TÍNH TOÁN, THIẾT kế QUÁ TRÌNH lọc MÀNG để cô đặc PROTEASE KIỀM của BACILLUS LICHENIFOMIS từ DỊCH nỗi SAU LY tâm LOẠI SINH KHỐI với CÔNG SUẤT NHÀ máy 200 tấn năm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO KỸ THUẬT QUÁ TRÌNH SINH HỌC TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ QUÁ TRÌNH LỌC MÀNG ĐỂ CÔ ĐẶC PROTEASE KIỀM CỦA BACILLUS LICHENIFOMIS TỪ DỊCH NỖI SAU LY TÂM LOẠI SINH KHỐI VỚI CÔNG SUẤT NHÀ MÁY 200 TẤN/NĂM Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Quỳnh Mai Tp Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2017 Phụ Lục I Giới Thiệu II Vật liệu phương pháp a Chủng vi khuẩn b Mẫu bùn thành phần c Điều kiện cấy môi trường nuôi cấy d Lên men e Kỹ thuật thu hồi Protein kiềm từ lên men chất Ly tâm Siêu lọc Nguồn cấp chất .10 III Tính toán thiết kế trình lọc 11 I Giới Thiệu ProteA enzym phá vỡ liên kết peptit axit amin protein Chúng gọi enzyme proteolytic Điều quan trọng việc tiêu hóa họ phân tích protein phức tạp thành axit amin đơn giản Protein kiềm sản xuất loạt vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm mốc nấm men, actinomycetes vv… Protease gồm sáu nhóm, protease serine, protease threonine, protease cysteine, protease aspartate, công trình metaloprotease Trong vi khuẩn, enzym protease sản xuất chủ yếu Bacillus licheniformis, B horikoshii, B.sphaericus, B furmis, B alcalophilus, B subtilis Protea có nhiều chức có nhiều ứng dụng công nghệ sinh học quan trọng Đây nhóm enzyme công nghiệp lớn tìm thấy ứng dụng chất tẩy rửa (để loại bỏ protein khỏi vải bẩn màu, sữa, mồ hôi, cỏ vv) Trong protease ngành công nghiệp tơ tằm sử dụng quy trình tẩy lụa chất tẩy rửa tổng hợp, hàm ý chất hoạt động bề mặt không ion phần Trong ngành công nghiệp da (dùng để tẩy, nhổ lông, tẩy dầu mỡ ngâm tẩm da thuộc da xanh) da dehairing enzyme dựa da coi phương pháp thay thân thiện môi trường với trình hóa học thông thường; Trong ngành công nghiệp thực phẩm, để loại bỏ cay đắng không mong muốn mát chín ví dụ protease sản xuất hương vị thực phẩm Protease sử dụng để phục hồi phần protein động vật cá mà không bị lãng phí sau giết mổ Protea sử dụng điều trị da cá để sử dụng công nghiệp Trong ngành dược phẩm, sử dụng để ngăn ngừa nhiều máu đóng băng làm giảm đông máu xu hướng tiểu cầu hồng cầu Proteases sử dụng sản xuất thuốc, nơi enzyme sử dụng trợ giúp cho việc tiêu hóa tuyến tụy Ngoài ra, loại thuốc sinh học, protease giúp ngăn ngừa trường hợp ngủ để tránh hành động ma túy truyền thống, chẳng hạn ung thư bệnh đa dạng phổ biến khác Một ứng dụng khác xử lý nước thải protease kiềm hòa tan protein chất thải thông qua trình nhiều bước để thu hồi chất lỏng có chứa nhiều chất dinh dưỡng cho cá gia súc Tiến hành khảo sát thu hồi protease kiềm từ B licheniformis ATCC 21424 cặn thải lên men thực ly tâm siêu lọc Tối ưu hóa thông số siêu lọc (áp suất màng tế bào (TMP) nguồn thức ăn) thực với màng 10 kDa TMP 90 kPa lượng chất 714 L/h/m2 cho thu hồi cao (83%) enzyme từ bề mặt o ly tâm Enzyme thu hồi cho hoạt động tối đa nhiệt độ 60 C pH 10 Nó ổn định o pH đến 10 giữ lại hoạt động 97% 60 C sau 180 phút ủ Hoạt tính enzyme 2+ 2+ tăng lên đáng kể Ion kim loại Ca Mn Các chất ức chế protease phenylmethyl sulphonyl florua (PMSF) florophorphat diisopropyl (DFPs) ức chế hoàn toàn hoạt tính enzim Protease tinh chế phần cho thấy ổn định tuyệt vời tương thích với chất tẩy rửa thương mại khác Chất tẩy rửa loại bỏ vết bẩn máu có hiệu với enzyme phụ gia Các trình lọc màng phổ biến lĩnh vực công nghệ sinh học, chúng dễ dàng vận hành mở rộng so với trình phân tách khác sắc ký, điện di.Trong số trình tách màng khác nhau, trình lọc trình có chức chịu áp lực áp dụng sử dụng chủ yếu để tách tinh sản phẩm bao gồm enzyme protein khác Để thu hồi sản phẩm vi khuẩn (tế bào bào tử) có môi trường nuôi cấy Do lượng enzyme thấp nước tế bào nên việc loại bỏ nước mục đích Siêu lọc kỹ thuật hiệu Phần lớn sử dụng để thu hồi enzyme, giải pháp thay tối ưu Quá trình tách ly áp lực không tốn cho kết đáng mong muốn với làm hoạt tính enzyme Quá trình tập trung hai vấn đề nồng độ tinh Tuy nhiên, việc áp dụng trình lọc màng nói chung có số vấn đề cụ thể tắc nghẽn màng lọc kết tủa tạo thành sản phẩm cuối lắng đọng hạt rắn màng Nếu dòng chất lỏng chảy vào màng lọc tế bào lớn dung môi qua màng lọc tế bào, chất tan tích tụ bề mặt màng tế bào, tích tụ tạo thành nồng độ gọi phân cực nồng độ Sự luân chuyển tiếp tuyến chế hoạt động mạnh mẽ thuận lợi so với trình bình thường tiếp xúc tiếp tuyến giảm đáng kể độ bẩn màng Sự tắc nghẽn bẩn thường giảm bớt khắc phục cách xử lý chất tẩy rửa, proteases, axit kiềm Trên thực tế, trình siêu lọc sử dụng để thu hồi hợp chất hữu từ số phương tiện tổng hợp Các enzyme công nghiệp thương mại quan trọng chiếm 60% tổng lượng enzyme bán với hai phần ba proteases sản xuất từ vi sinh vật Các enzyme từ vi khuẩn thay chất xúc tác hóa học.Trong sản xuất hóa chất, thực phẩm, hàng da, dược phẩm,và hàng dệt may Trong số proteases, protease kiềm sử dụng chủ yếu chất tẩy rửa khả đặc biệt để hấp thu vết bẩn protein máu, sô cô la sữa Hiện nay, dựa protease kiềm chất tẩy rửa ưa thích chất tổng hợp, chất tẩy rửa thông thường, chúng có đặc tính làm tốt hơn,có hiệu cao nhiệt độ giặt thấp an toàn protease sử dụng chất tẩy rửa phải có mức độ hoạt động cao ổn định phạm vi rộng pH nhiệt độ Một nhược điểm không ổn định enzym hồi phục từ chất lạnh pH kiềm enzym ưa kiềm mang lại ổn định phạm vi pH rộng Nói chung không bền với nhiệt Vì vậy, proteases có nhu cầu với tất tính chất mong muốn để trở nên hoàn hảo Với điều kiện áp dụng cần phải kiểm tra ổn định enzyme nhiệt độ cao pH.Các ứng dụng protease cho ngành công nghiệp tẩy rửa cần tập trung tinh enzyme để sửa đổi với chất tẩy rửa dể có hiệu suất tốt trình lưu trữ ứng dụng tốt Enzyme môi trường đơn giản xác định môi trường chứa cặn, Enzym lên men chứa nhiều cặn khác loại khác tạp chất, enzym phải làm nồng độ phải ổn định để có hoạt tính cao hơn.Một lượng lớn cặn thải đô thị tạo Canada Do tăng dân số phát triển khác quản lý cặn thải trở thành điều quan trọng vấn đề môi trường quy định nghiêm ngặt xử lý cặn Vì vậy, biến đổi sinh học từ cặn thải thành sản phẩm giá trị cao phương pháp tiếp cận kinh tế sinh thái.Việc sử dụng cặn thải để sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis thành công đạt phòng thí nghiệm Mục đích nghiên cứu để thu hồi làm giàu sản phẩm protease kiềm từ lên men cặn thải kỹ thuật siêu lọc Hoạt lực enzyme kiểm tra có mặt chất tẩy rửa thương mại tiêu chuẩn enzyme đặc trưng liên quan đến tác động chất phụ gia khác chẳng hạn chất ổn định chất ức chế ổn định mức cao nhiệt độ độ pH kiềm II Vật liệu phương pháp a Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis strain ATCC21424 sử dụng nghiên cứu Một môi trường nuôi cấy hoạt tính trì cách nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng (thành phần: 0,3% chiết xuất thịt bò, 0,5% peptone, 2% agar) ủ 35 ° C 48 o Các đĩa bảo quản nhiệt độ C để sử dụng sau b Mẫu bùn thành phần Các mẫu cặn thứ cấp nước thải thu từ nước thải đô thị việc xử lí Cộng đồng Urbaine de Quebec (CUQ, Que-bec) sử dụng Các thí nghiệm tiến hành nồng độ chất rắn cặn lơ lửng từ 30 g / L Cặn ly tâm để có nồng độ chất rắn lơ lửng cao hơn(30 g / L) Các đặc tính cặn đo theo phương pháp chuẩn thành phần bùn trình bày Bảng c Điều kiện cấy môi trường nuôi cấy Sự phát triển vi khuẩn từ đĩa thạch dinh dưỡng sử dụng để cấy dung dịch Erlenmeyer 500 mL có chứa 100 mL nước dùng khử trùng (thành phần: 0,3% chất chiết suất từ thịt bò 0,5% peptone) (khử trùng 121 ° C 15 phút) o Được ủ máy lắc New Brunswick) 35 C với 220 vòng / phút 12 500 mL Erlenmeyer có chứa 100 mL cặn khử trùng sau cấy với 2% (v/v) chủng từ yêu cầu Các câu hỏi ủ bình cấy 12 tế bào phát triển tích cực sử dụng giống cấy cho thí nghiệm lên men d Lên men Một máy lên men (Biog'enie Inc, Quebec) có công suất 15 L trang bị phụ kiện điều khiển tự động với hệ thống oxy hòa tan, pH, chất chống oxy hoá, tốc độ cánh quạt, tốc độ nhiệt độ tốc độ làm việc cặn 10 l bổ sung 1,5% (w/v) đậu nành o 1,5% (w/v) lactose (khử trùng 121 C 30 phút) Được sử dụng để sản xuất protease kiềm cực ngoại bào Môi trường tiêm thuốc tiêm 4.5% (v/v) Nhiệt độ độ pH o môi trường lên men kiểm soát 35 C 7.5, tương ứng Nồng độ oxy hoà tan trì mức bão hòa 20% (1,56 mg O / L) (nồng độ oxy quan trọng) cách khuấy trung bình ban đầu tốc độ 200 vòng / phút cuối tăng lên đến 500 rpm tốc độ dòng không khí điều khiển tự động hệ thống điều khiển máy tính Nước dùng lên men lấy vô trùng chai HDPE (VWR Canlab,Canada) sau 42 lên men niêm phong paraffin bảo quản 4°C để sử dụng tiếp e Kỹ thuật thu hồi Protein kiềm từ lên men chất Ly tâm Nước dùng lên men ly tâm tốc độ 9000xg 30 phút theo thủ tục Brar cộng Các dịch sau ly tâm lên men nước canh thu thập bảo quản nhiệt độ ° C Siêu lọc Nguyên tắc hoạt động rửa lọc Thiết bị sử dụng cho siêu lọc loại lọc tiếp tuyến (PREP / SCALE-TFF, Cartridges Millipore) với ống tuần hoàn Ống chảy bơm tiếp tuyến dọc theo bề mặt màng Áp lực áp dụng để ép phần chất lỏng thông qua màng để thấm qua bên màng.Các dịch bề mặt từ máy ly tâm đưa vào siêu lọc.Thiết bị chạy máy bơm (Casy Load, Master Flex, Millipore) Các dịch bề mặt đưa đến nhiệt độ phòng (25°C) để tiến hành đo cực tím Quá trình bao gồm việc vô trùng thể tích (1L) chất từ kích thước màng Các màng có trọng lượng phân tử (MWCO) 10 kDa 100 kDa sử dụng nghiên cứu (Millipore, ống lọc xoắn TFF-1) Màng tế bào tạo thành từ cellulose tái sinh có dạng xoắn ốc TFF-1 mô đun PLCC với diện tích bề mặt 0,1 m Dịch truyền qua màng 100 kDa để loại bỏ tất tạp chất cặn khác nước cuối thu thập nguồn enzym để mang tối ưu hóa nghiên cứu cách sử dụng màng 10 kDa Nồng độ enzyme sử dụng để mô tả đặc tính Các đặc tính màng trình bày Table Tối ưu hóa thông số siêu lọc Áp suất màng lưu lượng dòng chất thông số quan trọng kiểm soát trình siêu lọc Để tối ưu hóa, thí nghiệm thực với giá trị khác TMP (70 - 110 kPa) lượng chất (455 - 2500 L/h/m ) Trong trình siêu lọc điển hình, dòng chảy thấm thấp dẫn đến nồng độ cao chất thấm tích lại Các mẫu thu hồi để xác định chất rắn lơ lửng, tổng chất rắn, hòa tan protein, hoạt động protease chất thấm tích lại chất thấm qua Bước ly tâm xem bổ xung chất thông qua màng tế bào để tập trung thành phần hoạt động vào thể tích tập trung gọi "chất thấm ti ć h lai""̣ chiếm 18% khối lượng bề mặt Dòng chảy bề mặt thu máy bơm có lưu lượng dao động từ 45.5 L/h đến 250 L/h, tạo lưu lượng dòng chất thông qua màng khoảng 455 L/h/m 2500 L/h/m Đối với dòng chảy chất thấm qua, nói chung phụ thuộc vào TMP điện trở màng Sau siêu lọc, thẩm thấu chất thấm tich ́ laịđược thu thập theo yêu cầu Lấy mẫu bề mặt, chất thấm tich ́ lai,"̣ chất thấm qua thực để đo kích thước vật lý thông số sinh học (tổng chất rắn, chất rắn lơ lửng, protein hoà tan, hoạt tính protease) Sau lần vận hành siêu lọc, chất lỏng màng thoát hoàn toàn Môi trường sử dụng nghiên cứu môi trường sinh học, nên sử dụng dung dịch kiềm (0,1 N NaOH) Dung dịch kiềm truyền qua màng màng lọc Sau đó, màng lấy đảo ngược để tạo điều kiện rửa hoàn toàn Độ bền màng xác định "trọng lượng thấm bình thường" (NWP) hiệu suất màng phụ thuộc vào NWP Trong thực tế, trình sử dụng màng, giá trị NWP giảm xuống, giá trị nằm 10% 20% giá trị ban đầu (màng mới, NWP màng nên coi 100%), màng nên thay đổi Trước chạy cực nhanh, phải xác định NWP để kiểm tra chịu đựng màng 3 Áp suất qua màng (TMP) TMP chức áp lực chất thấm ti ć h laịvà chất điều chỉnh máy đo áp lực để có giá trị khác TMP Các giá trị TMP khác kiểm tra từ 70 kPa đến 110 kPa để có giá trị TMP tối ưu Hoạt tính protease, protein hoà tan, tổng chất rắn chất rắn lơ lửng chất thấm ti ́ch laịđược trình bày hình Tất giá trị (hoạt tính protease, protein hòa tan, tổng chất rắn chất rắn lơ lửng) phát trình thẩm thấu kích thước proteaza kiềm nằm khoảng 20-30 kDa Lớn MWCO màng 10 kDa Adjalle et al (25 kDa 30 kDa) trình thu hồi thuốc trừ sâu lớn MWCO KDa màng Hoạt tính protease cao (69 IU/mL), protein hoà tan (7.8 mg/mL), tổng chất rắn(12 g/L) chất rắn lơ lửng (2.7 g/l) thu với 90 kPa số tất giá trị TMP khác sử dụng Tất thành phần thử nghiệm cô đặc đến 4,5 lần chất thấm tich ́ laịhơn so với giá trị ban đầu họ (dịch nổi) (Table 3) Thực tế hoạt tính protease phát tất chất qua qua màng Vì vậy, 83% hoạt tính protease thu hồi với TMP với 90 kPa Vì vậy, rõ ràng số protease bị cặn vản màng ống TMP cao thấp 90 kPa Kết giá trị thấp hoạt tính protease, protein hoà tan, tổng chất rắn chất rắn lơ lửng Điều TMP thấp giá trị tối ưu, áp suất dòng chất không thoả mãn để truyền dung dịch qua màng hiệu mát thành phần xảy ống bề mặt màng Khi TMP cao, áp suất cao tạo bọt màng siêu mịn giữ lại ống cuối thành phần bị màng ống dạng bọt chúng giữ lại dung dịch thấm qua màng chất thấm tich ́ laị Dòng chất tan màng chắn dẫn đến tắc nghẽn số lỗ lọc, tạo thêm bề mặt để hấp phụ kết dính Vì điều kiện yêu cầu để thu hồi protein nguyên vẹn, nên loại bỏ / thu hồi protein Các chế khác tạo tổn thất thông qua màng siêu lọc, số thành phần mẫu gần với MWCO màng.Nguyên nhân gây protein enzyme thông qua màng tế bào phân bố kích thước lỗ rỗng, lực cắt đóng góp cách tạo mảnh nhỏ Theo nguyên lý siêu lọc, dòng chảy tối thiểu chất thấm qua màng dẫn đến tổn thất tối thiểu không chất tan (protease bối cảnh tại) chất thấm qua màng cho nồng độ cao chất thấm tich ́ laị Luồng tối thiểu chất thấm qua màng thu với giá trị tối ưu TMP Adjalle et al ghi nhận TMP 90 kPa 100 kPa giá trị tối ưu cho thu hồi từ nước thải công nghiệp tinh bột môi trường cặn thủy phân nhiệt Các nhà nghiên cứu khác báo cáo 20 kPa tốt cho việc tách protease kiềm serine từ protease trung tính amylase 100 kPa cho việc tách proteaza kiềm serine từ axit amin hữu TMP tối ưu khác trường hợp khác đặc tính lưu biến thành phần khác có mẫu thức ăn 4 Nguồn cấp chất Hoạt tính protease, protein hòa tan, tổng chất rắn chất rắn lơ lửng so với dòng thức ăn khác TMP 90 kPa trình bày Hình Sự khác giá trị dòng chảy thức ăn 455 L/h /m 2500 L/h/m sử dụng cách giữ lưu lượng nước tốc độ từ 45,5 L/giờ (tốc độ thấp nhất) đến 250L/h (tốc độ cao nhất) Trong trình tối ưu hóa nguồn cấp liệu cho giá chất, áp suất chất thấm tich́ laịđược điều chỉnh để trì TMP tương tự 90 kPa Lượng chất 714 L/h/m cho giá trị cao hoạt động protease, protein hoà tan, tổng chất rắn, chất rắn lơ lửng chất thấm tích laịtrong số tất nguồn thức ăn sử dụng Tất giá trị phát tất thấm giải thích trước Hoạt tính protease, protein hoà tan, tổng chất rắn, chất rắn lơ lửng cô đặc gấp 4,5 lần so với giá trị ban đầu chúng (trên bảng 3) 81% polytexturease (trong điều kiện hoạt động) thu hồi chất thấm tich ́ laịở lượng chất 714 L/H/m Không có protease phát chất thấm hầu hết protease thu hồi chất thấm tich́ laịvà số protease bị lắng đọng màng tế bào Liet al Báo cáo độ tinh khiết protease tăng lên gấp 10 lần với tốc độ 360 L/h tách protease từ lách ngựa vàng siêu lọc, Adjalle et al Báo cáo 550 L/h/m 720 L/h/m giá trị tối ưu cho thành phần (protein tinh thể, protease, vv) từ nước thải ngành công nghiệp tinh bột môi trường cặn thủy phân Hoạt tính protease, protein, tổng chất rắn, nồng độ chất rắn lơ lửng giảm với giá trị chất cao (1250, 1667 2500 L/h/m ) Sự giảm có giá trị nguồn chất cao thực tế chất lượng cao làm giảm chất lượng sản phẩm phát sinh nhiễu loạn điện tử Hơn nữa, nhiễu loạn cao gây bọt trầm trọng luồng chất thấm tich ́ laịsẽ tạo chân không làm giảm thêm lượng dòng giá trị tối ưu; Do đó, quản lý hiệu suất tổng thể hệ thống siêu lọc Sự dao động đơn vị lọc lượng chất cao gây tạo mùi protein (enzyme protein hòa tan khác) môi trường ➢ Qua thí nghiệm cho thấy Sự thu hồi protease kiềm sử dụng trình siêu lọc với áp suất màng lọc tối đa 90 kPa lượng chất 714L/h/m cho thấy thu hồi 83% hoạt động protease Protease từ B licheniformis ATCC 21424 enzyme kiềm alkaline có khả chịu nhiệt III Tính toán thiết kế trình lọc Mục đích: Loại bỏ dung môi phân tử có kích thước nhỏ enzyme, enzyme thu hồi phần màng lọc - Lưu lượng dòng qua màng: Jv = 714L/h/m Kích thước lỗ lọc 10kDa Vận tốc dịch lọc V = L/S Chênh lệch áp suất ΔP = 90kPa = 90000 N/m 2 Thể tích dòng đầu vào = thể tích pha trích = Vt = 2500 lít - Cho khối lượng enzyme đầu vào 800 kg => Nồng độ enzyme đầu vào là: -3 Cf = m/Vf = 800/2500*10 = 320 kg/m - Khối lượng enzyme 294.4 kg (cho 8% thất thoát) Thể tích dịch không qua màng thể tích đưa vào thiết bị sấy Thể tích enzyme đưa vào sấy là: V = 320*90/95 = 303.15 lit - Thể tích đưa vào thiết bị sấy thể tích dịch enzyme sau siêu lọc: Vr = 303.15 lit - Thể tích dịch qua màng là: Vp= Vf – Vr = 2500 – 303.15 = 2196.85lit - Nồng độ enzyme đầu là: -3 Cr = m/Vr = 294.4/303.15*10 = 971.14 kg/m - Thời gian lọc X Để đạt suất 200 tấn/năm ngày phải đạt 631kg (0.65 m ) Lưu lượng dòng là: ➢ X = 11.2 (tiếng) -3 - Lưu lượng dòng vào là: Qf = Vf/t = 2500*10 /11.2/24 = 5.357 m /ngày Phương trình cân vật chất: Qf.Cf = Qp.Cp + Qr.Cr Qf = Qp + Qr Qp = Qf – Qr = 5.357 – 0.65 = 4.707 m /ngày Ta có: Jv = Qp/A ➢ ❖ -3 A = Qp/Jv = 4.707/(714*10 *24) = 0.275 m 2 Vậy thiết bị siêu lọc có kích thước lỗ lọc 10kDa, diện tích 0.275 m hoạt động với thời gian 11.2 tiếng/ngày  ... lực áp dụng để ép phần chất lỏng thông qua màng để thấm qua bên màng. Các dịch bề mặt từ máy ly tâm đưa vào siêu lọc .Thiết bị chạy máy bơm (Casy Load, Master Flex, Millipore) Các dịch bề mặt đưa... nguồn enzym để mang tối ưu hóa nghiên cứu cách sử dụng màng 10 kDa Nồng độ enzyme sử dụng để mô tả đặc tính Các đặc tính màng trình bày Table Tối ưu hóa thông số siêu lọc Áp suất màng lưu lượng... paraffin bảo quản 4°C để sử dụng tiếp e Kỹ thuật thu hồi Protein kiềm từ lên men chất Ly tâm Nước dùng lên men ly tâm tốc độ 9000xg 30 phút theo thủ tục Brar cộng Các dịch sau ly tâm lên men nước