thuyết trình kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là gì ?PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải sử dụng các sinh vật sống... Phương pháp này được thực hiện invotro với sự có m

Kỹ thuật PCR là gì ?

PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải

sử dụng các sinh vật sống

Nguyên tắc

PCR là phản ứng nhân bản trình tự DNA trong ống nghiệm

Phương pháp này được thực hiện invotro với sự có mặt của enzyme DNA – polymerase

Sự khuếch đại nhờ các chu trình nhiệt được lặp lại

PCR là một chuỗi phản ứng nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Biến tính: tách DNA từ mạch đôi thành mạch

Các thành phần cần cho thực hiện phản ứng

Thiết bị PCR

Sợi khuôn DNA mẫu: có thể là đoạn acid nucleic đặc trưng của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý… mà phản ứng PCR sẽ nhân bản lên để chúng có thể được phát hiện dễ dàng

Đoạn mồi (oligonucleotide primers): Là những đoạn DNA đơn, có kích thước chỉ vài chục base (18-30).

vai trò chính:

1) Quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng PCR

2) Khởi động enzyme polymerase

Taq polimerase (enzyme chịu nhiệt được tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus).

Deoxyronucleotit triphotphate ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

Dung dịch đệm và ion Mg++ Hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh,

quá thấp làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme

MÁY LUÂN NHIỆT

Quá trình PCR được thực hiện trong các buồng ủ của máy luân nhiệt.

các bộ phận chính:

1) Bàn phím.

2) Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình, thực hiện các mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện

3) Buồng ủ PCR là nơi các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ vi xử lý.Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn.

Qui trình tiến hành

Biến tính

DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, 94 -950 C trong 30s – 1m

Bắt cặp các đoạn mồi vào sợi khuôn

Bắt cặp các mồi vào sợi khuôn: 45 -600C, trong khoảng 1 phút.

Bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào 2 đầu của chuỗi.

Kéo dài chuỗi

Phản ứng kéo dài chuỗi: 720C DNA polymerase gắn vào sợi trống, nó bắt đầu bám và hoạt

động dọc theo sợi

Hình thành 1 chu kỳ Phản ứng PCR được tiến hành trong khoảng 25 -40 chu kỳ.

Sản phẩm sau phản ứng

Điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide để phát hiện DNA nhân bản bằng PCR

sản phẩm PCR so với thang DNA trong gel agarose

Thang DNA (ngõ 1), sản phẩm PCR ở nồng độ

thấp (đường 2), và nồng độ cao (ngõ 3) Hình ảnh

được xuất bản với sự cho phép của Helmut W

Klein, Viện Hóa sinh, Đại học Cologne, Đức

Hạn chế

Kích thước của trình tự khuếch đại Phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb, mà chỉ hôatj động khi các đoạn DNA có độ dài dưới 1,5kb (cho kết quả tốt)

Sự ngoại nhiễm

Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép cho tỷ lệ sai khá cao 10-4

Ứng dụng

 Nhân phân tử RNA

Đoạn mồi + mạch khuôn, sau đó tổng hợp các phâ tủ DNA nhờ enzyme reverse trancriptase

Enzyme Tth DNA – polymerase có thể thực hiện cả phản ứng sao chép ngược và phản ứng tăng số lượng, quá trình này cần có ion mangan

Kỹ thuật RAPD

Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

Điện di trên gel

Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng Các số liệu thu được cho thấy sự tương xứng hoặc khác biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Nhân bản một gen sử dụng một plasmid

(1) nhiễm sắc thể ADN của sinh vật A (2) PCR (3) Nhiều bản sao của một gen duy nhất từ sinh vật A (4) Đầu vào gen vào một plasmid (5) plasmid với gen từ sinh vật A (6) Đầu vào plasmid trong cơ thể B (7) Phép nhân hoặc biểu hiện của gen,

có nguồn gốc từ sinh vật A, xảy ra trong cơ thể B.

CÁM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ L ẮNG NGHE