tính toán, thiết kế bể phản ứng sản xuất protease kiềm từ bacillus licheniformic với công suất (nhà máy) 200 tấn năm

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Thành phần môi trường dinh dưỡng là một trong những yếu tố quyết định ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật cũng như khả năng sinh

Tiểu luận:

TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ BỂ PHẢN ỨNG SẢN XUẤT PROTEASE KIỀM TỪ BACILLUS LICHENIFORMIC VỚI CÔNG SUẤT (NHÀ

MÁY) 200 TẤN/NĂM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi trường

GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai Nhóm thực hiện: 01

Huỳnh Thị Thu Hà 2008140063

Lê Thị Khánh Hồng 2008140097 Nguyễn Hồng Đào 2008140037 Huỳnh Thị Quế Anh 2008140008

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2017

Mục lục

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về Bacillus licheniformic 2

1.1.1 Hệ thống phân loại: 2

1.1.2 Đặc điểm sinh hóa của Bacillus lichenifomics 3

1.2 Giới thiệu về enzyme protease kiềm 4

1.2.1 Giới thiệu protease 4

1.2.2 Phân loại protease 4

1.2.3 Nguồn gốc 4

1.2.4 Chức năng: 5

1.3 Giới thiệu chung về nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật 6

1.3.1 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme 6

1.3.2 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme bằng phương pháp nuôi cấy chìm: 7 Chương 2 PHÂN TÍCH VÀ LỰA CHỌN CÔNG NGHỆ 10

2.1 Nguyên liệu 10

2.2 Quá trình lên men 10

Chương 3 CÂN BẰNG VẬT CHẤT 11

Chương 4 TÍNH TOÁN THIẾT BỊ 15

4.1 Thiết bị lên men 15

4.2 Tính thể tích, đường kính và chiều cao thiết bị 16

4.3 Thiết kế cánh khuấy 16

4.4 Tính toán kiểm soát nồng độ Oxy: 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

Bacillus licheniformic là vi khuẩn gram dương, hình que, ưa nhiệt Nhiệt độ

tăng trưởng tối ưu khoảng 30°C, tuy nhiên nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều Nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme là 37 °C Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt trong đất, nó có khả năng tạo bào tử Những bào tử này là khá chịu nhiệt, lạnh, bức xạ, và các áp lực môi trường khác Dưới những điều kiện tốt, các bào tử nảy mầm trở thành tế bào vi khuẩn Vì vậy người ta sử dụng nó để sản xuất các enzym, kháng sinh, và các chất chuyển hóa nhỏ trong công nghiệp

Vi khuẩn Bacillus licheniformic

1.1.2 Đặc điểm sinh hóa của Bacillus lichenifomics

- Khả năng sinh enzyme

B.licheniformis có khả năng sinh sản nhiều enzyme, đặc biệt là amylase và protease-2 loại enzyme quan trọng thuộc hệ thống men tiêu hóa, sản sinh các loại enzyme coa khả năng thủy phân glucid, lipid, protid, enzyme cellulase biến đổi chất xơ thành các loại đường dễ tiêu hóa, lecitinase thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải galatin, enzyme phân giải fibrin

- Khả năng ổn định hệ vi khuẩn có ích cho đường ruột

B.licheniformis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương, nấm gây bệnh trên đường ruột người và vật nuôi

Do đó, B.licheniformis có khả năng cạnh tranh tốt đốivới các vi khuẩn gây hại khác

Ngoài ra B.licheniformis giúp cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu chảy, tỉ lệ chết non ở vật nuôi

Làm chất tẩy rửa sinh học

Bacillus licheniformic được nuôi cấy để có được protease sử dụng làm chất tẩy

rửa sinh học Vi khuẩn này thích hợp phát triển trong các điều kiện kiềm, do đó, protease mà nó tạo ra có thể chịu được mức độ pH cao, các thành phần khác của chất tẩy tạo độ pH kiềm Protease có độ pH tối ưu là từ 9 đến 10 và được thêm vào chất tẩy rửa để loại bỏ dầu mỡ, bụi bẩn, các chất có bản chất protein

1.2 Giới thiệu về enzyme protease kiềm

1.2.1 Giới thiệu protease

Proteases (E.C.3.4.21.14) là những enzyme phá vỡ liên kết peptit giữa các axit amin của protein Chúng còn được gọi là enzyme proteolytic Điều rất quan trọng trong việc tiêu hóa là các enzyme phân hủy các protein phức tạp thành các axit amin đơn giản hơn

1.2.2 Phân loại protease

Proteases có 6 nhóm, protease serine, protease threonine, Protease cysteine, protease aspartate, và các kỹ thuật tổng hợp kim Trong vi khuẩn, enzym protease

được sản xuất chủ yếu là Bacillus licheniformic, B.horikoshii, B.sphaericus, B

furmis, B alcalophilus, B Subtilis

nguồn tái tạo Protease vi khuẩn có thể được tạo ra từ vi khuẩn, nấm và nấm men

Vi khuẩn của các chi Bacillusare hoạt động sản xuất các proteaza kiềm ngoại bào Hiện tại, một lượng lớn các proteaza kiềm có trong thương mại có nguồn gốc từ Bacillusstrains

1.2.4 Chức năng:

Proteases có nhiều chức năng và có nhiều ứng dụng công nghệ sinh học quan trọng Đây là một trong ba nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất và tìm thấy ứng dụng trong chất tẩy rửa (để loại bỏ các protein khỏi vải bẩn máu, sữa, mồ hôi, cỏ )

Trong các proteases công nghiệp tơ tằm đã được sử dụng trong quá trình tẩy lụa bằng chất tẩy rửa tổng hợp, đưa đến các chất hoạt động bề mặt không ion Trong ngành công nghiệp da thuộc (dùng để tẩy da, tẩy dầu mỡ và ngâm tẩm

da thuộc da sạch và xanh) da dehairing bằng enzyme dựa trên da đã được coi là một phương pháp thay thế thân thiện với môi trường thông qua quy trình hóa học thông thường

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, để loại bỏ vị đắng không mong muốn trong pho mát chín là một ví dụ về protease trong sản xuất hương vị trong thực phẩm Protease cũng được sử dụng để phục hồi các phần protein của động vật và

cá mà nếu không sẽ bị lãng phí sau khi giết mổ Proteases cũng được sử dụng trong chế biến da cá cho các ứng dụng công nghiệp

Trong ngành dược phẩm, nó được sử dụng để ngăn ngừa quá nhiều máu đóng băng và làm giảm đông máu xu hướng tiểu cầu và hồng cầu Proteases cũng được

sử dụng trong sản xuất thuốc, trong đó enzym có thể được sử dụng như một chất

hỗ trợ tiêu hóa bởi tuyến tụy Ngoài ra, trong các loại thuốc sinh học, protease giúp ngăn ngừa hoặc điều trị các bệnh thoát khỏi tác dụng của thuốc truyền thống, chẳng hạn như ung thư hoặc các bệnh đa dạng phổ biến khác

Một ứng dụng chính khác là xử lý nước thải, nơi các proteaza kiềm có thể hòa tan các protein trong chất thải thông qua một quá trình nhiều bước để thu hồi các chất lỏng cô đặc có giá trị dinh dưỡng cao cho cá và gia súc

1.3 Giới thiệu chung về nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật

1.3.1 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme

Thành phần môi trường dinh dưỡng là một trong những yếu tố quyết định ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme

Để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu cho sụ sinh trưởng của vi sinh vật

và sinh tổng hợp enzyme trong môi trường cần có các chất chứa C, H, O, N và các chất vô cơ khác như Mn, Ca, P, S, Fe, K và một số chất khác

Nguồn C là các hợp chất hữu cơ, trước hết là gluxit Khi sử dụng các đường làm nguồn C cần chú ý đến một số đường có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp một

số enzyme thủy phân như: đường glucose…, ngoài gluxit cũng có thể dùng có thể dùng các nguồn C khác như mỡ, dầu, acid hữu cơ, rượu, trong đó acid lactic được

vi sinh vật hấp thụ dẽ dàng hơn cả chúng có trong nước chiết ngô

Nguồn N: có thể là hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ Các hợp chất hữu cơ có thể là những nuyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô đậu, khô lạc…

Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích tăng trưởng

Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật Ion Mg2+ có khả năng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao Nuôi cấy thu nhận enzyme bằng phương pháp bề mặt Là phương pháp tạo môi trường cho

vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt:

Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng: Phương pháp này dùng để nuôi cấy nhóm vi sinh vật hiếu khí Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV

Nuôi cấy sử dụng bề mặt môi trường bán rắn: Có thể dùng vi sinh vật hiếu khí, bán hiếu khí hoặc kỵ khí ở phương pháp lên men này Nguyên liệu thường được

Nuôi cấy chìm có thể được áp dụng cho tất cả các vi sinh vật, tự hiếu khí đến

kỵ khí Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng Nguyên liệu chính và phổ biến là dịch đường (glucose, fructose, maltose, saccharose ), dịch thủy phân cellulose, tinh bột Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men

Phương pháp nuôi cấy chìm có một số ưu điểm nổi trội như:

 Hiện đại, dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất

 Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện

vệ sinh, vô trùng

 Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thất lớn

Có 3 hình thức lên men chìm áp dụng trong nuôi cấy vi sinh vật là: nuôi cấy gián đoạn , nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất và nuôi cấy liên tục

Lên men gián đoạn (Batch culture): Vi sinh vật được nuôi cố định trong bình lên men với một thể tích môi trường xác định, nguyên liệu và dinh dưỡng được cho vào bể phản ứng ngay từ đâu và không bổ sung thêm nữa, vi sinh vật phát triển theo giai đoạn và tạo ra các sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta tiến hành các công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm Phương pháp lên men chu kỳ được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như các loại enzyme, amino acid, các chất kháng sinh,

Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (Feed - batch culture): Để năng cao năng suất của một mẽ lên men, người ta tiến hành bổ sung thêm cơ chất vào trong quá trình lên men:

 Bổ sung từ từ các chất dinh dưỡng làm tăng thể tích dịch nuôi cấy

 Bổ sung môi trường mới vào Bioreactor đồng thời rút ra một thể tích dịch nuôi cấy (không chứa tế bào) tương ứng, phương pháp này được sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật

Lên men liên tục (Continuous culture): Nguyên liệu liên tục vào, sản phẩm lên men liên tục đi ra Lên men liên tục là quá trình nuôi vi sinh vật trong thiết bị được

cấu tạo đặc biệt để sao cho khi vật nuôi đã phát triển đến một giai đoạn nào đó thích hợp cho việc lấy đi một thể tích môi trường lên men cùng tế bào và các sản phẩm trao đổi chất của chúng, lại bổ sung đúng một thể tích môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy, lúc đó ta có được trạng thái cân bằng động Vi sinh vật trong bình nuôi cấy luôn luôn ở pha lũy thừa Phương pháp lên men liên tục được ứng dụng để sản xuất protein đơn bào (nấm men) sản xuất acid acetic, ethanol và xử lý nước thải của một số nhà máy Tuy nhiên do nhiều nguyên nhân nên phương pháp lên men chu kỳ vẫn hay được ứng dụng hơn

Chương 2 PHÂN TÍCH VÀ LỰA CHỌN CÔNG NGHỆ

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu cho quá trình lên men là một trong những yếu tố rất quan trọng và mang tính quyết định cho thành công của toàn bộ quy trình sản xuất Nguồn nguyên liệu không những phải đảm bảo là cơ chất phù hợp với chủng vi sinh vật

mà còn phải dễ kiếm, chi phí thu mua và chế biến thấp, bên cạnh đó vẫn cho được năng suất cao và ổn định

2.2 Quá trình lên men

Sản xuất protease Bacillus licheniformic NCIM-2042 được mua từ NCL, Pune,

Ấn Độ Các vi sinh vật được nuôi cấy trên các chất dinh dưỡng thạch nghiêng agar

ở 35 ± 2 ◦C và pH 7,5

Sản xuất enzyme protease kiềm từ Bacillus licheniformic theo phương pháp

nuôi cấy gián đoạn theo mẽ với thời gian 72 giờ một mẻ Trong phương pháp nuôi cấy gián đoạn, vi sinh vật sinh trưởng đến khi thành phần chủ yếu của môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt Khi đó mật độ vi sinh vật chuyển từ pha lũy thừa sang pha cân bằng Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của đều kiện nuôi, sự giảm chất dinh dưỡng và tăng khối lượng tế bào cũng thay đổi

Lên men gián đoạn theo mẻ có ưu điểm là tương đối đơn giản và tiết kiệm chi phí cho đầu tư thiết bị, hạn chế vấn đề bị nhiễm trong quá trình lên men, dễ xử lý khi bị tạp nhiễm, có thể phát triển được quy mô lớn,…

Chương 3 CÂN BẰNG VẬT CHẤT Nhà máy sản xuất protease kiềm với công suất 200 tấn/năm

Thời gian nuôi cấy là 72h, ở 35oC, pH = 7.5 (Potumarthi et al., 2006)

Thời gian sản xuất trong năm: 1 năm 365 ngày

 Thời gian bảo trì vệ sinh máy móc, thời gian nghỉ các ngày lễ: 35 ngày

 Thời gian làm việc của công ty trong 1 năm: 330 ngày

Số mẻ sản xuất trong 1 năm: (330*24)/72 = 110 mẻ

Giả sử hiệu suất lên men, lọc, trích ly, cô đặc lần lượt là 95%, 93%, 92%, 99% Hiệu suất quá trình sấy là 95% (Handbook of Industrial Drying, Fourth Edition (Mujumda, 2014)

Hoạt độ của Enzyme sau khi kết thúc quá trình lên men (Emax): 141,750 U/g (Sathyavrathan P.*, Kavitha M., 2013)

Hiệu suất enzyme trên một đơn vị sinh khối (U/gX): YE/X = 102,040 U/gX

Tính toán cho quá trình lên men:

Thành phần môi trường: (Sathyavrathan P.*, Kavitha M., 2013)

Dextrose 0.2

Cám lúa mì chứa khoảng 15.4% là protein (Kew M Chee et al., 2005)

Khối lượng cám lúa mì trong 1 lit môi trường là 100g

Nồng độ protein ban đầu: S0 = 0.154*100 = 15.4 g/l

YX/S =

= = 0.096 g/g Lượng sinh khối ban đầu:

X0 =

=

= 3.241 g/l Suy ra nồng độ sinh khối sau khi kết thúc quá trình lên men là:

Lượng oxi tối thiểu cần cung cấp cho canh trường để đạt được nồng độ 4.63 g/l là:

m = 1818.18*

= 1913.87 (kg/mẻ) Khối lượng enzyme đưa vào cô đặc bằng siêu lọc:

m = 1913.87*

= 1933.2 (kg/mẻ) Khối lượng sản phẩm đưa vào Trích ly:

m = 1933.2*

= 2101.3 (kg/mẻ)

Độ ẩm trước khi lọc là 95% và độ ẩm sau khi lọc là 70%

Khối lượng sản phẩm đưa vào trước khi Lọc

m = 2101.3*

= 2259.47 (kg/mẻ) Thể tích dung dịch canh trường cần phải lọc mỗi mẻ:

V = 2259.47 *

= 13556.82 (l/mẻ) Thể tích canh trường cần phải cung cấp cho mỗi mẻ lên men:

V = 13556.82*

= 14270.33 (l/mẻ) = 14.3 (m3/mẻ)

Chương 4 TÍNH TOÁN THIẾT BỊ 4.1 Thiết bị lên men

Hệ thống bể lên men cánh khuấy Tốc độ sinh trưởng cực đại: μmax = 0.005 h-1

- Hiệu suất tạo thành sinh khối trên một đơn vị cơ chất: YX/S = 0.096 (g/g) có thời gian lên men t = 72h

- Xt = 4.63 (g/l)

- Lượng sinh khối/mẻ = V * Xt = 14.3*4.63 = 66.21 (kg/mẻ)

4.2 Tính thể tích, đường kính và chiều cao thiết bị

- Thể tích canh trường lên men chiếm 2/3 thể tích thiết bị lên men

Vbể = * Vlên men = * 14.3 = 21.45 m3

=> Vbể = 22 m3

- Gọi:

Đường kính bể lên men: Dbể (m)

Chiều cao thiết bị : Hbể (m)

- Tỉ lệ chiều cao thiết bị và đường kính thiết bị thường là 2/1 hoặc 3/1 tức là

- Gọi đường kính cánh khuấy: d (m)

Theo lý thuyết, tỷ lệ giữa đường kính cánh khuấy (d) và đường kính bể (Dbể):

= 0.3 – 0.4 (Charles and Wilson, 2013) nên ta chọn

= 0.3

=> d = 0.3*2.41 = 0.723 m

- Gọi chiều cao cánh khuấy: h (m)