Khóa luận tốt nghiệp Sàng lọc tôm thẻ chân trắng bố mẹ (Penaeus vannamei) sạch bệnh dựa trên chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật PCR

Đề tài “ Sàng lọc tôm thẻ chân trắng bố mẹ (Penaeus vannamei) sạch bệnh dựa trên chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật PCR” được thực hiện từ 092016012017 tại phòng PCR, Công ty TNHH Giống thủy sản Việt Nam chi nhánh Ninh Thuận. Đề tài sử dụng kỹ thuật PCR và RTPCR để chẩn đoán bệnh trên đàn tôm mẹ có nguồn gốc từ Indonesia (số lượng: 244 con). Đàn tôm mẹ được xét nghiệm bệnh sau khi cắt mắt và cho đẻ thử nghiệm. Cụ thể: Sử dụng kỹ thuật PCR và các bộ kit PCR của công ty Khoa Thương để xét nghiệm bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh hoại tử mô dưới da và cơ quan tạo máu (IHHNV) trên mẫu máu tôm; xét nghiệm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (EMSAHPND), bệnh hoại tử gan tụy do virus HPV, bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn NHP trên mẫu phân tôm. Sử dụng kỹ thuật RT PCR và các bộ kit PCR của công ty Khoa Thương để xét nghiệm bệnh đỏ đuôi (Hội chứng Taura (TS)), bệnh hoại tử cơ (đục cơ) do virus (IMNV) và bệnh đầu vàng (YHVGAV) trên mẫu máu của tôm Trong 40 con đầu tiên được lấy ngẫu nhiên (lấy mẫu phân và mẫu máu của từng con) trong tổng số 244 con đem xét nghiệm 8 bệnh nêu trên, kết quả có 240 mẫu dương tính WSSV (240 con nhiễm WSSV, tỷ lệ nhiễm 5%); 1040 mẫu dương tính HPV (1040 con nhiễm HPV, tỷ lệ nhiễm 25%); 1740 mẫu dương tính EMS (1740 con nhiễm EMS, tỷ lệ nhiễm 42,50%) và không có mẫu nào nhiễm 5 bệnh còn lại. Kết luận 40 244 con không bị nhiễm 5 bệnh (IHHNV, IMNV, TSV, NHP, YHV) chạy dữ liệu trên minitab16 có tỷ lệ p= 0,164 nằm trong khoảng tin cậy là (0.120; 0.216) với độ tin cậy 95%, như vậy ta ước lượng rằng tỷ lệ p=0,16 của 40244 con không nhiễm 5 bệnh trên nằm trong khoảng 0,120 đến 0,216 với độ tin cậy 95%. Trên cơ sở đó, trong 204 con tôm còn lại, không xét nghiệm 5 bệnh trên và chỉ xét nghiệm 3 bệnh: bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (EMSAHPND), bệnh hoại tử gan tụy trên tôm do virus HPV.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

SÀNG LỌC TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BỐ MẸ

(Penaeus vannamei) SẠCH BỆNH DỰA TRÊN

CHẨN ĐOÁN BỆNH BẰNG KỸ THUẬT PCR

Tác giả

NGUYỄN HOÀNG LINH SƯƠNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng

Kỹ sư Ngành Nuôi Trồng Thủy Sản Chuyên Ngành Nuôi Trồng Thủy sản

Giáo viên hướng dẫnTHSThS ĐỖ THỊ THU MINH

TS NGUYỄN PHÚC CẨM TÚ

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Đỗ Thị Thu Minh và T.SNguyễn Phúc Cẩm Tú đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quátrình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn các anh chị của Cty TNHH Giống Thủy Sản Việt Nam chinhánh Ninh Thuận và các bạn cùng thực hiện đề tài đã giúp đỡ, chia sẻ trong suốt thờigian vừa qua

Cám ơn gia đình và các bạn lớp DH13NT đã động viên, ủng hộ để tôi hoàn thànhtốt khóa luận

Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuynhiên, bước đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, kiến thức chuyên môn cònhạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được những ý kiếnđóng góp từ Thầy, Cô để bài báo cáo luận văn được hoàn thiện hơn Tôi xin chânthành cảm ơn

Sinh viên

Nguyễn Hoàng Linh Sương

TÓM TẮT

Đề tài “ Sàng lọc tôm thẻ chân trắng bố mẹ (Penaeus vannamei) sạch bệnh dựatrên chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật PCR” được thực hiện từ 09/2016-01/2017 tạiphòng PCR, Công ty TNHH Giống thủy sản Việt Nam chi nhánh Ninh Thuận Đề tài

sử dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR để chẩn đoán bệnh trên đàn tôm mẹ có nguồn gốc

từ Indonesia (số lượng: 244 con) Đàn tôm mẹ được xét nghiệm bệnh sau khi cắt mắt

và cho đẻ thử nghiệm Cụ thể:

Sử dụng kỹ thuật PCR và các bộ kit PCR của công ty Khoa Thương để xétnghiệm bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh hoại tử mô dưới da và cơ quan tạo máu(IHHNV) trên mẫu máu tôm; xét nghiệm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính(EMS/AHPND), bệnh hoại tử gan tụy do virus HPV, bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩnNHP trên mẫu phân tôm

Sử dụng kỹ thuật RT- PCR và các bộ kit PCR của công ty Khoa Thương để xétnghiệm bệnh đỏ đuôi (Hội chứng Taura (TS)), bệnh hoại tử cơ (đục cơ) do virus(IMNV) và bệnh đầu vàng (YHV/GAV) trên mẫu máu của tôm

Trong 40 con đầu tiên được lấy ngẫu nhiên (lấy mẫu phân và mẫu máu của từngcon) trong tổng số 244 con đem xét nghiệm 8 bệnh nêu trên, kết quả có 2/40 mẫudương tính WSSV (2/40 con nhiễm WSSV, tỷ lệ nhiễm 5%); 10/40 mẫu dương tínhHPV (10/40 con nhiễm HPV, tỷ lệ nhiễm 25%); 17/40 mẫu dương tính EMS (17/40con nhiễm EMS, tỷ lệ nhiễm 42,50%) và không có mẫu nào nhiễm 5 bệnh còn lại Kết luận 40/ 244 con không bị nhiễm 5 bệnh (IHHNV, IMNV, TSV, NHP, YHV)chạy dữ liệu trên minitab16 có tỷ lệ p= 0,164 nằm trong khoảng tin cậy là (0.120;0.216) với độ tin cậy 95%, như vậy ta ước lượng rằng tỷ lệ p=0,16 của 40/244 conkhông nhiễm 5 bệnh trên nằm trong khoảng 0,120 đến 0,216 với độ tin cậy 95% Trên

cơ sở đó, trong 204 con tôm còn lại, không xét nghiệm 5 bệnh trên và chỉ xét nghiệm

3 bệnh: bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (EMS/AHPND), bệnhhoại tử gan tụy trên tôm do virus HPV

Đầu tiên, lấy mẫu phân để xét nghiệm bệnh hoại tử gan tụy do virus (HPV)trước Kết quả có 55/204 mẫu dương tính HPV (55/204 con nhiễm virus HPV, tỷ lệnhiễm 26,96%) Loại bỏ 55 con nhiễm HPV, xét nghiệm bệnh EMS trên 149 con còn

lại, kết quả có 14/149 mẫu dương tính EMS ( 14/149 con nhiễm EMS, tỷ lệ nhiễm9,40%) Do vậy loại bỏ 14 con bị nhiễm EMS chỉ xét nghiệm bệnh đốm trắng WSSVtrên 135 con còn lại, kết quả có 4/135 con bị nhiễm WSSV (tỷ lệ nhiễm 2,96%)

Kết quả trong tổng số 244 con xét nghiệm bệnh, có 90 con bị bệnh (chiếm36,88%), 154 con sạch bệnh (chiếm 63,12%) Những con bị bệnh bị loại bỏ, giữ lạinhững con sạch bệnh đưa vào sản xuất (cho đẻ) Mẫu PL được sản xuất từ những contôm sạch bệnh này cũng được xét nghiệm lại các bệnh trên bằng kỹ thuật PCR, kếtquả không có mẫu PL nào bị nhiễm nhiễm các bệnh trên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 3

1.3 Nội dung đề tài 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng 4

2.1.1 Phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Nguồn gốc và phân bố 5

2.2.4 Các yếu tố môi trường sống 5

2.1.5 Tập tính sinh sống 5

2.1.6 Tập tính ăn 5

2.1.7 Sinh trưởng 6

2.1.8 Sinh sản 6

2.2 Vài nét về tôm sạch bệnh (SPF), tôm kháng bệnh (SPR) 6

2.3 Lịch sử nghiên cứu và gia hóa tôm thẻ chân trắng 9

2.3.1.Trên thế giới 9

2.3.2.Tại Việt Nam 12

2.4 Tình hình dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng 15

2.4.1 Dịch bệnh trên tôm nuôi 15

2.4.1.1 Dịch bệnh đốm trắng 16

2.4.1.2 Bênh hoại tử gan tụy cấp 16

2.4.1.3 Nguyên nhân khác: 17

2.4.2 Tình hình kiểm dịch tôm giống và tôm bố mẹ chân trắng nhập khẩu 18

2.4.3 Tình hình giám sát dịch bệnh 2014-2015 19

2.5 Con đường lan truyền bệnh trên động vật thủy sản 20

2.6 Chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản 22

2.6.1 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 22

2.6.1.1.Phương pháp chẩn đoán truyền thống: 22

2.6.1.2 Phương pháp chẩn đoán dựa vào đặc điểm mô bệnh học 23

2.6.1.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào sinh học phân tử 24

2.6.2 Tìm hiểu về kỹ thuật PCR 24

2.6.2.1.Khái niệm PCR 24

2.6.2.2 Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR 25

2.6.2.3 Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh 28

2.6.2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về chẩn đoán bệnh trên tôm bằng ký thuật PCR 29

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1.Thời gian và địa điểm 30

3.2 Nội dung 30

3.3 Nguyên vật liệu 31

3.3.1.Mẫu xét nghiệm 31

3.3.2.Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 31

3.4 Phương pháp nghiên cứu 33

3.4.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu 33

3.4.2 Quy trình ly trích mẫu 35

3.4.3 Tiến hành PCR 37

3.4.4 Điện di 40

3.5 Phân tích kết quả 40

3.6 Phương pháp phân tích số liệu 42

3.6.1 Xác định tỷ lệ cảm nhiễm 42

3.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 42

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4,1 Phân tích kết quả điện di 42

4.2 Đọc kết quả điện di 43

4.3 Kết quả điện di 47

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

5.1.Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 1: 53 PHỤ LỤC 2 : 62

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

TTCT Tôm thẻ chân trắng

WSSV White Spot Syndrome Virus (Bệnh đốm trắng do virus White Spot

Syndrome)

EMS Early Mortality Syndrome (hội chứng tôm chết sớm)

AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (bệnh hoại tử gan - tụy cấp

trên tôm)EHP Enterocytozoon hepatopenaei (bệnh vi bào tử trùng)

YHV Yellow head virus (Bệnh đầu vàng)

MBV Monodon Baculovirus (Bệnh còi trên tôm do Baculovirus)

IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (Bệnh hoại tử

mô dưới da và cơ quan tạo máu ở tôm)IMNV Infectious myonecrosi virus (Bệnh Hoại tử cơ /bệnh đục cơ do virus)

TSV Taura Syndrome (Hội chứng Taura)

HPV Hepatopancreatic Parvovirus

NHP Necrotizing Hepatopancreatitis (bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn NHP)DO: Dissolved oxygen (ôxy hòa tan)

SPF Specific Pathogen Free (Tôm sạch bệnh đặc trưng)

SPR Specific Pathogen Resistance (Tôm kháng bệnh đặc trưng)

VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers (Hiệp hội Chế

biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam)USMSFP United States Marine Shrimp Farming Program (Chương trình nuôi tôm

biển Hoa Kỳ)USDA United States Department of Agriculture (Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ) FAO Food and Agriculture Organiztion of the Unite Nations (Tổ chức Lương

Nông Liên hiệp quốc)OIE The World Organisation for Animal Health (Tổ chức sức khỏe động vật

thế giới)RGCA Rajiv Gandhi Center Aquaculture (Trung tâm Nuôi trồng Thủy sản Rajiv

Gandhi)

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn

Ctv Cộng tác viên

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction (PCR phiên mã

ngược)DNA deoxyribonucleic acid

dNTP deoxyribonucleoside triphosphate

PL Postlarvae

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Tôm thẻ chân trắng hiện đang là đối tượng nuôi chủ yếu và góp phần đem lạihiệu quả đáng kể trong xuất khẩu thu ngoại tệ của ngành Nuôi trồng thủy sản ViệtNam Theo thông tin từ Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP),xuất khẩu tôm 9 tháng năm 2016 đạt 2,2 tỷ USD, tăng 5,6% so với cùng kỳ năm ngoái,trong đó tôm chân trắng chiếm 61%, tăng 11% Có thể nói nghề nuôi tôm đã tạo ranhiều công ăn việc làm, mang lại thu nhập cao cho người dân và góp phần làm giàucho đất nước Nhưng nhìn lại, ngành này đang đối mặt nhiều thách thức: chi phí sảnxuất cao so với các nước, các hộ nuôi tôm nhỏ lẻ chiếm đa số và chưa có sự liên kết,thức ăn, hóa chất và chất lượng tôm giống hiện thiếu sự kiểm soát chặt chẽ cùng vớitình hình dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp cụ thể một số bệnh nguy hiểm trêntôm như: bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (EMS), bệnh do vibào tử trùng (EHP), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử gan tụy (HPV), hội chứngTaura (TS), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHNV), bệnh hoại tử

cơ /bệnh đục cơ do virus IMNV đã và đang gây ra thiệt hại trầm trọng, ảnh hưởngtrực tiếp đến năng suất, chất lượng và thu nhập của người nuôi Mặc dù quyết định đến50% việc thành bại trong nuôi tôm nhưng công tác quản lý chất lượng tôm giốngvẫn chưa hiệu quả dẫn đến tình trạng không kiểm soát được, tôm giống không rõnguồn gốc hoặc tôm bị nhiễm bệnh đang trở thành vấn đề đáng lo ngại và quan tâmhiện nay Con giống kém chất lượng nên khả năng chống chọi với các yếu tố stressmôi trường và sức đề kháng với các mầm bệnh kém, dẫn đến vụ nuôi thất bại Điềunày cho thấy rằng nguồn giống đóng vai trò hết sức quan trọng, chất lượng giống ảnhhưởng trực tiếp đến hiệu quả của nghề nuôi tôm thịt xuất khẩu Do vậy để đảm bảocho sự phát triển bền vững của nghề nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm, cần phải cócon giống đủ về số lượng và đạt chất lượng Con giống phải khỏe mạnh và khôngmang mầm bệnh là tiêu chuẩn đặt lên hàng đầu

Theo thống kê của Tổng Cục Thủy Sản, tính đến 6/2016 cả nước ta có 1750 cơ sởsản xuất giống trong đó có 510 cơ sở sản xuất giống tôm thẻ chân trắng và 1240 cơ sởsản xuất giống tôm sú Với nhu cầu giống hàng năm là 130 tỷ con thì số lượng tôm bố

mẹ cần thiết để sản xuất giống là 230 nghìn con (30 nghìn tôm sú, 200 nghìn tôm thẻchân trắng) Hiện tại nguồn tôm thẻ chân trắng bố mẹ ở nước ta chủ yếu vẫn đượcnhập từ các nước Thái Lan, Indonexia, Mỹ, Singapore… để sản xuất cung cấp giốngcho cả nước, tuy nhiên chất lượng thường chưa ổn định và dễ phát sinh bệnh trong quátrình trung chuyển Có rất nhiều vấn đề liên quan đến việc sử dụng tôm bố mẹ khôngsạch mầm bệnh Vấn đề đầu tiên và cũng là hàng đầu đã được nhắc đến là khả năng dunhập những virus mang mầm bệnh mới và các bệnh khác vào những vùng mới và sạchbệnh Thêm nữa không có các nguyên tắc về tiệt trùng và an toàn sinh học nghiêmngặt để xử lý tôm bố mẹ không sạch mầm bệnh, trứng và ấu trùng Các mầm bệnhnhiễm từ tôm bố mẹ kém chất lượng sẽ có xu hướng truyền sang ấu trùng Điều nàylàm tăng khả năng xảy ra những vấn đề nghiêm trọng về bệnh trong quá trình nuôi Dovậy chất lượng tôm bố mẹ là vấn đề then chốt quyết định đến hiệu quả sản xuất giống,chất lượng con giống cũng như sự thành công của vụ nuôi tôm (Tổng Cục Thủy Sản,2016)

Vấn đề đặt ra là làm thế nào để xác định và chọn lựa tôm bố mẹ sạch bệnh chotham gia sinh sản mang lại hiệu quả cao và cho ra đời đàn tôm giống chất lượng tốt

Từ thực tế đã có các phương pháp chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản được thựchiện để kiểm tra và phát hiện những dấu hiệu hoặc mầm bệnh đặc trưng nhằm gópphần trong việc quản lý và khống chế dịch bệnh Các phương pháp chẩn đoán bệnhtruyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm truyền thống không cho phépphát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Nhiều phương pháp lai tại chỗ (In situhybridization), phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction – PCR, reversetranscriptase polymerase chain reaction - RT-PCR)…đang phát triển với ưu điểmnhanh và độ chính xác cao ( Phan Quốc Việt và ctv, 2003) … Trong đó PCR làphương pháp cho phép phát hiện nhanh và chính xác các mầm bệnh virus (Đặng ThịHoàng Oanh , Trần Nguyễn Diễm Tú và Trần Việt Tiên, 2010) đang ngày càng được

sử dụng phổ biến và chiếm ưu thế Với ý nghĩa thực tiễn đó, cùng với sự giúp đỡ vàtạo điều kiện từ Chi nhánh Cty TNHH Giống Thủy Sản Việt Nam cơ sở Ninh Thuận,

sự chấp thuận của Khoa Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, tôi thực hiện

đề tài “ Sàng lọc tôm thẻ chân trắng bố mẹ ( P enaeus vannamei) sạch bệnh dựa trên chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật PCR”

1.2 Mục tiêu đề tài

Thông qua quá trình chẩn đoán bệnh trên đàn tôm thẻ chân trắng bằng kỹ thuậtPCR, giúp phát hiện và loại bỏ tôm nhiễm bệnh, chọn lọc được đàn tôm mẹ sạch bệnhcho tham gia sinh sản, kiểm soát sự lây nhiễm bệnh từ đàn tôm mẹ sang con, góp phầnsản xuất ra giống tôm sạch bệnh

1.3 Nội dung đề tài

Tôm bố mẹ nhập về trại giống được nuôi vỗ cách ly Đàn tôm mẹ sau khi cắt mắt

và cho đẻ thử nghiệm, tiến hành kiểm tra xét nghiệm bệnh trên từng đối tượng tôm thẻchân trắng mẹ bằng kỹ thuật PCR (gồm có 6 mầm bệnh TSV, WSSV, IHHNV, YHV,NHP, IMNV) đảm bảo tôm bố mẹ đạt chất lượng đúng theo Quyết định số 456/QĐ-BNN-NTTS của Bộ NN&PTNT và tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 10257:2014 – Bộ NôngNghiệp và Phát Triển Nông Thôn) Bên cạnh đó đề tài cũng xét nghiệm thêm bệnh EMS

và HPV do xét thấy đây là 2 bệnh nguy hiểm cũng cần được kiểm tra

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng

 3 đôi hàm: đôi hàm lớn, đôi hàm nhỏ 1 và đôi hàm nhỏ 2 Ba đôi chân hàm

có chức năng giữ mồi, ăn mồi và hỗ trợ hoạt động bơi lội của tôm

 5 đôi chân bò (chân ngực) cho tôm bò trên mặt đáy Ở tôm cái, giữa gốcchân ngực 4 và 5 có thelycum (cơ quan sinh dục ngoài, nơi nhận và giữ túitinh từ con đực chuyển sang con cái)

Phần bụng có 7 đốt: 5 đốt đầu, mỗi đốt mang một đôi chân bơi hay còn gọi là chânbụng Mỗi chân bụng có một đốt chung bên trong Đốt ngoài chia làm hai nhánh:nhánh trong và nhánh ngoài, đốt thứ 7 biến thành telson hợp với đôi chân đuôi phânthành nhánh tạo thành đuôi giúp cho tôm chuyển động lên xuống và búng nhảy Ở tômđực, hai nhánh trong của đôi chân bụng 2 biến thành đôi phụ bộ đực (là bộ phận sinhdục bên ngoài của tôm)

2.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Theo trung tâm khuyến ngư Quốc gia (2004), tôm Penaeus vanamei (Bone, 1931)

là loài tôm nhiệt đới, phân bố ở vùng ven bờ phía Đông Thái Bình Dương, từ biểnPeru đến Nam Mêhicô, vùng biển Ecuador Hiện tôm chân trắng đã được di giống ởnhiều nước Đông Á và Đông Nam Á như Trung Quốc, Thái lan, Philippine, Indonesia,Malayxia và Việt Nam

2.2.4 Các yếu tố môi trường sống

Theo Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lư (2003), yêu cầu về chất lượng nước nuôi tômnhư sau:

 Độ mặn : 5-32%0 , thích hợp nhất là 10-25%0.

 Nhiệt độ nước thích hợp nhất là 20-300 C, quá cao không quá 330C, quá thấpkhông thấp quá 180C

 DO> 4mg/l, không dưới 2mg/l

 pH: 7,8-8,3, dưới 7 không thích hợp với tôm

 Độ trong: 25-35cm, màu nước là màu xanh lục, vỏ đậu xanh

 Độ sâu: 1,5-2m

 H2S: <0,03 mg/l

 NH3: <0,1 mg/l

2.1.5 Tập tính sinh sống

Theo Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lư (2003), tôm thẻ chân trắng sống ở vùng biển

tự nhên có các đặc điểm: Đáy cát, độ sâu 0-72 m; nhiệt độ nước ổn định từ 25-320C,

dộ mặn 28-34%0, pH 7,7-8,3 Tôm trưởng thành phần lớn sống ở ven biển gần bờ, tômcon ưa sống ở các khu vực cửa song giàu sinh vật thức ăn

2.1.6 Tập tính ăn

Theo Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lư (2003), tôm chân trắng là loài ăn tạp, tôm ăn

cả thức ăn có nguồn gốc động vật lẫn thực vật Chúng có thể ăn thức ăn tự nhiên trong

ao như tảo, sinh vật phù du, sinh vật đáy và thức ăn do con người cung cấp Thức ăntôm cần đầy đủ các thành phần: protein, lipid, glucid, vitamin, muối khoáng thiếu haykhông cân đối đều ảnh hưởng đến sức khỏe tôm Khi nhiệt độ lên đến 330C hoặc vào

mùa lạnh khi nhiệt độ xuống thấp tôm thường ăn ít Trong thời kỳ tôm sinh sản và đặcbiệt là giữa và cuối giai đoạn phát dục của buồng trứng thì nhu cầu và lượng thức ănhàng ngày tăng lên gấp 3-5 lần, thức ăn cần hàm lượng đạm (protein) 35% là thíchhợp.

2.1.7 Sinh trưởng

Sự tăng trưởng về kích thước của tôm thẻ có dạng bậc thang thể hiện sự sinhtrưởng không liên tục Kích thước cơ thể giữa hai lần lột xác hầu như không tăng hoặctăng không đáng kể và sẽ tăng vọt sau những lần lột xác Trong khi đó sự tăng trưởng

về khối lượng có tính liên tục hơn Tôm Thẻ có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, tốc

độ tăng trưởng tùy theo loài, từng giai đoạn phát triển, giới tính và điều kiện môitrường, dinh dưỡng Từ ấu trùng đến đầu thời kỳ thiếu niên, không có sự khác biệtgiữa tốc độ tăng trưởng giữa tôm đực và tôm cái Tuy nhiên, tới cuối thời kỳ thiếuniên, tôm cái lớn nhanh hơn tôm đực

2.1.8 Sinh sản

Tôm chân trắng thành thục sớm, con cái có khối lượng từ 30 - 45 g/con là có thểtham gia sinh sản Mùa sinh sản của tôm chân trắng ở vùng biển có sự khác nhau vídụ: ở ven biển phía Bắc Ecuado tôm đẻ tử tháng 12 đến tháng 4 Lượng trứng của mỗi

vụ đẻ phụ thuộc vào cỡ tôm mẹ: tôm mẹ từ 30 45g thì lượng trứng từ 100.000 250.000 trứng, đường kính trứng 0,22mm

-Sau mỗi lần đẻ hết trứng, buồng trứng tôm lại phát triển tiếp Thời gian giữa 2 lần

đẻ cách nhau 2 đến 3 ngày Con đẻ nhiều nhất tới 10 lần/năm Thường sau 3 - 4 lần đẻliên tục thì có lần lột vỏ Sau khi đẻ 14 đến 16 giờ trứng nở ra ấu trùng Nauplius ấutrùng Nauplius trải qua 6 giai đoạn: Zoea qua 3 giai đoạn, Mysis qua 3 giai đoạn thành

Postlarvae Chiều dài của Postlarvae tôm P vannamei khoảng 0,88 - 3mm.

2.2 Vài nét về tôm sạch bệnh (SPF: Specific pathogen free), tôm kháng bệnh

(SPR: Specific pathogen resistance)

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi tôm thẻ chân trắng đã đem lạinguồn lợi kinh tế lớn song lại tồn tại nhiều dịch bệnh nguy hiểm gây thiệt hại đáng kểcho chính nghề nuôi này, do đó đã có nhiều chương trình chọn giống và gia hóa tôm

được thực hiện và cho ra đời nhiều dòng tôm được biết đến là tôm sạch bệnh (SPF) vàtôm kháng bệnh (SPR) Có thể nói điều này đã mở ra nhiều triển vọng trong sản xuấtcác giống tôm sạch bệnh, có khả năng chống chọi tốt với dịch bệnh đáp ứng mongmuốn và đem lại lợi ích cho người nuôi Và điều này dẫn đến những quan niệm chorằng việc sử dụng những con tôm sạch mầm bệnh có khả năng kháng bệnh này sẽkhông thể nhiễm những mầm bệnh virus mà chúng gặp phải trong quá trình nuôi?Thiết nghĩ, chúng ta cần có sự nhìn nhận hoàn thiện và đúng đắn về thuật ngữ tômsạch bệnh (SPF) và tôm kháng bệnh (SPR) này

Hiện chưa có một quy tắc thống nhất trên phạm vi quốc tế đối với sự phát triển củatôm SPF, do đó có sự khác biệt về chất lượng của các giống SPF khác nhau Một trongnhững khái niệm về tôm sạch bệnh SPF được biết đến là:

Tôm sạch bệnh đặc trưng (SPF: Specific Pathogen Free): Một dòng hay một quầnđàn tôm gia hoá được kiểm soát bệnh bởi một phòng thí nghiệm chuẩn đoán đượccông nhận trong một chương trình giám sát cố định trong thời gian ít nhất 2 năm vàcho thấy là hoàn toàn sạch các mầm bệnh trong danh sách của OIE (Tổ chức quốc tế

về sức khoẻ động vật) hay USMSFP (Chương trình nuôi tôm biển Hoa Kỳ) (Trần

Công Bình, 2014) Do đó, tôm sạch bệnh đặc trưng (SPF) chỉ sạch các bệnh trong

danh sách SPF chứ không phải sạch tất cả các loại bệnh Mặc dù đã trải qua sự sànglọc như vậy nhưng đối với những loại virus mới chưa bộc lộ hoặc chưa biết đến có thểxuất hiện nhưng vì chúng chưa được nhận diện nên vẫn có thể thoát khỏi sự kiểm dịch

Những con tôm sạch bệnh được sản xuất tại những cơ sở nuôi an toàn sinh học,được kiểm tra nhiều lần và được nhận định là sạch mầm bệnh thông qua việc sử dụngrất nhiều các quy tắc quan trắc và có nguồn gốc từ những con tôm bố mẹ được nuôivới những quy tắc phát triển số lượng bố mẹ nghiêm ngặt Các con tôm bố mẹ nàyđược tạo ra thông qua những quy trình kiểm dịch rộng rãi, những quy trình đó đưa đếncác thể hệ F1 sạch mầm bệnh (không có những mầm bệnh nhất định mà người nuôiquan tâm) Chỉ khi được nuôi và giữ trong những điều kiện này ta mới có thể có đượccác giống SPF thực sự Một khi những con tôm này được đưa ra khỏi các cơ sở sảnxuất SPF, chúng không còn được coi là SPF mặc dù chúng có thể vẫn sạch mầm bệnh Như vậy SPF đơn giản chỉ là không mang các mầm bệnh và có thể bị nhiễm bệnh nếuchúng tiếp xúc với mầm bệnh

Bảng 2.1: Danh sách bệnh đặc trưng trên giáp xác của OIE (tháng 5/2010)

(Các bệnh virus đã đưa ra khỏi danh sách năm 2010 là BP và MBV)

Bệnh virus trên tôm he TSV, WSSV, YHV/GAV, IHHNV,

IMNVBệnh virus trên tôm càng MrNV

Bênh vi khuẩn trên tôm he NHP-B

Bệnh nấm trên tôm rồng (Crayfish) Aphanomyces astaci

Bảng 2.2: Danh sách mầm bệnh đặc trưng của USMSFP (2006-2007)

Bệnh đặc trưng của tôm chia làm 3 nhómNhóm 1: là những mầm bệnh có khả

năng gây ra những thiệt hại rất lớn về

kinh tế Tất cả đều nằm trong danh

sách của OIE

Virus: TSV, WSSV, YHV, GAV,IMNV

Nhóm 2: là những mầm bệnh có khả

năng đe doạ về mặt kinh tế Phần lớn

nằm trong danh sách của OIE

Virus: IHHNV, BP, MBV, BMN, HPV

Vi khuẩn: NHP

Protozoa: Microspodian, Halospodian

Nhóm 3: Những mầm bệnh có khả

năng gây trở ngại về kinh tế

(không có trong danh sách của OIE)

Protozoa: Gregarine

Đối với Tôm kháng bệnh đặc trưng ( SPR: Specific Pathogen Resistance): Là tôm

có khả năng kháng lại những mầm bệnh đặc trưng nhờ vào quá trình cải thiện tính di

truyền của tôm (Trịnh Công Bình, 2014). Những công trình nghiên cứu gần đây củamột số quốc gia và công ty tư nhân đã tập trung nỗ lực vào việc phát triển những giốngSPF và cũng kháng được một số mầm bệnh (SPF/SPR) Đây là quá trình lâu dài vàthường tập trung vào một mầm bệnh, Cho đến nay chỉ mới tạo được dòng tôm xanh

Nam Mỹ (P stylirostris) có khả năng kháng IHHNV, một số giống tôm thẻ chân trắng (P vannamei) kháng được hội chứng Taura (TSV) dòng 1 nhưng không kháng được

dòng 2, dòng 3 và đang nghiên cứu tạo tính kháng với bệnh đốm trắng (WSSV) vàbệnh hoại tử cơ đuôi (IMNV)

2.3 Lịch sử nghiên cứu và gia hóa tôm thẻ chân trắng

Gia hóa (domestication) xét theo một nghĩa rộng hơn là quá trình nhờ đó động vật,

thực vật hay vi khuẩn được lựa chọn từ tự nhiên thích nghi với nơi sống đặc biệt docon người tạo ra; đưa một loài hoang dã vào trong điều kiện quản lý, kiểm soát củacon người Trong phạm vi di truyền gia hóa là quá trình trong đó những thay đổi trong

sự thể hiện và tần số xuất hiện gen diễn ra từ một nhóm mới của chọn giống được ápdụng trên một quần thể (Theo Từ điển thuật ngữ Nuôi trồng thủy sản FAO, 2008).Tôm thẻ chân trắng là một trong những đối tượng thủy sản được gia hóa (đượcnuôi khép kín vòng đời trong các hệ thống nuôi có kiểm soát) nhằm tăng sản lượng vàkháng bệnh tốt hơn Tôm bố mẹ sạch bệnh (SPF) và kháng bệnh (SPR) là sản phẩmcủa một quá trình gia hóa

Tôm thẻ chân trắng có nguồn gốc từ Nam Mỹ đang là đối tượng tôm nuôi quantrọng thay thế tôm sú ở nhiều nước với tỷ trọng sản lượng của thế giới hiện nay là 80%

và tôm sú 20%, mặc dù khoảng 5-6 năm trước tỷ lệ này là 70:30 và giữa những nămcủa thập niên 90 thì tỷ lệ này là 25:75 Sản lượng tôm chân trắng của Trung Quốc,Thái Lan đã vượt trên 1,5 triệu tấn (Tổng Cục Thủy Sản, 2014) Sở dĩ tôm chân trắngNam Mỹ đã được du nhập vào các nước châu Á một cách mạnh mẽ để thay thế tôm sú,theo các chuyên gia, phần lớn là do thành công công nghệ gia hoá, tạo được số lượnglớn tôm bố mẹ sạch một số bệnh nguy hiểm (SPF), được chọn giống và cung cấp chosản xuất ở quy mô thương mại Thời gian nuôi tôm chân trắng ngắn hơn so với nuôitôm sú, nếu có kế hoạch và quản lý tốt, có thể nuôi tôm chân trắng 3 vụ/ năm

2.3.1.Trên thế giới

Tôm thẻ chân trắng được nuôi vào khoảng thập niên 80, ban đầu tập trung ở cácnước Tây bán cầu Nghề nuôi tôm này phát triển khá thuận lợi và dễ thành công do sựchấp nhận của thị trường và chưa có sự xuất hiện của dịch bệnh Lúc này nguồn giốngcung cấp cho nuôi tôm chủ yếu đều là khai thác tôm giống từ tự nhiên Đến cuối thậpniên 80, mở ra thời kỳ tôm giống, nguồn tôm giống được sản xuất trên các trại giống ởđất liền, tuy nhiên những con tôm giống này vẫn mang nguồn gen tự nhiên (hoang dã)

vì tôm bố mẹ được bắt tự nhiên ngoài biển Bệnh của tôm xuất phát từ tôm bố mẹhoang dã, truyền cho tôm giống trong các trại sản xuất, sau đó những con tôm giống

này được thả vào các trang trại nuôi tôm Sự lây lan dịch bệnh chính là trở ngại và nỗi

lo lớn cho sự phát triển của ngành công nghiệp sản xuất giống tôm lúc này Để đối phóvới những vấn đề dịch bệnh chủ yếu do IHHNV (nhân tố nguyên nhân của hội chứng

dị dạng, còi cọc tôm ở Mỹ vào cuỗi những năm 1980), một chương trình phát triển tôm

thẻ chân trắng (P vannamei) SPF đã được khởi xướng năm 1989 từ Bộ nông

nghiệp Hoa Kỳ (United States Department of Agriculture - USDA) Chương trình nàytiếp tục và đã được một số các doanh nghiệp thương mại hầu hết đặt tại Hawaii mởrộng ra Thời điểm đó, Mỹ đã nghiên cứu và thành công trong việc gia hóa tôm thẻchân trắng Thái Bình Dương Sự phát triển của tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (SPF) ở

Mỹ đã dẫn đến sự gia tăng mạnh mẽ việc sản xuất tôm tại nước này, đồng thời mở ramột bước ngoặc lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản Sau thử nghiệm sản xuất ban đầu,năm 1992 toàn bộ ngành công nghiệp nuôi tôm của Mỹ sử dụng con giống tôm thẻchân trắng sạch bệnh được sản xuất từ tôm thẻ chân trắng bố mẹ sạch bệnh ở Hawaii

Sự phát triển dòng tôm thẻ chân trắng sạch bệnh tại Mỹ dẫn đến việc áp dụng nhanhchóng loại tôm này từ các nước bán cầu Tây đến châu Á Sự gia hóa và chọn giốngtôm thẻ chân trắng đã cải thiện đáng kể về kinh tế và độ tin cậy của nghề nuôi tôm.Chính điều này đã khiến châu Á chuyển hướng sang tôm thẻ chân trắng dựa trên lợinhuận từ nuôi tôm thẻ chân trắng cao hơn nhiều lần so với tôm sú

Đến năm 1996, Hội chứng Taura (TSV) xuất hiện ở Trung Mỹ và gây thiệt hại chobang Texas khiến ngành công nghiệp sản xuất tôm sụt giảm 50% Trước tình hình đó,người nuôi tôm đã yêu cầu các nhà nghiên cứu phát triển loài tôm kháng lại virus này

và đã có nhiều công trình nghiên cứu được thực hiện ngay sau đó High HealthAquaculture (HHA), một đơn vị đứng đầu thế giới về gia hóa tôm và khoa học chọngiống, đã thành công đầu tiên trong chương trình chọn giống này HHA đã sử dụng kếthợp gia đình, sự chọn lựa trong gia đình và dòng lai để tạo ra những con giống sạchbệnh vừa tăng trưởng nhanh vừa kháng virus TVS cho TTCT vào năm 1997 Đến nay

đã có 10 thế hệ đã được chọn lọc thành công Những dòng tôm SPF tiên tiến nàythường được sử dụng ở Thái Lan và Indonesia (Lược dẫn từ bài viết Domestication ofPacific White shrimp revolutionizes Aquaculture của Tiến sỹ Jim Wyban trên tạp chí

“Global Aquaculture Advocate”, 2007)

Hiện nay, nguồn tôm bố mẹ chính của Việt Nam được nhập từ Mỹ (Hawai,Florida), Singapore (SIS), Ấn Độ và Trung Quốc, trong đó nổi bật nhất vẫn là cơ sởnghiên cứu NELHA (Natural Energy Laboratory of Hawaii Authority) (Hawai) và SIS(Singapore) SIS là một phần của Shrimp Improvement Systems Group Pte, Ltd có trụ

sở ở Singapore, nguồn cung lớn nhất thế giới về tôm giống chọn lọc, tôm giống sạchbệnh, với cơ sở hoạt động tại Hawaii, Florida, Singapore và India Hơn 40% tôm giốngđược bán bởi SIS đến từ cơ sở tại Hawaii SIS cũng phát triển sản xuất tôm xanh Thái

Bình Dương (Litopenaeus stylirostris) sạch bệnh, giống tôm hiện đang được lựa chọn.

SIS hiện nay tạo ra lượng tích trữ vượt qua 9,5 triệu USD từ lượng tôm giống thươngmại

Hiện nay trên thế giới, các nước đã thành công trong việc ứng dụng công nghệchọn lọc gen trong sản xuất tôm chân trắng bố mẹ sạch bệnh/kháng bệnh như: Mỹ,Mexico, Ecuador, Peru, Panama, Úc, Trung Quốc, Ấn độ Các nước đang triển khaichương trình chọn lọc gen này là Đài Loan, Brasil, Thái Lan, Malaysia, Indonesia Tuyvậy, có rất ít thông tin mức độ thành công đối với từng loại bệnh và các chi tiết liênquan đến quy trình công nghệ chọn lọc gen trên đối tượng này Một công trình nghiên

cứu khác của Moss et al (2007) có liên quan đến chương trình này cho thấy hệ số cận

huyết lớn hơn 10% có thể ảnh hưởng đến khả năng chống chịu của các dòng tôm chântrắng kháng bệnh (TSV và WSSV) từ 8,3% đến 38,7% Ở Mexico, chương trình chọnlọc gen sản xuất các dòng tôm chân trắng kháng bệnh từ những năm 1998 cũng chothấy sự gia tăng rõ rệt (2,6 lần) về tỉ lệ sống của các cá thể tôm đối với khả năng chống

chịu bệnh (Castillo-Juárez et al., 2015) Sự thành công của các chương trình chọn

giống sử dụng công nghệ chọn lọc gen đã thúc đẩy các quốc gia khác tham gia vàoviệc sản xuất các dòng tôm sạch bệnh, kháng bệnh trong những năm gần đây Một sốcông trình nghiên cứu ở Trung Quốc đã công bố thành công trong việc thiết lập bản đồ

liên kết gen của tôm chân trắng cho tính trạng tăng trưởng (Du et al., 2010; Yu et al.,

2015) và tạo ra nguồn vật liệu di truyền của quần đàn tôm chân trắng cho các nghiêncứu về sau Ấn Độ cũng đã nghiên cứu và sản xuất thành công tôm thẻ chân trắng bố

mẹ sạch bệnh do Trung tâm Nuôi trồng Thủy sản Rajiv Gandhi (RGCA) ở Tamil Naduthực hiện Đến nay, Ấn Độ đã chủ động được nguồn tôm giống chất lượng cao và đẩymạnh nuôi và xuất khẩu loài tôm này Trong một hội thảo của Hiệp hội Thủy sản Toàn

cầu vào năm 2013, nhóm nghiên cứu của Trường Đại học James Cook (Úc) đã giớithiệu các phương pháp mới liên quan đến kỹ thuật giải trình tự, nhằm giảm chi phí chonhà đầu tư, cũng như các phương pháp kỹ thuật phân tích di truyền số lượng giúp tănghiệu quả chọn lọc trong các chương trình chọn giống tôm chân trắng

2.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, tôm thẻ chân trắng không phải là loài bản địa nên phải đến năm 2003một số công trình nghiên cứu mới được triển khai Tuy nhiên, mới chỉ tập trung vàolĩnh vực tạo quy trình sản xuất giống sạch bệnh, nuôi thương phẩm Nghiên cứu pháttriển tôm bố mẹ thẻ chân trắng chỉ được chú ý trong những năm gần đây Viện Nghiêncứu Nuôi Trồng Thủy sản I, III, Công ty Giống thủy sản Minh Phú và Tập đoàn Việt -

Úc đã tiến hành nghiên cứu gia hóa tôm bố mẹ, nhập một số đàn tôm vật liệu ban đầu

từ các nước như Mỹ, Mexico, Ecuador, Columbia, Thái Lan và thử nghiệm lai chéogiữa các dòng tôm, đánh giá tuyển chọn tạo quần đàn vật liệu

Công ty thủy sản Việt Úc với sự hỗ trợ kỹ thuật từ Australia và các chuyên giatrong nước đã chọn tạo thành công đàn tôm thẻ chân trắng thế hệ G3 và được Bô Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn công nhận giống thủy sản mới Hàng năm sản xuấtđược khoảng 10000 con tôm thẻ bố mẹ chân trắng phục vụ cho nhu cầu của doanhnghiệp Công ty Minh Phú đã và đang triển khai nhập vật liệu di truyền từ các nước đểchọn tạo tôm bố mẹ theo hướng kháng bệnh

Năm 2009 -2011, Viện nghiên cứu NTTS I đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng

dụng công nghệ sinh học sản xuất tôm chân trắng bố mẹ sạch bệnh (SPF)” do Ths Vũ

Văn In làm chủ nhiệm đề tài với những kết quả rất thành công Đề tài đã tuyển chọn vànuôi tôm bố mẹ hậu bị SPF từ đàn tôm thương phẩm, xác định tiêu chuẩn lựa chọntôm bố mẹ sạch bệnh và đưa ra được quy trình công nghệ sản xuất tôm bố mẹ SPF(sạch 5 loại bệnh: TSV, IHHNV, WSSV, NHP và YHV) Năm 2011, đề tài đã sản xuấtđược 4700 cặp tôm bố mẹ chất lượng cao đảm bảo sạch 5 loại bệnh với tỷ lệ tham gia

đẻ trứng đạt 75%, sức sinh sản trung bình đạt 150.000 trứng/tôm cái và tỷ lệ nở đạt70%

Năm 2012-2015, Viện I tiếp tục triển khai đề tài “ Ứng dụng di truyền số lượng và

di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm chân trắng theo tính

trạng tăng trưởng” Kết quả đề tài đã đánh giá được hiệu quả chọn lọc theo tính trạng

sinh trưởng (chiều dài và khối lượng) qua các thế hệ, đánh giá được tương tác môitrường và kiểu gen lên tính trạng sinh trưởng ở các vùng sinh thái khác nhau: miềnBắc và miền Trung Về tôm bố mẹ đã chọn tạo được đàn tôm chọn giống nâng caosinh trưởng thế hệ thứ nhất gồm 1500 con tôm chân trắng bố mẹ (1000 concái>50g/con và 500 tôm đực >40g/con), đàn tôm chọn giống có hệ số di truyền h2 =0.25, hiệu quả chọn lọc tăng 7%

Giai đoạn 2 từ năm 2014-2018 Viện I tiếp tục chủ trì thực hiện đề tài”Nghiên cứuphát triển và ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo tôm chân trắng bố mẹ tăng trưởngnhanh” (nay Viện III chủ trì) kết hợp phương pháp chọn giống truyền tống với sử dụngcông nghệ AND, dự kiến đến 2018 sẽ tạo được đàn tôm chọn giống thế hệ thứ 4, hệ số

di truyền h2>0,25, hiệu quả chọn lọc >7 %/1 thế hệ

Năm 2013-2015,Viện nghiên cứu NTTS I triển khai dự án” Phát triển giống tôm

bố mẹ tôm chân trắng” Dự án đã thu được những kết quả :Nhập nội và lưu trữ được

12 đàn tôm bố mẹ ( ngồn gốc từ Mỹ, Thái lan, Singapore, Indonexia, Mexico,Ecuador, Colombia), 200 cặp tôm bố mẹ/ 1 đàn tôm, tỷ lệ giới tính 1 đực 1 cái, cỡ tôm

>30 g/ con; Tạo các tổ hợp lai cùng dòng và khác dòng, qua dó xác dịnh các tổ hợp lai

có sinh trưởng nhanh, tỷ lệ sống cao là các tổ hợp lai khác dòng được tạo ra từ các đàntôm bố mẹ SIS, CP, Mexico và Ecuado

Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản III (RIA III) ở Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã thực hiện “Nghiên cứu quy trình

công nghệ sản xuất giống và cơ sở khoa học phục vụ quy hoạch vùng nuôi tôm he chân trắng Litopenaeus vannamei” chủ nhiệm đề tài là Ths Đào Văn Trí Đề tài đã đề

xuất được quy trình công nghệ sản xuất giống; quy trình công nghệ nuôi thương phẩm;cho đẻ khép kín vòng đời Viện III đã lai tạo thành công đàn tôm bố mẹ (F1) có nguồngốc từ Hawaii và đã tạo ra được đàn giống tôm thẻ chân trắng có chất lượng cao vớitên gọi F1-V3-VN Theo Viện III, đàn tôm bố mẹ này được nhập trực tiếp từ Viện Hảidương học Hawaii Sau đó, nuôi thuần hóa và cho lai chéo giữa các cặp bố mẹ này,qua nhiều lần tuyển chọn đã tạo ra giống tôm chân trắng có tên gọi F1-V3-VN Quathời gian nghiên cứu đặc tính sinh sản của đàn tôm bố mẹ mới này, cho thấy chúng cómột số đặc điểm nổi trội như khả năng sinh sản tương đối ổn định và số lượng trứng

cũng nhiều hơn so với đàn tôm bố mẹ nguyên thủy nhập từ Hawaii (mỗi lần đẻ từ200.000 - 230.000 trứng, trong khi đó tôm nhập trực tiếp từ Hawaii đẻ từ 170.000 -190.000 trứng) Thời gian qua Viên III đã tạo ra được 6.000 cặp tôm bố mẹ F1-V3-

VN, tuy nhiên chỉ cho 2.850 cặp sinh sản tại các Trung tâm giống của Viện III, sảnxuất được 1,831 tỷ nauplius (giai đoạn sau trứng nở) nhưng chỉ thả nuôi 102 triệunauplius Từ nguồn tôm giống F1-V3-VN cho sinh sản thành công, Viện III đã triểnkhai nuôi thử nghiệm tại 24 hộ ở các tỉnh miền Trung có diện tích 27,2 ha với 59 aonuôi, lượng tôm chân trắng thả là 34,1 triệu con Đến nay, toàn bộ diện tích tôm F1-V3-VN nuôi thử nghiệm đều thu hoạch Theo dõi cho thấy, tỷ lệ sống của tôm qua thờigian nuôi thành thục và cho đẻ của tôm đạt 93,3% Đặc biệt các mẫu kiểm dịch giốngtôm F1-V3-VN đều không có dấu hiệu bị nhiễm 6 loại bệnh TSV, WSSV, MBV,IHHNV, BP, IHBMV Trong khi đó giá thành của tôm giống F1-V3-VN chỉ bằng 50%

so với tôm nhập từ Thái Lan và bằng 30% so với tôm giống bố mẹ nhập trực tiếp từHawaii

Mặc dù tình hình dịch bệnh trên tôm chân trắng đang rất phức tạp tại các tỉnhmiền Trung nhưng trong số 59 ao nuôi tôm F1-V3-VN thì có 54 ao nuôi không pháthiện bệnh, chiếm 89,25%, các ao còn lại có nhiễm và được xác định là do yếu tố môitrường Thời gian nuôi thử nghiệm từ ngày thả giống đến khi thu hoạch tại các mô hình

là 78 ngày, kích cỡ tôm khi thu hoạch đạt 99 con/kg, hệ số thức ăn bình quân của các

mô hình là 1,11 Năng suất bình quân khoảng 11 tấn/ha, lãi bình quân của các mô hình

là 150 triệu đồng/ha Với những kết quả ban đầu, Viện III đã kiến nghị Bộ cho phépphát triển đàn tôm chân trắng bố mẹ F1-V3-VN thành sản phẩm hàng hoá phục vụ chonghề nuôi tôm chân trắng tại Việt Nam Tuy nhiên đại diện Chi cục Nuôi trồng Thuỷsản Khánh Hoà đánh giá: Giống tôm của Viện III lai tạo ra mới đưa vào sản xuất thửnghiệm 1 vụ, mô hình làm thử nghiệm nuôi thương phẩm lại không có đối chứng vớicác giống tôm khác Do vậy để có kết quả chính xác và có giống tốt đề nghị Viện IIItiếp tục khảo nghiệm và tiếp tục nghiên cứu thêm để hoàn thiện quy trình kỹ thuật.Như vậy, cho đến nay ở Việt Nam, việc nghiên cứu tôm chân trắng bố mẹ mới chỉdừng lại ở sản phẩm sạch bệnh (SPF), có khả năng tăng trưởng tốt và đang trong quátrình hoàn tất thủ tục thương mại hóa, chưa tạo ra các dòng tôm bố mẹ kháng bệnh để

có thể giải quyết một cách hiệu quả các khó khăn do tình hình dịch bệnh gây cho

ngành công nghiệp nuôi tôm chân trắng Dù vậy, với những kết quả đã đạt được cũng

sẽ tạo ra một sự cạnh tranh lành mạnh hơn cho thị trường tôm bố mẹ sạch bệnh ở ViệtNam Có thể nói đây là bước tiến mới đem lại hi vọng cho ngành sản xuất tôm giống ởnước ta trong tương lai với mong muốn cung ứng đa số nhu cầu tôm bố mẹ trongnước, giảm bớt sự lệ thuộc vào nước ngoài

2.4 Tình hình dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng

2.4.1 Dịch bệnh trên tôm nuôi

Dịch bệnh trên tôm nuôi ngày càng diễn biến phức tạp với nhiều bệnh mới xuấthiện gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cũng như đe dọa đến sự phát triển bền vững củanghề nuôi tôm trên toàn thế giới, trong đó có Việt Nam Theo báo cáo của Cục Thú y,

từ ngày 01/01- 11/8/2016, cả nước đã có 51.689,65 ha diện tích nuôi tôm nước lợ bịthiệt hại (tăng 54,9% so với cùng kỳ năm 2015), chiếm 8,08% tổng điện tích nuôi tômtrên cả nước (số liệu diện tích thả nuôi do Tổng cục Thủy sản cung cấp đến hết25/07/2016 là 639.700 ha) Trong đó, diện tích nuôi thâm canh, bán thâm canh thiệthại là 10.211,68 ha; quảng canh, quảng canh cải tiến 29.273,06 ha; 11.972,25 ha làtôm lúa và 232,66 ha nuôi kết hợp

Trong 8 tháng đầu năm 2016, tổng diện tích nuôi tôm bị thiệt hại tăng mạnh, tuynhiên, diện tích thiệt hại do dịch bệnh trên tôm nuôi giảm so với cùng kỳ năm 2015 về

cả phạm vi và diện tích Trong đó, diện tích tôm nuôi bị bệnh là 6.746,74 (giảm32,21% so với cùng kỳ năm 2015), diện tích không xác định nguyên nhân là 7.303.94

ha, biến đổi môi trường, thời tiết 37.858,51h do tình hình xâm nhập mặn và hạn hánkéo dài

Theo số liệu thống kê thì bệnh đốm trắng (WSSV) và bệnh hoại tử gan tụy cấp(AHPND) là hai bệnh gây thiệt hại lớn nhất đối với ngành nuôi tôm nước lợ so với cácbệnh khác còn lại

2.4.1.1 Dịch bệnh đốm trắng

Về phạm vi: Tính đến 8/ 2016 dịch bệnh xảy ra tại 229 xã, 75 huyện, thị xã thuộc

24 tỉnh, thành phố: Hải Phòng, Thanh Hóa , Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, QuảngTrị, Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, TP Hồ Chí

Minh, Ninh Thuận, Bà Rịa - Vũng Tàu, các tỉnh Vùng đồng bằng sông Cửu Long(Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang và Cà Mau) TràVinh có diện tích bị bệnh lớn nhất (chiếm gần 26,41%tổng diện tích bị bệnh của cảnước) sau đó đến Kiên Giang, Bạc Liêu và các địa phương khác.

Về mức độ: Diện tích nuôi tôm bị bệnh đốm trắng là 2.371 ha chiếm 0,37% tổngdiện tích thả nuôi So với năm 2015, bệnh tăng về phạm vi nhưng diện tích bệnh giảm

Cụ thế số xã có tôm bị bệnh tăng 2,23% nhưng diện tích bệnh giảm 45,55%

Về thời gian: Dịch bệnh xuất hiện ở tất cả các tháng trong năm, nhưng tập trungnhiều vào các tháng có mùa vụ thả nuôi chính

Về đối tượng mắc bệnh: Bệnh xảy ra trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng, tậptrung chủ yếu giai đoạn tôm từ 10-130 ngày tuổi sau thả Diện tích nuôi tôm thẻ bịbệnh là 1.274,35 ha, tôm sú bị bệnh là 1.096,83 ha

Về phương thức nuôi tôm: Tính đến11/0 8/2016 thì diện tích nuôi thâm canh, bánthâm canh bị thiệt hại (1.698,27 ha), quảng canh, quảng canh cải tiến bị thiệt hại(524,54 ha), tôm lúa là 19,65 ha và tôm xen cua là 128,72 ha

2.4.1.2 Bênh hoại tử gan tụy cấp

Về phạm vi tại Việt Nam, dịch bệnh được báo cáo xuất hiện từ cuối năm 2010 tạitỉnh Sóc Trăng, sau đó dịch bệnh đã lây lan và xuất hiện ở hầu hết các địa phươngtrọng điểm về nuôi tôm trong phạm vi cả nước Tính đến 11/08/2016 bệnh xảy ra tại

258 xã, 76 huyện , thị xã thuộc 24 tỉnh, thành phố: Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An,

Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, PhúYên, Khánh Hòa, TP Hồ Chí Minh, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bà Rịa- Vũng Tàu,Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang và CàMau) Bệnh xuất hiện tại tất cả các vùng nuôi tôm trọng điểm như: Sóc Trăng, BạcLiêu, Cà Mau, Trà Vinh và Kiên Giang Tỉnh Sóc Trăng có diện tích bị bệnh lớn nhất(chiếm gần 28,15% tổng diện tích bị bệnh của cả nước) sau đó đến Trà Vinh, Bạc Liêu

và các địa phương khác

Về mức độ: Tổng diện tích tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp là 3.641,06 ha; chiếm0,57% diện tích thả nuôi So với năm 2015, bệnh giảm về phạm vi và diện tích bệnh

Cụ thế số xã có tôm bị bệnh giảm 0,77% và diện tích bệnh giảm 41,54%.

Về đối tượng mắc bệnh: Bệnh xảy ra trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng, tậptrung chủ yếu giai đoạn tôm từ 2 đến 127 ngày tuổi sau thả, bệnh xuất hiện ở tất cả cáctháng trong năm Diện tích tôm thẻ bị bệnh là 2.241,12 ha; tôm sú bị bệnh là 1.399,94ha

Về phương thức nuôi tôm: Tính đến11/0 8/2016 thì diện tích nuôi thâm canh, bánthâm canh bị thiệt hại 3.058,71 ha), quảng canh, quảng canh cải tiến bị thiệt hại(416,81 ha), tôm lúa là 66,1 ha và tôm xen cua là 98,74ha, tôm xen cá là 0,7 ha

2.4.1.3 Nguyên nhân khác:

Bệnh đỏ thân: 439,49 ha nuôi tôm bị bệnh tại Trà Vinh (59,04 ha), Bình Thuận (3

ha), Khánh Hòa (0,6 ha), Cà Mau (376, 85 ha)

Bệnh phân trắng: 139, 6 ha tôm nuôi bị bệnh tại Trà Vinh (5 8 ha), Bạc Liêu (87ha), Bình Thuận 1,5 ha; Cà Mau 0,8 h; Khánh Hòa 0,8 ha; Nghệ An 1,8 ha; QuảngNgãi 41,7 ha

Bệnh đường ruột: 55,45 ha tôm nuôi bị bệnh tại Trà Vinh 53,55 ha; Huế 1,9 ha

Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV): 26,6 ha tôm nuôi bị bệnh tai

Bến Tre 9,26 ha; Cà Mau 0,4 ha; Bà Rịa- Vũng Tàu 1,95 ha; Ninh Thuận 0,8 ha; SócTrăng 14 ha, TP Hồ Chí Minh 0,45 ha

Bệnh còi: 70,65 ha tôm nuôi bị bệnh: tại Binh Thuận 10,3 ha; Kiên Giang 56 ha;

Bà Rịa –Vũng Tàu 2,85 ha và Trà Vinh 1,5 ha

Bệnh vi bào tử trùng (EHP): 2,45 ha ôm nuôi bị bệnh: tại Quảng Ninh 0,5 ha; Ninh

Thuận 1,95 ha

Do môi trường, thời tiết: 37.858,51 ha bị thiêt hại: Thanh Hóa 16,7 ha; Huế 0.5 ha;Bình Định 3,95 ha; Phú Yên 48,7 ha; Quàng Ngãi 8,73 ha; Khánh Hòa 8 ha; LongAn237,35 ha; Trà Vinh 69,9 ha; Sóc Trằng3.301,44 ha; Bạc Liêu 994,7 ha; CàMau19.866,16 ha; Kiên Giang13.302,38 ha

Không rõ nguyên nhân: 7.303,94 ha tôm nuôi bị thiệt hại nhưng địa phương khônglấy mẫu để xác định nguyên nhân: Nghệ An 93,37 ha, Quảng Bình 5,86 ha; Huế 24,14

ha; Bình Thuận 3,75 ha; Bến Tre 1,65 ha; Long An 279,61 ha; Trà Vinh 2,15 ha; BạcLiêu 90,5 ha; Cà Mau 6.802,91 ha.

2.4.2 Tình hình kiểm dịch tôm giống và tôm bố mẹ chân trắng nhập khẩu

Theo Thông tư 26/2013/TT-BNNPTNT, tôm thẻ chân trắng là đối tượng thủy sảnchủ lực của Việt Nam nên Tổng cục Thủy sản là đơn vị thực hiện kiểm tra chất lượngtôm bố mẹ nhập khẩu Trong năm 2016, Tổng cục Thủy sản đã cử các đoàn phối hợpvới các địa phương kiểm tra chặt chẽ chất lượng tôm bố mẹ nhập khẩu tại các cơ sởnhập khẩu tôm giống bố mẹ Tổng cục thủy sản đã tiến hành kiểm tra 147.494 con tômthẻ chân trắng bố mẹ được các cơ sở trên cả nước nhập khẩu chủ yếu từ các nước như:

Mỹ, Singapo, Thái Lan, Mexico…Hầu hết các cơ sở đã nhập khẩu nguồn giống tômthẻ chân trắng bố mẹ có chất lượng cao với nguồn gốc rõ ràng

Kết quả xét nghiệm phát hiện mầm bệnh theo báo cáo của Cục Thú y tại Hội nghịquản lý giống tôm nước lợ tại Bình Thuận ngày 15/08/2016 :

Tôm bố mẹ: Chủ yếu nhập khẩu từ Mỹ, Singapore, Thái Lan và Mexico (năm

2014: 264.388 con, năm 2015: 187.000 con) Kết quả kiểm dịch không phát hiệndương tính với các bệnh kiểm dịch trong năm 2014, 2015 và 6 tháng đầu năm 2016

 Năm 2015: Phát hiện 2 lô dương tính với bệnh trắng đuôi, xử lý têu hủy950.000 con

 6 tháng đầu năm 2016: Không phát hiện lô tôm nào dương tính với bệnh kiểmdịch

2.4.3 Tình hình giám sát dịch bệnh 2014-2015

Từ 2014-2015, Cục Thú Y đã phối hợp cùng với các địa phương tổ chức triển khai

giám sát chủ động đối với bệnh đốm trắng, hoại tử gan tụy trên tôm nuôi nước lợ tạicác tỉnh: Quảng Ninh, Nam Định, Hà Tĩnh, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bến Tre, SócTrăng, (Công văn 1846/TY-TS của Cục Thú Y ngày 17/10/2014 và Công văn số381/TY-TS ngày 6/3/2015).

Tổng số đã lấy 8 907 mẫu tôm, mẫu nước, mẫu bùn, mẫu giáp xác, mẫu thức ăntại 169 cơ sở nuôi tôm thương phẩm (5.764 mẫu) tại 5 Tỉnh Quảng Ninh, Nam Định,

Hà Tĩnh, Bến Tre, Sóc Trăng và 60 cơ sở sản xuất tôm giống (3.143 mẫu) tại 2 tỉnhNinh Thuận, Bình Thuận Kết quả xét nghiệm phát hiện:

Tại các cơ sở sản xuất tôm giống:

 Tổng số có 41/60 (68%) cơ sở dương tính với bệnh hoại tử gan tụy, trong đó27/30 (90%) số cơ sở tại Ninh Thuận dương tính và 14/30 (47%) số cơ sở tạiBình Thuận dương tính

 141/3.143 (4,9%) mẫu nhiễm mầm bệnh vibrio parahaemolyticus; đây là nguồnlàm phát tán, lây lan mầm bệnh đi nhiều địa phương, nhưng trước đây chưađược khẳng định bằng số liệu giám sát; không có mẫu nào dương tính với mầmbệnh đốm trắng

Tại các cơ sở nuôi thương phẩm: 309/4.456 (6,93%) mẫu của 91/169 (53,84%)

cơ sở dương tính với hoại tử gan tụy cấp; 12/1.166 (1,03%) mẫu của 11/137 (8,03%)

cơ sở dương tính với bệnh đốm trắng

Ngoài ra, Cục Thú Y cũng đã chỉ đạo cơ quan thú y vùng VI tổ chức lấy mẫu vàxét nghiệm bệnh vi bào tử tại Ninh Thuận, Bình Thuận, Bến Tre Kết quả:

 Ninh Thuận: khảo sát 12 cơ sở giống và 12 mẫu tôm post, phát hiện 3 cơ sở với

3 mẫu dương tính với EHP, chiếm 25%

 Binh Thuận: khảo sát 18 cơ sở giống và 31 mẫu tôm post, phát hiện 3 mẫu của

3 cơ sở dương tính với EHP, chiếm 16,7%

 Bến Tre: phát hiện vi bào tử trùng trong 11/30 hộ nuôi tôm thương phẩm chiếm36,7% Trong đó xã An Đức phát hiện 4/10 hộ chiếm tỷ lệ 40 %, thị trấn BìnhĐại phát hiện 5/10 hộ chiếm tỷ lệ 50%, xã Mỹ An phát hiện 2/10 hộ chiếm20%

2.5 Con đường lan truyền bệnh trên động vật thủy sản

Bệnh trên động vật thủy sản lây truyền theo 2 con đường: lây theo chiều dọc hoặclây nhiễm ngang (bằng cách lây trực tiếp hay gián tiếp)

Lây theo chiều dọc: Truyền lây cảm nhiễm từ bố mẹ sang con Trong cơ chế

truyền dọc, mầm bệnh cảm nhiễm được truyền sang con qua trứng hoặc trong quá trìnhsinh sản, tiếp xúc với con mẹ sau khi sinh

Ví dụ:

Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm (White Spot Syndrome Virus (WSSV)) lây

nhiễm dọc từ tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh truyền virus sang tôm con, noãn bào tôm

bị nhiễm virus đốm trắng thì không thành thục được,nhưng trong quá trình tôm mẹ

đẻ trứng có thể thải ra môi trường có virus đốm trắng do đó ấu trùng tôm bị nhiễmvirus

Sự lây truyền HPV (Hepatopancreatic Parvovirus) xảy ra theo chiều dọc và

chiều ngang (Lightner và Redman, 1992) Theo Bùi Quang Tề (2000), HPV chỉlây theo chiều ngang, không lây theo chiều dọc Nhưng ở Ấn Độ thì tỷ lệ nhiễmkép HPV trên tôm giống cùng với sự xuất hiện của MBV và WSSV dẫn đến tỷ lệchết cao trên tôm giống được báo cáo bởi Umesha et al (2003), có thể chứng minh

HPV lây nhiễm theo chiều dọc (Trích từ KLTN của Trần Quốc Trung Tuân, Đại

Học Cần Thơ, 2007).

Lây nhiễm ngang: Truyền lây giữa các cá thể trong một quần đàn mà không phải

từ bố mẹ sang con

 Bằng đường tiếp xúc trực tiếp: Động vật thủy sản khỏe mạnh sống chung

trong thủy vực cùng với động vật thủy sản mắc bệnh truyền nhiễm, do tiếpxúc trực tiếp, tác nhân gây bệnh truyền từ động vật thủy sản bệnh sang chođộng vật thủy sản khỏe Tôm còn sống sót sau giai đoạn dịch bệnh virus(Taura syndrome virus – TSV, Infectious hypodermal and hematopoieticnecrosis virus – IHHNV) có thể nguồn lan truyền virus cho các tôm khácnhạy cảm với bệnh (ThS Trần Thị Tuyết Hoa, ĐH Cần Thơ, 2015)

 Bằng đường tiếp xúc gián tiếp: đây là hình thức lây bệnh phổ biến thông

qua các yếu tố trung gian (nước, thức ăn, dụng cụ chăm sóc, phương tiệnđánh bắt và vận chuyển, con người…)

Do nước: Tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trong cơ thể động vật thủy sản

bị bệnh rơi vào môi trường nước và sống tự do trong nước một thời gian.Trong môi trường nước ao nuôi, sinh vật phù du được xác định có nhiễmvirus và làm tăng quá trình lây lan của virus trong hệ thống nuôi (Walker etal., 2011; Zhang et al., 2006; 2007; 2008) Nếu lấy nước có nguồn bệnh vàothủy vực nuôi thủy sản, tác nhân gây bênh sẽ lan cho động vật thủy sảnkhỏe mạnh

Do dụng cụ đánh bắt và vận chuyển động vật thủy sản: Khi vận chuyển

hoặc đánh bắt động vật thủy sản bênh, tác nhân gây bệnh có thể bám vàodụng cụ, nếu dùng dụng cụ này để đánh bắt hoặc vận chuyển động vật thủysản khỏe thì không những nó làm lây lan bệnh cho động vật thủy sản màcòn phát tán ra môi trường

Mầm bệnh truyền nhiễm từ đáy ao: Cùng với các chất hữu cơ tồn tại ở

đáy ao, tác nhân gây bệnh từ động vật thủy sản mắc bệnh truyền nhiễm, từxác động vật thủy sản chết do bị bệnh rớt xuống đáy ao và tồn tại ở đó mộtthời gian Qua đó, chất thải từ sinh vật mang mầm bệnh này sẽ là nguồn lâylan của bệnh virus trong hệ thống nuôi Nếu ao không được tẩy dọn và phơiđáy kỹ trước khi tiến hành ương nuôi thủy sản, tác nhân gây bệnh từ đáy ao

đi vào nước rồi xâm nhập gây bệnh truyền nhiễm cho động vật thủy sản

Ví dụ:

Bệnh còi do virus đa diện có nhân Baculovirus Penaei (BP) và MonodonBaculovirus (MBV) lây truyền do virus có trong phân của tôm bị nhiễm bệnh.Bệnh virus hoại tử tuyến ruột giữa (baculoviral mid-gut gland necrosis –BMN) được thải ra cùng với phân vào môi trường nước và làm lây lan mầmbệnh này trong hệ thống nuôi thâm canh tôm he Nhật Bản (FAO FisheriesTechnical Paper 402/2)

Do động vật thủy sản di cư: Động vật thủy sản bị bệnh di cư từ vùng nước

này sang vùng nước khác, tác nhân gây bênh truyền nhiễm vào vùng nướcmới, gặp lúc điều kiện môi trường thay đổi không thuận lợi cho đời sốngcủa động vật thủy sản, tác nhân gây bênh xâm nhập vào cơ thể động vậtthủy sản khỏe làm cho động vật thủy sản mắc bệnh

Do chim và các sinh vật ăn động vật thủy sản: Chim, cò, rái cá, chó,

mèo,… bắt động vật thủy sản bị nhiễm bệnh làm thúc ăn Tác nhân gâybệnh truyền nhiễm có thể bám vào chân mỏ, miệng, vào cơ thể của chúng,khi những động vật này di chuyển tới vùng nước khác thì tác nhân gây bệnhtruyền nhiễm từ chúng cò thể đi vào nước, chờ cơ hội thuận lợi chúng sẽxâm nhập vào cơ thể động vật thủy sản khỏe ở vùng nước mới và gây bệnhtruyền nhiễm

Các côn trùng thủy sinh và một số loài chim tham gia vào việc lan truyền bệnhvirus trong hệ thống nuôi tôm Côn trùng thủy sinh Trichocorixa reticulata(Corixidae) ăn tôm chết và chúng bay từ ao này qua ao khác làm lây lan TSV giữacác ao nuôi Phân của chim mòng biển (Larus atricilla) được lấy ở quanh các ao bịnhiễm TSV trong đợt dịch bệnh đỏ đuôi ở Texas năm 1995 đã phát hiện có chứanhóm TSV này (OIE, 2009)

2.6 Chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản

2.6.1 Các phương pháp chẩn đoán bệnh

Trước tình hình diễn biến phức tạp của dịch bệnh trên tôm cùng với sự xuất hiệnnhiều dịch bệnh mới đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm, cácquốc gia ngày càng quan tâm đến việc phát hiện, chẩn đoán sớm bệnh trên tôm nhằmgiảm đưa ra những biện pháp ngăn chặn kịp thời nhằm giảm thiệt hại tới mức thấpnhất cho người nuôi

2.6.1.1.Phương pháp chẩn đoán truyền thống:

Dựa vào kinh nghiệm nuôi như theo dõi, quan sát sự thay đổi màu sắc, mùi vị củanước trong ao nuôi Khi tôm trong ao bị nhiễm bệnh, nước nuôi thường đục, có mùihôi thối, độ chua của nước tăng…

Dựa vào cá triệu chứng lâm sàng của tôm khi bị nhiễm bệnh, các triệu chứng kém

ăn, bơi lờ đờ gần mặt nước, màu sắc vỏ thay đổi… Ví dụ tôm bị bệnh đốm trắng thânxuấtt hiện các đốm màu trắng

Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm:

- Không chính xác và thường xác định được bệnh khi tôm đã bị bệnh nặng hoặc

- Dễ nhầm lẫn các bệnh với nhau nên dễ dẫn đến sai lầm trong phòng trị.

2.6.1.2 Phương pháp chẩn đoán dựa vào đặc điểm mô bệnh học

Các mẫu tôm nghi bị nhiễm bệnh được xác định nhuộm tiêu bản hiển vi để xácđịnh hình dạng, cấu trúc bên ngoài và dựa vào các đặc điểm đó để phân loại các nhân

tố gây bệnh

a Kính phết huyết tương dùng để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diệncủa vi khuẩn và ký sinh trùng trong máu Những biến đổi như nhân bị co lại thường cóliên quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh đầu vàng Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tếbào chất là biểu hiện đặc trưng của sự nhiễm virus gây bệnh đầu vàng (yellow headvirus - YHV) Tuy nhiên sự vắng mặt của thể ẩn cũng không loại trừ trường hợp tôm

bị nhiễm virus Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong các trường hợp nhiễm khuẩn

Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy trong máu Có thểnhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram, nhuộm Wright hay nhuộmHeamatoxyline & Eosin (H&E)

b Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộmH&E có thể phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV),YHV và virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (InfectiousHypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus - IHHNV) Vi khuẩn gây bệnh đóngrong, nguyên sinh động vật, nấm mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được pháthiện bằng cách này

c Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ hay bất kỳ bộ phậnnào cần quan sát mà không làm chết tôm cho vào một giọt dung dịch 2.8% NaCl hoặcnước biển vô trùng, đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩndạng sợi, nguyên sinh động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường lànhóm Vibrio), nấm mycosis, diatom, tảo lục và cả mùn bả hữu cơ Ở những chổ bị đendưới vỏ hoặc trong cơ có thể dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kínhvới một giọt dung dịch 2.8% NaCl và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩngây bẩn, nguyên sinh động vật và nấm Furasium

Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiềutrường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này Tuy nhiên,

phương pháp này cũng có những hạn chế, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm màtrong nhiều trường hợp bệnh tôm cần phải được xử lý ngay trước khi có được kết quảxét nghiệm mô học, mức độ chính xác không cao do có nhiều loại vi khuẩn, virus tuy

có nhiều điểm giống nhau về hình thái nhưng hệ genome của chúng lại khác nhau.Phương thức mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường vàsức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh

2.6.1.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào sinh học phân tử

Phương pháp chẩn đoán nhanh nhạy, chính xác cao đang được các nước áp dụng làdựa vào sinh học phân tử Kỹ thuật PCR, RT-PCR, Real-time PCR… Ở nước ta,phương pháp này từ trước đây chưa được áp dụng rộng rãi do nhiều nguyên nhân trong

đó phải kể đến là việc đầu tư khoa học kỹ thuật còn chưa được quan tâm Tuy nhiênthời gian trở lại đây việc sử dụng kỹ thuật sinh học phổ biến hơn do có sự đầu tư đúngmức, được ứng dụng hữu hiệu và càng có uy tín với người nuôi tôm

2.6.2 Tìm hiểu về kỹ thuật PCR, RT-PCR

2.6.2.1.Khái niệm PCR, RT-PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction- Phản ứng chuỗi trùnghợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen" là một kỹ thuật phổ biến trong sinhhọc phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA nhờ thực hiện cơchế tự nhân đôi DNA invitro nhờ enzyme DNA polymerase Phương pháp này đượcKary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988

Phương pháp RT- PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là mộtphương pháp dùng để khuyếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên

mã ngược RT- PCR được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virusRNA Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗioligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) và DNA polymerase.Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA vàenzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA

Phản ứng PCR gồm các bước chủ yếu sau:

Bước 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95 0C trong vòng30giây đến 1 phút

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộcvào trình tự của primer, thông thường khoảng 55-65 0C có thể kéo dài từ 30-60 giây.Bước 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA được tiến hành ở 72 0C.Thờigian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đếnvài phút.

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên được lặp lại 30-40 lần

Hình 2.1 : Nguyên tắc của phản ứng PCR(Nguồn Phạm Thị Mỹ Hạnh, 2005)

2.6.2.2 Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR

Để phản ứng PCR xảy ra cần có:

 Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, khôngchứa DNAase, RNAase, enzim cắt giới hạn…Nói cách khác là không chứa bất kỳ mộtthành phần nào khác

độ nhạy cao, phản ứng rõ nét, phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng

độ MgCl2 thích hợp nhất

Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0.5-5 mM Chính ion Mg2+ gắn liên kết dNTPvới DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi Nồng độ MgCl2 cao sẽ tạonhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl2 quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR

 dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate)

Là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích, dNTP có cấu tạogồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là Adenine (dATP) hay Thymine(dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP) ở carbone số 1 (C1) Ba phân tửphosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này

và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên chuỗi DNA đích.Năng lượng để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu nănglượng của triphosphate trên dNTP Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP chứkhông phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP (monophosphate)

 Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn dài khoảng 20-30 bases có trình tự bổ sungvới hai đầu của đoạn DNA và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổnghợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầucủa DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các mồi này có chiều ngược nhau, baogồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer) Mồi là yếu tốquan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng Trong thử

nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính :

- Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng

đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà khôngthể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩmPCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu

- Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi

bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nóxúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

Dưới đây là một vài ví dụ về trình tự mồi được sử dụng cho phản ứng PCR pháthiện EMS, HPV, WSSV và gen trên tôm (beta- actin) tham khảo theo các tài liệu đãđược nghiên cứu và công bố, thứ tự là:

1 AP3F: 5’ - ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC - 3’

AP3R: 5’ -GTG GTA ATA GAT TGT ACA GAA - 3’(GS Tim Flegel và ctv,2014) Hiện nay trình tự mồi phát hiện bênh hoại tử gan tụy (EMS/ AHPND) nàyvẫn đang được nghiên cứu và tiếp tục hoàn thiện

2 H441F: 5’ - GCA TTA CAA GAG CCA AGC AG - 3’

H411R: 5’- ACACTCAGCCTCTACCTTGT - 3 ‘ (Phromjai et al, 2001)

3 1F: 5’ - ATC TGA TGA GAC AGC CCA AG - 3’

1R: 5’ - GGG AAT GTT AAA TAT GTA TCG - 3’ (Kim và ctv, 1998)

4 Beta - actin F: 5’-CAC CAA CTG GGA CGA CAT GG-3’

Beta -actin R: 5’- GGA GGC GTA CAG GGA GAG CA-3’ (Oanh, 2007)

 Enzim DNA polymerase (Taq)

Kết quả của phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzymepolymerase Enzim DNA polymerase xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,

T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp

DNA polymerase chịu nhiệt thường sử dụng cho phản ứng PCR là polymerase, đây là enzyme được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nóng

Taq-Thermus aquaticus Ngoài ra một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và

người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản

ứng PCR như Thermus lithoralis (Vent), Thermus thermophilus (rTth), Pyrococcus

furiosus (Pfu)

 DNA mẫu (DNA template)

Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu.DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khimẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tôt nhất đối với đoạn DNA dàikhoảng 1-1,5kb

Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiên kỹ thuật chuẩn đoán bằngphương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA không cần có độ tinhsạch cao, như vết máu khô, những mẫu vật khảo cổ Phương pháp này cho phép xácđịnh DNA với một lượng thấp, khoảng 100 ng

2.6.2.3 Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh

Kỹ thuật PCR hiện nay đươc sử dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau Theo Trần

Thị Tuyết Hoa (2004), kỹ thuật PCR được sử dung vào các lĩnh vực sau:

- Phát hiện các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá

thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống thủy sản và ương nuôi

- Chẩn đoán bệnh, điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết khi

dịch bệnh xảy ra, đồng thời đề ra hướng ngăn chặn sự xuất hiện của dịch bệnh

- Phòng bệnh và kiểm soát bệnh: kiểm tra tôm giống và tôm bố mẹ ở trại giống,

kiểm tra tôm nhập khẩu trước khi cho thả nuôi ở các địa phương

- Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu - sự nhiễm khuẩn

hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli

- Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây

bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản

Hiện nay một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm đựơc chẩn đoán bằngphương pháp PCR gồm có:

- Ở cá có virus gây bệnh trên cá nheo Mỹ (CCV), virus gây nhiễm trùng và hoại

tử cơ quan tạo máu (IHNV), virus gây xuất huyết và nhiễm trùng máu(VHNV), virus gây hoại tử thần kinh (VNNV)

- Ở tôm có virus đốm trắng (WSSV), HPV, virus gây bệnh đầu vàng (YHV),virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội

chứng Taura (TSV), nội ký sinh trùng và vi khuản đặc biệt là nhóm Vibrio gây

bệnh tôm chết sớm(EMS) ( Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).

2.6.2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về chẩn đoán bệnh trên tôm bằng ký thuật PCR

Trên thế giới, PCR (Polymerase Chain Reaction) đã được biết đến là một kỹ thuật

có độ nhạy và độ chính xác cao được ứng dụng cho việc chẩn đoán tác nhân virus, vikhuẩn gây bệnh trên tôm PCR cùng với những cải tiến mới như Nested PCR, RT-PCR, Real-time PCR, Multiplex PCR …là những phương pháp chuẩn mà Cơ quanQuốc tế về Dịch bệnh Động vật (OIE) đã công nhận và đang được sử dụng tại nhiềunước như Mỹ, Nhật Bản, Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc Có thể kể đến một sốcông trình nghiên cứu như: kiểm tra sự nhiễm vius WSSV từ các mẫu tôm mẹ và ấutrùng bằng kỹ thuật Nested PCR (Lo và ctv, 1996,1997,1998), phát hiện virus YHVbằng RT-PCR (Wongteerasupaya và ctv, 1997), phát hiện virus IMNV và IHHNV vớiviệc sử dụng kỹ thuật Nested RT-PCR (Poulos và ctv, 2006; Nunan và ctv, 2000) Ngoài ra, phương pháp chẩn đoán đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh bằng MultiplexRT-PCR cũng đã được phát triển và ứng dụng (Paisarn và ctv, 2008), một kỹ thuậtkhác Realtime PCR có khả năng định lượng số bản sao virus cũng đã được công bố(Kallaya và ctv, 2006; Priyanjalie và ctv, 2010) Từ 2013, một nhóm các nhà nghiêncứu ở Thái Lan và Đài Loan, đứng đầu là GS T.W Flegel và C.F Lo đã phát triểnphương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh gan tụy cấp AHPND/EMS trêntôm, các thông tin được công bố bao gồm trình tự mồi (primers) và cả qui trình chi tiếtcho việc phát hiện mầm bệnh bằng kỹ thuật PCR Đến khoảng tháng 6/2014, nhómnghiên cứu của GS Tim Flegel đã công bố một phương pháp PCR mới và cải tiến cóthể phát hiện chính xác 100% mẫu tôm nhiễm EMS/AHPND Phương pháp này dựatrên cặp mồi AP3 nên thường được gọi tắt là “AP3” Tháng 2/2015,nhóm nghiên cứucủa GS Flegel tiếp tục công bố phương pháp nested PCR (PCR hai bước) cải tiến mớigọi là “AP4” có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND có độ nhạy cao gấp

100 lần so với phương pháp cải tiến (AP3) đã được công bố Trước đó cũng đã có cócông bố về quy trình kiểm tra EMS trên tôm bằng kỹ thuật PCR từ Văn phòng chuyểngiao công nghệ của Đại học Arizona, nơi đầu tiên xác định được tác nhân gây bệnhnày