Bài giảng học phần công nghệ sinh học thực vật

7/11/2017 BÀI GIẢNG HỌC PHẦN CNSH THỰC VẬT TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BIÊN SOẠN: TS PHẠM THỊ MINH THU THÁNG 1/2017 CHỦ ĐỀ 1: VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT 7/11/2017 CÔNG NGHỆ SINH HỌC (BIOTECHNOLOGY) Karl Erky 1917 "Tất công việc sản phẩm sản xuất từ nguyên liệu thô với giúp đỡ vật chất sống“ Định nghĩa chung Công nghệ sinh học trình sản xuất quy mô công nghiệp có tham gia tác nhân sinh học (ở mức độ thể, tế bào tế bào) dựa thành tựu tổng hợp nhiều môn khoa học, phục vụ cho việc tăng cải vật chất xã hội bảo vệ lợi ích người Nghị định số 18/CP Chính phủ ngày 11/3/1994 “Công nghệ sinh học tập hợp ngành khoa học (sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học công nghệ học) nhằm tạo công nghệ khai thác quy mô công nghiệp hoạt động sống vi sinh vật, tế bào thực vật động vật.” 7/11/2017 PHÂN LOẠI THEO ĐỐI TƯỢNG PHỤC VỤ - CNSH nông nghiệp - CNSH y tế - CNSH môi trường - CNSH lượng - CNSH vật liệu - CNSH chế biến thực phẩm - CNSH hóa học PHÂN LOẠI THEO TÁC NHÂN SINH HỌC • Công nghệ sinh học động vật • Công nghệ sinh học thực vật • Công nghệ sinh học vi sinh vật • Công nghệ sinh học enzym • Công nghệ sinh học gen • Công nghệ sinh học protein 7/11/2017 MỤC ĐÍCH - Chọn, tạo giống - Nhân giống - Bảo quản, trì giống tốt NỘI DUNG - Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Di truyền phân tử CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Vai trò CNSHTV từ đến năm 2020 Vấn đề an toàn lương thực • CNSH góp phần tăng suất trồng, đảm bảo chất lượng để tăng an toàn lương thực cho người • CNSH tạo giống kháng virus, vi khuẩn, nấm gây bệnh Vấn đề phủ xanh đất trống, đồi trọc • CNSH nhân nhanh giống rừng có giá trị cao • CN gen tạo giống kháng sâu bệnh 7/11/2017 CHỦ ĐỀ NCMTB THỰC VẬT – GIỚI THIỆU CHUNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT (NCMTBTV) Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant cell and tissue culture) phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô, tế bào thực vật gọi nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm) Nuôi cấy điều kiện tự nhiên ống nghiệm, gọi nuôi cấy in vivo 7/11/2017 NCMTBTV-ỨNG DỤNG - Nhân nhanh vô tính giống quý: lưu ý biến dị qua trình cấy chuyền - Cải thiện giống trồng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristerm) - Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn nuôi cấy tế bào hạt phấn - Khắc phục lai xa cách thụ phấn ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi - Lai vô tính gọi dung nạp tế bào trần (Protoplast) - Tạo giống trồng kĩ thuật chuyển gen Ngoài ra, mô tế bào nuôi cấy in vitro nguyên liệu sử dụng nghiên cứu khác chuyển gen biểu gen tạm thời; kiểm tra phản ứng sinh lý, sinh hóa qui mô tế bào hay mô/cơ quan… NCMTBTV-ỨNG DỤNG TOMATO + POTATO = ? 7/11/2017 DUNG HỢP TB TRẦN (Melchers et al., 1978) GHÉP CÂY (Thompson and Morgan, 2013) NCMTBTV-CƠ SỞ KHOA HỌC Thuyết tế bào (1838, Matthias Schleiden Theodore Schwann ) + Mọi thể sống cấu tạo nhiều tế bào + Tế bào đơn vị cấu trúc chức thể sống, hình thức nhỏ sống + Tế bào tạo từ tế bào tồn trước Tính toàn (totipotency) Khả biệt hóa thành loại tế bào từ tế bào ban đầu 7/11/2017 NCMTBTV-CƠ SỞ KHOA HỌC Tính toàn (totipotency) - Miller Skoog (1953) tạo rễ từ mảnh mô cắt từ thân thuốc - Reinert Steward (1958) tạo phôi cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy dung dịch - Cocking (1960) tách tế bào trần Takebe (1971) tái sinh hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần thuốc - Tế bào soma, điều kiện thích hợp, phân hóa để phát triển thành thể thực vật hoàn chỉnh Phân hóa phản phân hóa (Cell differentiation and dedifferentiation) NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN khởi xướng 1898 nghiên cứu phát sinh nghiên cứu sinh lý hình thái 1930 1950 triển khai NCM vào CNSHTV 1960 Giai đoạn khởi xướng (1898-1930) - Haberlandt (1898-1902): đề xướng tính toàn tế bào - Kotte Robbins (1924): thành công việc nuôi cấy đầu rễ 12 ngày - Schnucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931-1933), Larue (1933): nuôi cấy thành công đoạn rễ riêng rẽ môi trường nhân tạo Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950) Xây dựng, vận dụng có kết môi trường nửa nhân tạo, đồng thởi phát vai trò số vitamin đảm bảo thành công nuôi cấy quan (rễ) mô (thượng tầng) thực vật - 1934, White nuôi cấy dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh liên tục - 1934, Gautherets thành công nuôi cấy mô thượng tầng môi trường Knop bổ sung glucose cysteinhypochloride - 1983, White nuôi cấu mô thượng tầng thuốc lai 7/11/2017 NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 -1960) Đại diện cho giai đoạn Miller, Skoog Reinert - 1956, Miller Skoog tạo chồi thành công từ mô thuốc nuôi cấy - 1955, Skoog phát kinetin chất điều khiển trình phân bào (thuộc nhóm Cytokinin) phân hóa chồi mầm - 1958- 1959, Steward Reinert sử dụng nước dừa vào nuôi cấy tế bào cà rốt thu phôi - 1960, Bergmann tạo khối mô sẹo từ tế bào đơn kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật đĩa thạch trải tế bào vi sinh vật Kinetin (N6-furfuryladenine) NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào Công nghệ sinh học thực vật - 1959 Melchers sử dụng mô đơn bội Antrirrinum majus nghiên cứu tính biến động mức bội thể nuôi cấy gây đột biến - 1960 Cooking tách tế bào trần (protoplast) từ trở nuôi cấy tế bào tách rời có bước phát triển đáng khích lệ - 1964 Guha Mahefwari tạo vây cà độc dược có NST đơn bội từ nuôi cấy bao phấn - 1967 Nitsch, 1968 Nakata Tanaka tạo đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở triển vọng ứng dụng đơn bội vào công tác giống nghiên cứu di truyền - 1968 Niieki nuôi cấy thành công bao phấn tạo đơn bội lúa - 1971 Takebe tái sinh thuốc hoàn chỉnh từ protoplast - 1977 Melchers lai soma thành công cà chua khoai tây - 1985 thuốc mang gen biến nạp công bố - 1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp đưa vào sản xuất đại trà Nauy Ở Mĩ, có hàng tram giống mang gen biến nạp đạ sản xuất hàng loạt thị trường chấp nhận 7/11/2017 NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN PHÂN LOẠI THEO NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT - Nuôi cấy phôi - Nuôi cấy mô quan tách rời - Nuôi cấy mô phân sinh - Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, noãn - Nuôi cấy tế bào đơn - Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) PHÂN LOẠI THEO HÌNH THÁI PHÁT SINH - Nuôi cấy mô sẹo - Nuôi cấy tạo phôi - Nuôi cấy phát sinh chồi 10 7/11/2017 CHỌN LỌC CÁC THỂ LAI SOMA – DỰA TRÊN NST Thành công loài thuộc họ cà (Solanaceae) số họ khác Thành công họ hòa thảo (Poaceae) hạn chế TỒN TẠI CỦA KỸ THUẬT PROTOPLAST Phân lập Journal of Cell Science 2001 114: 2009-2014 Điều kiện nuôi cấy Nat Biotech 33, 1162–1164 (2015) Sự phân hoá www-ijpb.versailles.inra.fr Sự phân bào Front Plant Sci., 26 August 2015 http://dx.doi.org/10.3389/fpls.2015.00658 95 7/11/2017 ỨNG DỤNG CỦA NC TB TRẦN - Dumg hợp protoplast - Chuyển gen - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu - Tách chiết bào quan CHỦ ĐỀ CHUYỂN GEN TRÊN THỰC VẬT BẬC CAO 96 7/11/2017 BỘ GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO - Gen tính trạng 97 7/11/2017 BỘ GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO - Gen tính trạng Tính trạng đa gen BỘ GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO - Gen tính trạng Trội không hoàn toàn 98 7/11/2017 BỘ GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO - Gen tính trạng BỘ GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO 99 7/11/2017 TIỀN ĐỀ CỦA CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT BẬC CAO MỘT SỐ NGUYÊN TẮC SINH HỌC CƠ BẢN - Không phải toàn tế bào thể tính toàn - Các khác có phản ứng không giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào gen Một số tế bào tạo điều kiện phú hợp trở nên có khả năng, số khác hoàn toàn khả biến nạp tái sinh - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập DNA ngoại lai - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các DNA (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, DNA virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) 100 7/11/2017 Một số kiểu tế bào có khả tiếp nhận biến nạp cao CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA QUI TRÌNH CHUYỂN GEN 101 7/11/2017 Những lƣu ý thiết kế vector chuyển gen vào thực vật Khung vector: Ti plasmid tobacco mosaic virus (TMV) potato virus X cowpea mosaic virus 102 7/11/2017 Promoter: - Mạnh, biểu thường trực kich thích (vd: Cauliflower mosaic virus CaMV35S) - Có thể tách từ gen đối tượng chuyển gen (promoter nội sinh) (Thu et al., 2013) Expression pattern of genes during dehydration Leaf and root and 0h (L0 and R0, respectively) were used as non-drought control samples Drought-treated plants (O sativa japonica cul Nakdong) were air dried from 30 to 2, 6, and 12 h ubi was used as constitutive marker Gene đánh dấu (Marker genes): - Gene chọn lọc (selectable marker gene): phân biệt thể chuyển gen không chuyển gen - Gen sàng lọc (screenable marker gene) hay gen thị (reporter gene): gen chuyển biểu hay chưa? A Một số gen thị chọn lọc Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để chọn lọc npt II Neomycin phosphotransferase Kanamycin hyg Hygromycin phosphotransferase Hygromycin gent Gentamycin acetyl transferase Gentamycin aat Streptomycin phosphotransferase Streptomycin bleo Enzyme kháng bleomycin Bleomycin bar Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinothricin bxn Bromoxynil nitrilase Bromoxynil 103 7/11/2017 Gen thị (reporter gene): B Một số gen sàng lọc/ gen thị Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để phát gus A β-glucuronidase X-Gluc lacZ β-galactosidase X-Gal luc Luciferase đom đóm Lumis Phos lux Luciferase vi khuẩn Lumi Phos cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu nos Nopaline synthase Nopaline Gen thị (reporter gene): - Dùng nghiên cứu biểu gen theo không gian thời gian - nhóm: xác định vị trí khu trú protein tế bào (cellular localization) vị trí biểu gen (expression pattern/specificity) - Gen cần phải dễ dàng biểu hiện, xác định đo đạc - Gen mã hóa cho enzyme phản ứng mà sản phẩm tạo có màu sắc phát ánh sáng, sản phẩm gen đánh dấu protein phát sáng promoter Gen quan tâm Gen thị Promoter quan tâm Gen thị termi nator termi nator Vd: P35S::X-GFP Vd: PX::GUS 104 7/11/2017 P35S::SINE1-GFP Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) An Arabidopsis root tip expresses GFP-tagged SINE1 (green), one of many new outer nuclear membrane KASH proteins that Zhou et al identify in plants The plant cell walls are labeled with propidium iodide (red) Image © 2014 Zhou et al Luciferase assay HICp::GUS Nature 408, 713-716 105 7/11/2017 Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào + Súng bắn gen: micro-particle bombardment, micro-projectile bombardment, particle gun transformation, gene gun transformation, biolistics + Agitation (lắc): huyền phù tế bào rong + micro-/ macro-particles (vd hạt silicon carbide (SiC) whiskers (dày ~0.3-0.6 μm dài ~5-15 μm), polyethylene glycol DNA + Chuyển gen vào protoplast PEG + Electroporation: protoplast tế bào đột biến có vách tế bào mỏng + Chuyển gen nhờ Agrobacterium thông qua plasmid Ti (tumor inducing): số rong bị nhiễm Agrobacterium không tạo khối u Ti plasmid 106 7/11/2017 Sự hợp DNA ngoại lai vào gen thực vật Trao đổi trình tự tương đồng/ Homogenous recombination Tái tổ hợp không tương đồng/ Illegitimate recombination 107 7/11/2017 Mục đích chuyển gen NHỮNG TỒN TẠI Kỹ thuật - Gen chuyển không biểu  chọn lọc lại với số lượng lớn - Sở thích sử dụng codon (bias in codon usage) loài khác  tìm gen thay thay codon - Intron gây khó khăn cho biểu gen  sử dụng cDNA Tuy nhiên gen intron thường biểu thấp sử dụng intron tương đồng - Heterologous flanking sequence (trình tự nền) cần phải có nguồn gốc nội sinh giúp cho nhận diện máy di truyền tế bào đích thuận lợi - Hiệu suất chuyển gen thấp, thất bại việc tích hợp DNA vào gen, không vận chuyển đích 108 7/11/2017 AN TOÀN SINH HỌC CỦA CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN VÀ SỰ CHẤP NHẬN CỦA CÔNG CHÚNG 109 ... THEO TÁC NHÂN SINH HỌC • Công nghệ sinh học động vật • Công nghệ sinh học thực vật • Công nghệ sinh học vi sinh vật • Công nghệ sinh học enzym • Công nghệ sinh học gen • Công nghệ sinh học protein... Công nghệ sinh học tập hợp ngành khoa học (sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học công nghệ học) nhằm tạo công nghệ khai thác quy mô công nghiệp hoạt động sống vi sinh vật, ...7/11/2017 CÔNG NGHỆ SINH HỌC (BIOTECHNOLOGY) Karl Erky 1917 "Tất công việc sản phẩm sản xuất từ nguyên liệu thô với giúp đỡ vật chất sống“ Định nghĩa chung Công nghệ sinh học trình sản xuất quy mô công