L., Moulin-Traffort J., Regli P., (1996), “Fungicidal activity of latex sap from Carica papaya and antifungal effect of D(+)-glucosamine on Candida albicans growth” Mycoses, 39, pp 103-110 [18] Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002), “Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines”, Journal of Medical Sciences, Vol 2, Issue 2, pp 55-58 SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD Luận văn tốt nghiệp GVHD:ThS Đỗ Thị Thúy Vân [19] Ashok Kumar U., Manjunath C., Thaminzhmani T., Ravi Kiran Y., Brahmaiah Y (2012), “A review on immunomodulatory activity plants”, Indian Journal of Novel Drug delivery, 4(2), pp 93-103 [20] Abrham W.B., (1978), Techniques of Animal and Clinical toxicology, Med Pub, Chicago SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD ...ĐẠI HỌC ĐÀ N NG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM MAI THỊ HOÀNG Y N NGHI N CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PH N HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N- HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA. .. (Carica papaya L. ) thu hái Quảng Nam- Đà N ng” Mục tiêu nghi n cứu Xác định yếu tố ảnh hưởng đ n phương pháp chiết (ngâm, soxhlet, siêu âm), khảo sát thành ph n hóa học v n hoạt tính sinh học hoa Đu. .. Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid (Glucosinolate), β-sitosterol glucoside (Sterol) hoa Đu đủ đực Như vậy, thành ph n hóa học hoa Đu đủ đực nghi n cứu Tuy nhi n cơng trình nghi n cứu 1.4 NHỮNG NGHI N CỨU