Bài giảng học phần công nghệ sinh học thực vật

Định nghĩa chung Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia của các tác nhân sinh học ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào dựa trên các thành t

BÀI GIẢNG HỌC PHẦN CNSH THỰC VẬT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BIÊN SOẠN: TS PHẠM THỊ MINH THU

THÁNG 1/2017

CHỦ ĐỀ 1:

VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG

CỦA CNSH THỰC VẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC (BIOTECHNOLOGY)

Karl Erky

1917

"Tất cả những công việc trong đó các sản phẩm

được sản xuất ra từ các nguyên liệu thô với sự giúp đỡ của các vật chất sống“

Định nghĩa chung

Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia

của các tác nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các

thành tựu tổng hợp của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật

chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người

Nghị định số 18/CP của Chính phủ ngày 11/3/1994

“Công nghệ sinh học là một tập hợp các ngành khoa học (sinh học phân tử, di

truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học và công nghệ học) nhằm tạo ra các công

nghệ khai thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào

thực vật và động vật.”

PHÂN LOẠI THEO TÁC NHÂN SINH HỌC

• Công nghệ sinh học động vật

• Công nghệ sinh học thực vật

• Công nghệ sinh học vi sinh vật

PHÂN LOẠI THEO ĐỐI TƯỢNG PHỤC VỤ

- Chọn, tạo giống

- Nhân giống

- Bảo quản, duy trì giống tốt

- Nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Di truyền phân tử

MỤC ĐÍCH

NỘI DUNG

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

Vai trò của CNSHTV từ nay đến năm 2020

1 Vấn đề an toàn lương thực

• CNSH góp phần tăng năng suất cây trồng, đảm bảo chất lượng để tăng

an toàn lương thực cho con người

• CNSH tạo các giống mới kháng virus, vi khuẩn, nấm gây bệnh

2 Vấn đề phủ xanh đất trống, đồi trọc

• CNSH nhân nhanh giống cây rừng có giá trị cao

• CN gen tạo các giống kháng sâu bệnh

CHỦ ĐỀ 2

NCMTB THỰC VẬT – GIỚI THIỆU CHUNG

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant cell and tissue culture) là phạm trù khái niệm chung cho

tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường

dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm)

Nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cấy in vivo

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT (NCMTBTV)

- Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: lưu ý biến dị qua quá trình cấy chuyền

- Cải thiện giống cây trồng bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristerm)

- Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy tế bào hạt phấn

- Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi

- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast)

- Tạo giống cây trồng mới bằng kĩ thuật chuyển gen

Ngoài ra, mô và tế bào nuôi cấy in vitro còn là nguyên liệu sử dụng trong các nghiên

cứu khác như chuyển gen và biểu hiện gen tạm thời; kiểm tra các phản ứng sinh lý,

sinh hóa trên qui mô tế bào hay mô/cơ quan…

NCMTBTV-ỨNG DỤNG

NCMTBTV-ỨNG DỤNG

TOMATO + POTATO = ?

(Thompson and Morgan, 2013) (Melchers et al., 1978)

DUNG HỢP TB TRẦN

GHÉP CÂY

NCMTBTV-CƠ SỞ KHOA HỌC

Thuyết tế bào (1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann )

+ Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào

+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất

của sự sống

+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó

Tính toàn thế (totipotency)

Khả năng biệt hóa thành bất cứ loại

tế bào nào từ tế bào ban đầu

Tính toàn thế (totipotency)

- Miller và Skoog (1953) tạo được rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc lá

- Reinert và Steward (1958) đã tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi

cấy trong dung dịch

- Cocking (1960) tách được tế bào trần và Takebe (1971) tái sinh được cây hoàn chỉnh từ

nuôi cấy tế bào trần của lá cây thuốc lá

- Tế bào soma, dưới các điều kiện thích hợp, có thể phân hóa để phát triển thành một cơ

thể thực vật hoàn chỉnh

Phân hóa và phản phân hóa (Cell differentiation and dedifferentiation)

NCMTBTV-CƠ SỞ KHOA HỌC

nghiên cứu phát sinh hình thái

NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

Giai đoạn khởi xướng (1898-1930)

- Haberlandt (1898-1902): đề xướng ra tính toàn năng của tế bào

- Kotte và Robbins (1924): thành công trong việc nuôi cấy đầu rễ trong 12 ngày

- Schnucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931-1933), Larue (1933): nuôi cấy

thành công đoạn rễ riêng rẽ trong môi trường nhân tạo

Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)

Xây dựng, vận dụng có kết quả môi trường nửa nhân tạo, đồng thởi phát hiện được vai

trò của một số vitamin đảm bảo sự thành công trong nuôi cấy đối với cơ quan (rễ) và

mô (thượng tầng) ở thực vật

- 1934, White nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục

- 1934, Gautherets đã thành công trong nuôi cấy mô thượng tầng trên môi trường

Knop bổ sung glucose và cysteinhypochloride

- 1983, White nuôi cấu được mô thượng tầng của cây thuốc lá lai

Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 -1960)

Đại diện cho giai đoạn này là Miller, Skoog và Reinert

- 1956, Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô

thuốc lá nuôi cấy

- 1955, Skoog phát hiện ra kinetin là một chất điều

khiển quá trình phân bào (thuộc nhóm Cytokinin) và

phân hóa chồi mầm

- 1958- 1959, Steward và Reinert sử dụng nước dừa

vào nuôi cấy tế bào cà rốt và thu được phôi

- 1960, Bergmann tạo được khối mô sẹo từ một tế bào

đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa

thạch như trải tế bào vi sinh vật

Kinetin (N6-furfuryladenine)

NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào Công nghệ sinh học thực vật

- 1959 Melchers sử dụng mô đơn bội của Antrirrinum majus nghiên cứu tính biến

động mức bội thể trong nuôi cấy và gây đột biến

- 1960 Cooking tách được tế bào trần (protoplast) và từ đó trở đi nuôi cấy tế bào

tách rời đã có những bước phát triển đáng khích lệ

- 1964 Guha và Mahefwari tạo được vây cà độc dược có bộ NST đơn bội từ nuôi

cấy bao phấn

- 1967 Nitsch, 1968 Nakata và Tanaka tạo được cây đơn bội từ bao phấn thuốc lá,

mở ra triển vọng ứng dụng đơn bội vào công tác giống và nghiên cứu di truyền

- 1968 Niieki và nuôi cấy thành công bao phấn và tạo cây đơn bội ở lúa

- 1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast

- 1977 Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây

- 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố

- 1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản

NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN

NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN

PHÂN LOẠI THEO NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

- Nuôi cấy phôi

- Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

- Nuôi cấy mô phân sinh

- Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, noãn

- Nuôi cấy tế bào đơn

- Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

PHÂN LOẠI THEO HÌNH THÁI PHÁT SINH

- Nuôi cấy mô sẹo

- Nuôi cấy tạo phôi

- Nuôi cấy phát sinh chồi

Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

(A) Mô sẹo từ Catharanthus roseus (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp

(C) Mô sẹo C roseus (D) Đầu rễ từ C roseus (E)Tái sinh cây từ C roseus callus

(F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana

(H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum

NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN

NCMTBTV-PHÒNG THÍ NGHIỆM

1 Phòng rửa và sản xuất nước cất

2 Phòng sấy hấp, kho thủy tinh sạch

NCMTBTV-ĐẢM BẢO ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG

Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy mô thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Một

khi bị nhiễm các VSV này, chúng sẽ phát triển lấn át mẫu thực vật

Các nguồn nhiễm tạp chính

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối

- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn

- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường

- Tủ cấy thổi gió: mở quạt, lau bề mặt

bằng cồn 700 trước khi làm việc 15ph

Phòng nuôi

- Xà bông bột, cồn, javen

- Tránh khuấy động các nguồn nhiễm

- Môi trường khoáng

- Dụng cụ kim loại - Chất kháng sinh

- ĐHTTTV (một vài)

- …

Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi

hấp (autoclave) ở 121C tại 103,4 kPa

Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng

KHỬ TRÙNG MẪU CẤY THỰC VẬT

- Mô cấy càng non, càng được bao bọc bên trong thì càng sạch

- Khử trùng bề mặt: tiêu diệt VSV, giữ khả năng sống của mẫu thực vật

- Dung dịch khử trùng:

- Các chất hoạt động bề mặt: Tween 80, Fotoflo, Teepol

Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý

THAO TÁC TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN:

- Trước khi làm thí nghiệm

- Trong khi làm thí nghiệm

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino acid

- Nguồn carbon

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,

bột chuối khô

- Chất kháng sinh

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng là > 0.5 mM, vi lượng là <

0.5 mM

- Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mM nitrate và potassium

- Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mM

- Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với Cu và Co là 0,1 μM, Fe và

Mo là 1 μM, I là 5 μM, Zn là 5-30 μM và Mn là 20-90 μM

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ: Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là

các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và

nhiều chất hữu cơ khác Canxi và axít boric được tìm thấy chủ yếu ở thành

tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh

học

- Thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co-factor): Magie,

kẽm, sắt

- Ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá

của thực vật Ví dụ, K và Ca rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của

tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Cấu trúc của nucleic acid

Cấu trúc của amino acid

Cấu trúc của Chlorophyll a

Ca2+

Nguồn carbon

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Nguồn carbon

- Đường sucrose (saccharose) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường

xuyên Nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục

đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và

tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước)

- Glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả

tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn

fructose cho hiệu quả kém hơn

- Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,

melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và

chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt

- Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể dùng

- Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Nguồn carbon

- Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên

trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền

phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm

thấu, hoặc tương tự sucrose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress

nước

- Các loại rượu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol

thì rất độc

- Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào

nuôi cấy Thí nghiệm với các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Các vitamin

- Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1,

0,1-10 mg/l), acid nicotinic (PP, 0,1-5 mg/l), pyridoxine (B6, 0,1-10 mg/l)

và myo-inositol (50-5000 mg/l)

- Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid,

vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử

dụng trong một số môi trường nuôi cấy

- Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở

các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm trí còn có hại (gây độc)

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

- Không giống như các N vô cơ, các amino acid được các tế bào thực vật hấp

thụ nhanh hơn

- Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế

bào và nuôi cấy tế bào trần

- Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế

bào thực vật là hỗn hợp amino acid

- Casein hydrolysate (0,05-0,1%), L-glutamine (8 mmol/L), L-asparagine

(100 mmol/L), L-glycine (2 mmol/L), L-arginine và L-cystein (10 mmol/L)

là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy

Tyrosine (100 mmol/L) chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường

- Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể

cản trở sự tăng trưởng của tế bào

Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)

Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng

Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng

Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH)

Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào

thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid

Hỗn hợp amino acid nhân tạo

pH 5.0 – 6.0

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

Chất làm rắn môi trường

- Agar: không phản ứng với các thành phần của môi trường; không bị thủy

phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ

nuôi cấy

- Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế

sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC)

- Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel,

alginate, phytagel và gel-rite

- Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper

bridge), bấc giấy lọc (filter paper wick), bọt polyurethane (polyurethane

foam) và xốp polyester (polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá

thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào

Thuốc kháng sinh

Streptomycin/ kanamycin ở nồng độ thấp ngăn chặn hiệu quả sự nhiễm hệ thống

VSV

Vai trò của kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật:

- Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy tế bào

và mô thực vật

- Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy

- Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi

môi trường và mô nuôi cấy

- Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô

đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh) Các tế bào không

được chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh ở nồng độ thích

LM= Lloyd and McCown,

VW= Vacin and Went,

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

NCMTBTV Nhóm

Auxin

1 Indole-3-acetic acid (IAA)

2 Indole-3-butyric acid (IBA)

3 1-naphthaleneacetic acid (NAA)

4 2,4-dichlorophenoxy- acetic acid (2,4-D)

5 (2,4,5-T)

6 Picloram

7 Dicamba

8 p-chlorophenoxy- acetic acid (CPA)

9 Phenylacetic acid (PAA)

- Phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích bật chồi nách

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng) ở lá Giới thiệu tóm tắt về một số chất điều hoà sinh trưởng chính ở thực vật

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng

phụ thuộc vào một số yếu tố

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác

nhau về thành phần môi trường

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi

cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc

dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…)

NCMTBTV-MÔI TRƯỜNG

CHỦ ĐỀ 3

THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY PHÔI

IN VITRO

I Nuôi cấy phôi hữu tính

- Các kiểu nuôi cấy phôi

- Kỹ thuật nuôi cấy

- Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi

II Thụ phấn in vitro

- Tính bất hợp của giao tử trước và sau thụ tinh

- Khái niệm thụ phấn in vitro

- Phương pháp thụ phấn in vitro

- Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro

- Ứng dụng của thụ phấn in vitro

III Công nghệ phôi vô tính (nuôi cấy phát sinh phôi soma)

- Khái niệm về phôi vô tính

- Sự phát sinh và phát triển của phôi soma

I Nuôi cấy phôi hữu tính – Các kiểu nuôi cấy phôi

- Nuôi cấy phôi non

- Nuôi cấy phôi trưởng thành

Tại sao nuôi cấy phôi in vitro?

I Nuôi cấy phôi hữu tính – Kỹ thuật nuôi cấy phôi

sucrose Lưu ý vai trò áp

suất thẩm thấu của

I Nuôi cấy phôi hữu tính – Kỹ thuật nuôi cấy phôi

- Điều kiện nuôi cấy

+ Nhiệt độ: nói chung 25  2C

+ Ánh sáng: tối  sáng

I Nuôi cấy phôi hữu tính – Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi

- Môi trường dinh dưỡng: dịch chiết từ nội nhũ

+ môi trường giàu dinh dưỡng + nội nhũ khỏe

+ loài khác của cùng chi

- Sự phát sinh mô sẹo

II Thụ phấn in vitro – Tính bất hợp của giao tử trước và sau thụ tinh

II Thụ phấn in vitro – Khái niệm

Quá trình tạo hợp tử không phụ thuộc vào cơ thể mẹ Quá trình này phụ thuộc vào:

- Nuôi cấy thành công bầu quả/noãn

- Chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn

Công việc này bao gồm các bước sau:

Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian pollination)

- thụ phấn núm nhụy (stigmatic pollination-gắn hạt phấn vào núm nhụy)

- thụ phấn bầu quả (ovarian pollination-gắn hạt phấn vào các bầu tách rời)

Thụ phấn noãn phân lập

- thụ phấn noãn (ovular pollination-gắn hạt phấn vào các noãn tách rời)

- thụ phấn giá noãn (placental pollination-gắn hạt phấn vào các noãn đính trên giá noãn)

II Thụ phấn in vitro – Phương pháp thụ phấn in vitro

Lưu ý

- Hạt phấn đặt trực tiếp lên một bộ phận nhụy nuôi cấy tốt hơn khi dàn trải

trên môi trường xung quanh noãn

- Sinh trưởng của ống phấn bị ức chế bởi nước trên bề mặt tiếp xúc  loại

nước hoàn toàn

- Noãn thụ phấn in vitro mang hợp tử đơn bào (single-celled zygote)  nuôi

cấy phức tạp

- Kỹ thuật nuôi cấy bầu quả của Nitsch (1951) khi bổ sung VitB hay IAA hoặc

nước dừa tăng kích thước quả

II Thụ phấn in vitro – Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro

1 Trạng thái sinh lý của mẫu vật

- Bề mặt noãn hoặc núm nhụp

- Thời gian tách noãn hoặc núm nhụy

2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Nitsch: phổ biến

- Môi trường Steward và Hsu (H-S): thể lai từ các noãn non được thụ tinh

Lưu ý: nồng độ sucrose

3 Điều kiện nuôi cấy

4 Kiểu gen

II Thụ phấn in vitro – Ứng dụng của thụ phấn in vitro

- vượt qua sự tự bất hợp (self-incompability)

- vượt qua sự bất hợp khi lai (cross-incompability) của các giao tử

- sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis)

Tự bất hợp (self-incompability)

III Công nghệ phôi vô tính

III Công nghệ phôi vô tính – Khái niệm

Các giai đoạn phát triển phôi soma của alfalfa (Medicago sativa L.)

Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là khái niệm

để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà

dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có

chức năng hoàn chỉnh

Sự tạo phôi vô tính là một quá trình nguyên vẹn

- cấu trúc có mô phân sinh chồi và rễ đầy đủ

- không có kết nối với hệ thống mao mạch của mô mẹ ban đầu

- sự tái thiết lập biểu hiện của những gene cần thiết

 trạng thái biến dưỡng tương tự như phôi hợp tử

III Công nghệ phôi vô tính – Khái niệm

III Công nghệ phôi vô tính – Sự phát sinh và phát triển của phôi soma

1 Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gene

trong mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó bằng chương trình biểu hiện của

gene sinh phôi

Current Biology (2011),

doi:10.1016/j.cub.2011.02.020

2 Một (nhiều) tế bào  Phôi  Một (nhiều) phôi  Cây

Sự sinh phôi từ một tế bào sinh dưỡng là một quá trình mà trong đó một hay vài tế bào

sinh dưỡng, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa

sinh trưởng thực vật), có thể tham gia vào một quá trình phân chia theo một trật tự nhất

định để tạo thành một phôi, theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử

III Công nghệ phôi vô tính – Sự phát sinh và phát triển của phôi soma

Science 1 July 2005:

Orange tree embryos can sprout from a single somatic cell

III Công nghệ phôi vô tính – Sự phát sinh và phát triển của phôi soma

auxin

EDC – embryogenic determined cell/ EC – embryogenic cell + IEDC (induced embryogenic determined cell) + PEDC (pre - embryogenic determined cell)

- Phôi vô tính trải qua những giai đoạn phát

triển tương tự như phôi hợp tử

- Giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý

- Không có quá trình tái tổ hợp di truyền

 tất cả những cây con được tái sinh bằng con

đường này đều có vật chất di truyền giống hệt

các tế bào sinh dưỡng cha mẹ

III Công nghệ phôi vô tính – Sự phát sinh và phát triển của phôi soma

Đặc tính cơ bản của EC

- kích thước nhỏ, đẳng kính,

- hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao,

- thể tích không bào giảm, tăng thể tích tế bào chất,

- nhân và hạch nhân rất to và đậm màu,

- đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột

- mạng lưới nội chất nhỏ

III Công nghệ phôi vô tính – Ảnh hưởng của tuổi sinh lí lên khả năng phát sinh phôi soma

Vai trò tuổi sinh lý của mẫu cấy trong việc khởi phát sự sinh phôi vô tính

III Công nghệ phôi vô tính – Ảnh hưởng của tuổi sinh lí lên khả năng phát sinh phôi soma

III Công nghệ phôi vô tính – Đặc điểm của thực vật tái sinh từ phôi vô tính

- Cây con được tạo thành vẫn duy trì các đặc tính của cây mẹ

- Tần số đột biến ở sự tạo phôi vô tính thấp

- Cây này có sức sống cao, dễ sống khi chuyển ra môi trường đất và sinh

trưởng, phát triển tốt

- Không xuất hiện những bất thường về hình thái trong tự nhiên và

không có những thay đổi nào về di truyền và tế bào

III Công nghệ phôi vô tính – Ứng dụng

- Sự chọn lọc tế bào

- Sự tái sinh các thực vật chuyển gene

- Sự tạo các dòng đồng hợp tử và đa bội

- Sự loại trừ virus

- Sự thành lập khuẩn căn

- Công nghệ hạt nhân tạo

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để chỉ phôi vô tính hay

những thể nhân giống khác (đoạn thân, chồi, củ siêu nhỏ, protocorm, PLB…) được

bọc bởi một lớp gel, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài và

vận chuyển trở nên dễ dàng hơn

Ứng dụng của hạt nhân tạo

1) không tạo được hạt,

2) hạt được tạo thành với một số lượng thấp,

3) khả năng hạt sống sót rất thấp,

4) việc nhân giống thực vật khó khăn, và chất mầm không thể bảo quản được

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

Vật liệu làm vỏ bọc

agar, alginate, polyco2133, carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite, guargum,

sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum,…

Công thức cấu tạo của alginate (a) các monomer; (b) chuỗi alginate

Alginate: tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi vô tính, có các đặc tính tương hợp

sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để lâu được, độ cứng của gel vừa phải

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

Manual encapsulation

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

Na-alginate + CuSO4/CaCl2/…  đông lại thành gel

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

Ưu điểm:

- Hệ số nhân giống cao

Ví dụ, ở cà phê người ta có thể tạo được 600.000 phôi vô tính từ 1 gram sinh

khối ban đầu trong vài tháng với tỷ lệ tái sinh cây từ phôi vô tính đạt 47%

- Có thể nảy mầm trực tiếp thành cây

- Có thể bảo quản và lưu giữ dài hạn

- Khả năng công nghiệp hoá và tự động hoá quá trình nhân giống quy mô lớn

(bioreactor)

III Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo

Tồn tại:

- Chưa phát hiện được phương pháp lưu trữ hoàn chỉnh nhất

- Chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao, sự trao đổi khí kém

- Khi sử dụng phôi vô tính làm vật liệu để tạo hạt nhân tạo:

+ thiếu tính đồng bộ trong quần thể phôi vô tính: