TÍNH TOÁN, THIẾT kế QUÁ TRÌNH lọc MÀNG để cô đặc PROTEASE KIỀM của BACILLUS LICHENIFOMIS từ DỊCH nỗi SAU LY tâm LOẠI SINH KHỐI với CÔNG SUẤT NHÀ máy 200 tấn năm

Đây là một trong những nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất và tìm thấy ứng dụng trong chất tẩy rửa để loại bỏ các protein khỏi vải bẩn màu, sữa, mồ hôi, cỏ vv Trong các protease ngành công

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO

KỸ THUẬT QUÁ TRÌNH SINH HỌC

TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ QUÁ TRÌNH LỌC MÀNG ĐỂ CÔ ĐẶC PROTEASE KIỀM CỦA

BACILLUS LICHENIFOMIS TỪ DỊCH NỖI

SAU LY TÂM LOẠI SINH KHỐI VỚI CÔNG

SUẤT NHÀ MÁY 200 TẤN/NĂM

Giảng viên hướng dẫn:

Th.S Nguyễn Thị Quỳnh Mai

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5 Năm 2017

Phụ Lục

I Giới Thiệu 3

II Vật liệu và phương pháp 5

a Chủng vi khuẩn 5

b Mẫu bùn và thành phần 6

c Điều kiện cấy và môi trường nuôi cấy 6

d Lên men 6

e Kỹ thuật thu hồi Protein kiềm từ lên men cơ chất 7

1 Ly tâm 7

2 Siêu lọc 7

4 Nguồn cấp cơ chất 10

III Tính toán thiết kế quá trình lọc 11

I Giới Thiệu

ProteA là những enzym phá vỡ liên kết peptit giữa các axit amin của protein Chúng còn được gọi là enzyme proteolytic Điều rất quan trọng trong việc tiêu hóa khi họ phân tích các protein phức tạp thành các axit amin đơn giản hơn Protein kiềm được sản xuất bởi một loạt các vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men, actinomycetes vv… Protease

gồm sáu nhóm, protease serine, protease threonine, protease cysteine, protease aspartate,

và các công trình metaloprotease Trong vi khuẩn, enzym protease được sản xuất chủ yếu

là Bacillus licheniformis, B horikoshii, B.sphaericus, B furmis, B alcalophilus, B subtilis

Protea có nhiều chức năng và có nhiều ứng dụng công nghệ sinh học quan trọng Đây là một trong những nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất và tìm thấy ứng dụng trong chất tẩy rửa (để loại bỏ các protein khỏi vải bẩn màu, sữa, mồ hôi, cỏ vv) Trong các protease ngành công nghiệp tơ tằm đã được sử dụng trong quy trình tẩy lụa bằng chất tẩy rửa tổng hợp, hàm ý các chất hoạt động bề mặt không ion một phần Trong ngành công nghiệp da (dùng để tẩy, nhổ lông, tẩy dầu mỡ và ngâm tẩm da thuộc da sạch và xanh) da dehairing bằng enzyme dựa trên

da đã được coi là một phương pháp thay thế thân thiện môi trường với quá trình hóa học thông thường; Trong ngành công nghiệp thực phẩm, để loại bỏ cay đắng không mong muốn trong pho mát chín là một ví dụ về protease trong sản xuất hương vị trong thực phẩm Protease cũng được sử dụng để phục hồi các phần protein của động vật và cá mà nếu không

sẽ bị lãng phí sau khi giết mổ Protea cũng được sử dụng trong điều trị da cá để sử dụng trong công nghiệp Trong ngành dược phẩm, nó được sử dụng để ngăn ngừa quá nhiều máu đóng băng và làm giảm đông máu xu hướng tiểu cầu và hồng cầu Proteases cũng được sử dụng trong sản xuất thuốc, nơi enzyme được sử dụng như một trợ giúp cho việc tiêu hóa bởi tuyến tụy Ngoài ra, trong các loại thuốc sinh học, protease giúp ngăn ngừa các trường hợp mất ngủ để tránh các hành động ma túy truyền thống, chẳng hạn như ung thư hoặc các bệnh

đa dạng phổ biến khác Một ứng dụng chính khác là xử lý nước thải khi protease kiềm có thể hòa tan các protein trong chất thải thông qua một quá trình nhiều bước để thu hồi các chất lỏng có chứa nhiều chất dinh dưỡng cho cá và gia súc

Tiến hành khảo sát thu hồi protease kiềm từ B licheniformis ATCC 21424 cặn thải lên men được thực hiện bằng ly tâm và siêu lọc Tối ưu hóa các thông số siêu lọc (áp suất màng

tế bào (TMP) và nguồn thức ăn) được thực hiện với màng 10 kDa TMP của 90 kPa và lượng cơ chất của 714 L/h/m2 cho sự thu hồi cao nhất (83%) của enzyme từ trên bề mặt

ly tâm Enzyme thu hồi đã cho hoạt động tối đa ở nhiệt độ 60oC và ở pH 10 Nó ổn định giữa pH 8 đến 10 và giữ lại hoạt động 97% ở 60oC sau 180 phút ủ Hoạt tính của enzyme tăng lên đáng kể Ion kim loại như Ca2+ và Mn2+ Các chất ức chế protease như phenylmethyl sulphonyl florua (PMSF) và florophorphat diisopropyl (DFPs) ức chế hoàn toàn hoạt tính của enzim Protease đã được tinh chế một phần cho thấy sự ổn định tuyệt vời và tương thích với các chất tẩy rửa thương mại khác nhau Chất tẩy rửa loại bỏ các vết bẩn trong máu có cùng hiệu quả với các enzyme như phụ gia

Các quá trình lọc màng là phổ biến nhất trong lĩnh vực công nghệ sinh học, vì chúng dễ dàng vận hành và mở rộng so với các quá trình phân tách khác như sắc ký, và điện di.Trong

số các quá trình tách màng khác nhau, quá trình lọc là một trong những quá trình có chức năng chịu được dưới áp lực áp dụng được sử dụng chủ yếu để tách và tinh sạch các sản phẩm bao gồm enzyme và các protein khác hoặc Để thu hồi các sản phẩm vi khuẩn (tế bào và bào tử) có trong môi trường nuôi cấy Do lượng enzyme thấp trong nước không có tế bào nên việc loại bỏ nước là một mục đích chính Siêu lọc là một kỹ thuật hiệu quả

.Phần lớn được sử dụng để thu hồi các enzyme, là một giải pháp thay thế tối ưu Quá trình tách ly áp lực này không tốn kém và cũng cho kết quả đáng mong muốn với ít làm mất đi hoạt tính của enzyme Quá trình này tập trung cả hai vấn đề nồng độ và tinh sạch

Tuy nhiên, việc áp dụng các quá trình lọc màng nói chung có một số vấn đề cụ thể như tắc nghẽn màng lọc hoặc do các kết tủa tạo thành bởi sản phẩm cuối cùng và lắng đọng các hạt rắn trên màng Nếu dòng chất lỏng chảy vào màng lọc tế bào lớn hơn dung môi đi qua màng lọc tế bào, chất tan tích tụ trên bề mặt màng tế bào, sự tích tụ này tạo thành nồng

độ được gọi là phân cực nồng độ Sự luân chuyển tiếp tuyến là cơ chế hoạt động mạnh mẽ và thuận lợi hơn so với các quá trình bình thường vì sự tiếp xúc tiếp tuyến sẽ giảm đáng kể độ bẩn của màng Sự tắc nghẽn hoặc bẩn thường có thể được giảm bớt hoặc khắc phục bằng cách xử lý bằng các chất tẩy rửa, proteases, axit hoặc kiềm Trên thực tế, quá trình siêu lọc đã được sử dụng để thu hồi các hợp chất hữu cơ từ một số phương tiện tổng hợp Các enzyme công nghiệp thương mại quan trọng chiếm 60% tổng lượng enzyme bán ra với hai phần ba proteases được sản xuất từ các vi sinh vật Các enzyme từ vi khuẩn đang thay thế các chất xúc tác hóa học.Trong sản xuất hóa chất, thực phẩm, hàng da, dược phẩm,và hàng dệt may Trong số các proteases, protease kiềm được sử dụng chủ yếu như chất tẩy rửa do khả năng đặc biệt để hấp thu các vết bẩn protein như máu, sô cô la và sữa Hiện nay, dựa trên protease kiềm chất tẩy rửa được ưa thích hơn các chất tổng hợp, chất tẩy rửa thông

thường, vì chúng có đặc tính làm sạch tốt hơn,có hiệu quả cao hơn ở nhiệt độ giặt thấp hơn

và an toàn hơn protease được sử dụng trong chất tẩy rửa phải có mức độ hoạt động cao và

ổn định trong một phạm vi rộng của pH và nhiệt độ Một trong những nhược điểm chính là

sự không ổn định của enzym hồi phục từ chất lạnh ở pH kiềm là các enzym ưa kiềm mang lại

ổn định trên phạm vi pH rộng nhưng Nói chung là nó không bền với nhiệt Vì vậy, proteases luôn có nhu cầu với tất cả các tính chất mong muốn để trở nên hoàn hảo

.Với điều kiện áp dụng và cũng cần phải kiểm tra sự ổn định của enzyme ở nhiệt độ cao

và pH.Các ứng dụng của protease cho các ngành công nghiệp tẩy rửa cần tập trung và tinh sạch enzyme để sửa đổi với chất tẩy rửa dể có được hiệu suất tốt trong quá trình lưu trữ và ứng dụng tốt hơn Enzyme này sạch hơn khi môi trường đơn giản và xác định như trong môi trường chứa cặn, Enzym lên men chứa nhiều cặn khác và các loại khác tạp chất, do đó enzym phải được làm sạch và nồng độ phải ổn định để có được hoạt tính cao hơn.Một lượng lớn cặn thải đô thị đã được tạo ra ở Canada Do tăng dân số và phát triển khác quản lý cặn thải đang trở thành một điều quan trọng vấn đề môi trường do các quy định nghiêm ngặt về xử lý cặn Vì vậy, sự biến đổi sinh học từ cặn thải thành sản phẩm giá trị cao là phương pháp tiếp cận kinh tế và sinh thái.Việc sử dụng cặn thải để sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis đã thành công đạt được trong phòng thí nghiệm Mục đích của nghiên cứu này là để thu hồi và làm giàu sản phẩm protease kiềm từ lên men cặn thải bằng kỹ thuật siêu lọc Hoạt lực của enzyme được kiểm tra trong sự có mặt chất tẩy rửa thương mại tiêu chuẩn và enzyme đã được đặc trưng liên quan đến sự tác động của các chất phụ gia khác nhau chẳng hạn như chất ổn định và chất ức chế ổn định

ở mức cao hơn nhiệt độ và độ pH kiềm

II Vật liệu và phương pháp

a Chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis strain ATCC21424

đã được sử dụng trong nghiên cứu này Một môi trường nuôi cấy hoạt tính được duy trì bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng (thành phần: 0,3% chiết xuất thịt bò, 0,5% peptone, và 2% agar) và ủ ở 35 ° C trong 48 giờ Các đĩa được bảo quản ở nhiệt độ 4oC để sử dụng sau này

b Mẫu bùn và thành phần

Các mẫu cặn thứ cấp

của nước thải thu được từ

nước thải đô thị việc xử lí

Cộng đồng Urbaine de

Quebec (CUQ, Que-bec) đã

được sử dụng Các thí

nghiệm được tiến hành ở

nồng độ chất rắn của cặn lơ

lửng từ 30 g / L Cặn được ly

tâm để có nồng độ chất rắn lơ

lửng cao hơn(30 g / L) Các

đặc tính của cặn được đo

theo các phương pháp chuẩn

và thành phần bùn được trình

bày trong Bảng 1

c Điều kiện cấy và môi trường nuôi cấy

Sự phát triển của vi khuẩn từ đĩa thạch dinh dưỡng được sử dụng để cấy một dung dịch Erlenmeyer 500 mL có chứa 100 mL nước dùng đã được khử trùng (thành phần: 0,3% chất chiết suất từ thịt bò và 0,5% peptone) (khử trùng ở 121 ° C trong 15 phút) Được ủ trong một máy lắc New Brunswick) ở 35oC với 220 vòng / phút trong 12 giờ 500

mL Erlenmeyer có chứa 100 mL cặn khử trùng sau đó được cấy với 2% (v/v) chủng từ trên yêu cầu trên Các câu hỏi được ủ các bình cấy trong 12 giờ và các tế bào đang phát triển tích cực đã được sử dụng như là giống cấy cho các thí nghiệm lên men

d Lên men

Một máy lên men (Biog'enie Inc, Quebec) có công suất 15 L được trang bị phụ kiện

và điều khiển tự động với hệ thống oxy hòa tan, pH, chất chống oxy hoá, tốc độ cánh quạt, tốc độ và nhiệt độ và tốc độ làm việc của cặn 10 l được bổ sung 1,5% (w/v) đậu nành và 1,5% (w/v) lactose (khử trùng ở 121oC trong 30 phút) Được sử dụng để sản xuất protease kiềm cực ngoại bào Môi trường được tiêm bằng thuốc tiêm 4.5% (v/v) Nhiệt độ và độ pH

của môi trường lên men được kiểm soát ở 35oC và 7.5, tương ứng Nồng độ oxy hoà tan được duy trì ở mức bão hòa trên 20% (1,56 mg O / L) (nồng độ oxy quan trọng) bằng cách khuấy trung bình ban đầu ở tốc độ 200 vòng / phút và cuối cùng tăng lên đến 500 rpm và tốc

độ dòng không khí được điều khiển tự động bằng hệ thống điều khiển bằng máy tính Nước dùng lên men được lấy vô trùng trong chai HDPE (VWR Canlab,Canada) sau 42 giờ lên men

và niêm phong bằng paraffin và bảo quản ở 4°C để sử dụng tiếp

e Kỹ thuật thu hồi Protein kiềm từ lên men cơ chất

1 Ly tâm

Nước dùng lên men được ly tâm ở tốc độ 9000xg trong 30 phút theo thủ tục của Brar và cộng sự Các dịch nổi sau khi ly tâm của lên men nước canh được thu thập và bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C

2 Siêu lọc

Nguyên tắc hoạt động và rửa bộ lọc Thiết bị được sử dụng cho siêu lọc là loại lọc tiếp tuyến (PREP / SCALE-TFF, Cartridges Millipore) với ống tuần hoàn Ống chảy được bơm tiếp tuyến dọc theo bề mặt của màng Áp lực đã được áp dụng để ép một phần của chất lỏng thông qua màng để thấm qua bên màng.Các dịch nổi trên bề mặt từ máy ly tâm

đã được đưa vào siêu lọc.Thiết bị này chạy bằng máy bơm (Casy Load, Master Flex, Millipore) Các dịch nổi trên bề mặt đã

được đưa đến nhiệt độ phòng (25°C) để

tiến hành đo cực tím Quá trình này bao

gồm việc vô trùng một thể tích (1L) của

chất nổi từ kích thước màng Các màng có

trọng lượng phân tử (MWCO) là 10 kDa

và 100 kDa đã được sử dụng trong nghiên

cứu này (Millipore, ống lọc xoắn TFF-1)

Màng tế bào được tạo thành từ cellulose

tái sinh và có trong dạng xoắn ốc TFF-1

mô đun PLCC với diện tích bề mặt là 0,1

m Dịch nổi được truyền qua màng 100

kDa để loại bỏ tất cả các tạp chất cặn khác

và nước cuối cùng đã được thu thập như là

nguồn enzym để mang tối

ưu hóa nghiên cứu bằng cách sử dụng màng 10 kDa Nồng độ enzyme được sử dụng để

mô tả đặc tính Các đặc tính của màng được trình bày trong Table 2 Tối ưu hóa các thông

số của siêu lọc Áp suất màng và lưu lượng dòng cơ chất là thông số quan trọng được kiểm soát trong quá trình siêu lọc Để tối ưu hóa, thí nghiệm được thực hiện với các giá trị khác nhau của TMP (70 - 110 kPa) và lượng cơ chất (455 - 2500 L/h/m2) Trong một quá trình siêu lọc điển hình, dòng chảy thấm thấp dẫn đến nồng độ cao trong các chất thấm tích lại Các mẫu được thu hồi để xác định chất rắn lơ lửng, tổng chất rắn, hòa tan protein, và hoạt động protease trong chất thấm tích lại và chất thấm qua

Bước ly tâm được xem như là bổ xung cơ chất thông qua màng tế bào để tập trung các thành phần hoạt động vào một thể tích tập trung gọi là "chất thấm tích lai""̣ chiếm 18% khối lượng của bề mặt Dòng chảy trên bề mặt thu được bằng máy bơm có lưu lượng dao động từ 45.5 L/h đến 250 L/h, tạo ra lưu lượng dòng cơ chất thông qua màng trong khoảng 455 L/h/m và

2500 L/h/m Đối với dòng chảy của chất thấm qua, nói chung nó phụ thuộc vào TMP và điện trở của màng Sau khi siêu lọc, sự thẩm thấu và chất thấm tich́ laịđược thu thập theo yêu cầu Lấy mẫu trên bề mặt, chất thấm tich́ lai,"̣ và chất thấm qua đã được thực hiện để đo kích thước vật lý và các thông số sinh học (tổng chất rắn, chất rắn lơ lửng, protein hoà tan, và hoạt tính protease) Sau mỗi lần vận hành siêu lọc, chất lỏng trong màng đã được thoát hoàn toàn Môi trường sử dụng trong nghiên cứu này là môi trường sinh học, nên sử dụng dung dịch kiềm (0,1 N NaOH) Dung dịch kiềm được truyền qua màng cho đến khi màng lọc được sạch Sau

đó, màng đã được lấy ra và đảo ngược để tạo điều kiện rửa hoàn toàn Độ bền của màng có thể được xác định bằng "trọng lượng thấm bình thường" (NWP) do hiệu suất của màng phụ thuộc vào NWP Trong thực tế, trong quá trình sử dụng màng, giá trị của NWP giảm xuống,

và khi giá trị nằm giữa 10% và 20% giá trị ban đầu (màng mới, NWP của màng mới nên được coi là 100%), thì màng nên được thay đổi Trước khi chạy cực nhanh, phải xác định NWP để kiểm tra sự chịu đựng của màng

3 Áp suất qua màng (TMP)

TMP là chức năng của áp lực của chất thấm tích laịvà của cơ chất được điều chỉnh bằng máy đo áp lực để có được các giá trị khác nhau của TMP Các giá trị TMP khác nhau được kiểm tra từ 70 kPa đến 110 kPa để có được giá trị TMP tối ưu Hoạt tính protease, protein hoà tan, tổng chất rắn và chất rắn lơ lửng trong chất thấm tích laịđược trình bày trong hình 1 và 2 Tất cả những

giá trị này (hoạt tính protease,

protein hòa tan, tổng chất rắn và

chất rắn lơ lửng) không thể phát

hiện được trong quá trình thẩm

thấu khi kích thước của các

proteaza kiềm nằm trong khoảng

20-30 kDa Lớn hơn MWCO của

màng 10 kDa Adjalle et al (25

kDa và 30 kDa) trong quá trình

thu hồi thuốc trừ sâu là lớn hơn

MWCO của 5 KDa màng Hoạt

tính protease cao hơn (69

IU/mL), protein hoà tan (7.8

mg/mL), tổng chất rắn(12 g/L)

và chất rắn

lơ lửng (2.7 g/l) thu được với 90 kPa trong số tất cả các giá trị TMP khác được sử dụng Tất cả các thành phần thử nghiệm được cô đặc đến 4,5 lần trong chất thấm tich́ laịhơn so với giá trị ban đầu của họ (dịch nổi) (Table 3) Thực tế là hoạt tính protease không thể phát hiện trong tất cả các chất qua qua màng

Vì vậy, 83% hoạt tính protease đã được thu hồi với TMP với 90 kPa Vì vậy, rõ ràng

là một số protease đã bị mất như là cặn vản trên màng và trong ống TMP cao hơn hoặc thấp hơn 90 kPa là Kết quả là giá trị thấp hơn của hoạt tính protease, protein hoà tan, tổng chất rắn và chất rắn lơ lửng Điều này có thể là do khi TMP thấp hơn giá trị tối ưu, áp suất