thuyết trình kỹ thuật PCR

TRƯỜNG ĐH CNTP TP HCM KHOA CNSH & KTMT KỸ THUẬT PCR L Ớ P : 11 C D S H GVHD: TRẦN HOÀNG NGÂU NHÓM: 10 Kỹ thuật PCR ? PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không cần phải sử dụng sinh vật sống Nguyên tắc PCR phản ứng nhân trình tự DNA ống nghiệm Phương pháp thực invotro với có mặt polymerase Sự khuếch đại nhờ chu trình nhiệt lặp lại enzyme DNA – PCR chuỗi phản ứng nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm giai đoạn: Biến tính: tách DNA từ mạch đôi thành mạch đơn Bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA từ DNA gốc Các thành phần cần cho thực phản ứng Thiết bị PCR Sợi khuôn DNA mẫu: đoạn acid nucleic đặc trưng vi khuẩn gây bệnh, gene bệnh lý… mà phản ứng PCR nhân lên để chúng phát dễ dàng Đoạn mồi (oligonucleotide primers): Là đoạn DNA đơn, có kích thước vài chục base (18-30) vai trò chính: 1) Quyết định nên tính đặc hiệu phản ứng PCR 2) Khởi động enzyme polymerase Taq polimerase (enzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus) Deoxyronucleotit triphotphate ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP) Dung dịch đệm ion Mg++ Hàm lượng cao tạo nhiều sản phẩm ký sinh, thấp làm giảm hiệu nhân enzyme MÁY LUÂN NHIỆT Quá trình PCR thực buồng ủ máy luân nhiệt các phận chính: 1) Bàn phím 2) Một vi xử lý để ghi nhớ chương trình, thực mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho với chương trình thực 3) Buồng ủ PCR nơi chu kỳ nhiệt thực qua điều khiển vi xử lý.Trong chu kỳ nhiệt, nhiệt độ buồng ủ PCR đưa lên cao hay hạ xuống thấp thời gian ngắn Qui trình tiến hành Biến tính DNA biến tính nhiệt độ cao, 94 -950 C 30s – 1m Bắt cặp đoạn mồi vào sợi khuôn Bắt cặp mồi vào sợi khuôn: 45 -600C, khoảng phút Bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đầu chuỗi Kéo dài chuỗi Phản ứng kéo dài chuỗi: 720C DNA polymerase gắn vào sợi trống, bắt đầu bám hoạt động dọc theo sợi Hình thành chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành khoảng 25 -40 chu kỳ Sản phẩm sau phản ứng Điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide để phát DNA nhân PCR sản phẩm PCR so với thang DNA gel agarose Thang DNA (ngõ 1), sản phẩm PCR nồng độ thấp (đường 2), nồng độ cao (ngõ 3) Hình ảnh xuất với cho phép Helmut W Klein, Viện Hóa sinh, Đại học Cologne, Đức Lợi ích Thời gian thực nhanh Đơn giản tốn Độ tinh mẫu không cần cao Hạn chế Kích thước trình tự khuếch đại Phương pháp PCR không hoạt động với đoạn DNA lớn 3kb, mà hôatj động đoạn DNA có độ dài 1,5kb (cho kết tốt) Sự ngoại nhiễm Các sai sót gây Taq polymerase Sự chép cho tỷ lệ sai cao 10-4 Ứng dụng Nhân phân tử RNA Đoạn mồi + mạch khuôn, sau tổng hợp phâ tủ DNA nhờ enzyme reverse trancriptase Enzyme Tth DNA – polymerase thực phản ứng chép ngược phản ứng tăng số lượng, trình cần có ion mangan Kỹ thuật RAPD Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA máy PCR Điện di gel Xác định tính đa dạng di truyền phần mềm thông dụng Các số liệu thu cho thấy tương xứng khác biệt di truyền mẫu nghiên cứu Nhân gen sử dụng plasmid (1) nhiễm sắc thể ADN sinh vật A (2) PCR (3) Nhiều gen từ sinh vật A (4) Đầu vào gen vào plasmid (5) plasmid với gen từ sinh vật A (6) Đầu vào plasmid thể B (7) Phép nhân biểu gen, có nguồn gốc từ sinh vật A, xảy thể B CÁ M Ơ N C Ô V À CÁC BẠN Đ Ã LẮNG NGHE .. .Kỹ thuật PCR ? PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không cần phải sử dụng sinh vật sống Nguyên tắc PCR phản ứng nhân trình tự DNA ống nghiệm Phương... Quá trình PCR thực buồng ủ máy luân nhiệt các phận chính: 1) Bàn phím 2) Một vi xử lý để ghi nhớ chương trình, thực mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR chu... cho với chương trình thực 3) Buồng ủ PCR nơi chu kỳ nhiệt thực qua điều khiển vi xử lý.Trong chu kỳ nhiệt, nhiệt độ buồng ủ PCR đưa lên cao hay hạ xuống thấp thời gian ngắn Qui trình tiến hành