môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP I GIỚI THIỆU Môi trường nuôi cấy thiết kế tùy theo yêu cầu chủng vi sinh vật, phương pháp lên men sản phẩm mục tiêu Trước thiết kế môi trường lên men cần khảo sát chi tiết nhu cầu dinh dưỡng chủng, nguồn chất trực tiếp tạo sản phẩm hệ thống thiết bị công nghệ lên men Tuy nhiên môi trường lên men có chung số yêu cầu Toàn chủng vi sinh vật trình sinh trưởng, phát triển tạo sản phẩm trao đổi chất cần nước, nguồn lượng, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn khoáng vi lượng, vitamin oxygen (đối với trường hợp hiếu khí) Đối với qui mô phòng thí nghiệm việc chuẩn bị môi trường tương đối đơn giản thường dùng hợp chất tinh khiết Tuy nhiên với qui mô sản xuất công nghiệp công đoạn phức tạp Trong công nghiệp người ta dùng nguồn dinh dưỡng khác để chuẩn bị môi trường với yêu cầu thỏa mãn điều kiện sau tốt: • Tăng cường tối đa hiệu suất tạo sinh khối sản phẩm • Tăng cường tối đa nồng độ sinh khối sản phẩm • Cho phép tạo tốc độ sản xuất tối đa • Hạn chế đến mức tối thiểu hiệu suất tổng hợp sản phẩm không mong muốn • Ổn định chất lượng sẵn sàng cho sử dụng quanh năm • Hạn chế đến mức tối thiểu vấn đề nảy sinh, gây trở ngại cho việc khuấy trộn, chiết, tinh xử lí chất thải Cần lưu ý việc chọn môi trường có liên quan mật thiết đến thiết kế nồi lên men, ảnh hưởng đến trình thu hồi sản phẩm trình xử lí chất thải sau lên men Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Hiện nay, có nhiều loại môi trường sử dụng công nghiệp lên men, tùy vào điều kiện mục đích lên men mà người ta thiết kế lựa chọn loại môi trường phù hợp - Dựa vào đặc tính vật lý môi trường mà người ta phân loại thành: + Môi trường lỏng: môi trường chủ yếu phục vụ cho trình lên men chìm + Môi trường rắn: môi trường chủ yếu phục vụ cho trình lên men bề mặt + Môi trường bán rắn (hoặc xốp): phục vụ cho lên men bề mặt - Dựa vào thành phần môi trường người ta phân thành: + Môi trường tự nhiên: nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc động, thực vật Thành phần hoá học xác nguyên liệu môi trường đến chưa biết rõ xác định khó khăn + Môi trường tổng hợp: môi trường có thành phần xác định thường dùng lên men quy mô phòng thí nghiệm + Môi trường bán tổng hợp: bên cạnh thành phần tự nhiên bổ sung lượng xác chất dinh dưỡng, chất kích thích tăng trưởng hay nguyên tố vi lượng - Dựa vào mục đích sử dụng môi trường người ta phân thành: + Môi trường hoạt hóa chủng: dạng môi trường thạch đĩa petri hay môi trường thạch nghiêng ống nghiệm giúp phục hồi đặc tính vốn có chủng vi sinh vật + Môi trường nhân giống: thường môi trường lỏng với quy mô từ 100-500 ml, môi trường giúp tạo lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui trình sản xuất + Môi trường lên men sản xuất: sử dụng nồi lên men sản xuất để thu sinh khối tế bào, sản phẩm biến dưỡng, Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp III CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Nước 1.1 Yêu cầu nước cho lên men  Nước dùng cho xí nghiệp lên men phải đáp ứng yêu cầu nước uống, mùi vị, không màu, suốt Các yêu cầu nước uống sau: • Độ cứng chung, mg đương lượng không • Hàm lượng chất, mg/l không Cặn khô 1000 Clorit 350 Sunfat 500 Chì 0,1 Acsen 0.05 Fluor 1,5 Đồng 3,0 Kẽm 5,0 • Tổng số lượng vi sinh vật 1ml không 100 (CFU/ml) • Số lượng trực khuẩn đường ruột 1l nước: Chuẩn coli, ml, không nhỏ 300 Chỉ số coli, không lớn  Đối với nguồn nước giếng thủy vực cho phép chuẩn coli không nhỏ 100 (chỉ số coli 10) Nói chung nước uống không cho phép có mặt ammoniac muối acid nitrit, muối kim loại nặng (thủy ngân, bari…) Độ oxi hóa nước không vượt 3,0mg O2/l Trong số trường hợp riêng biệt, đồng ý quan giám sát vệ sinh cho phép độ cứng chung không 14 mg đương lượng  Nước dùng cho sản xuất bia, yêu cầu chung chất lượng nước có yêu cầu cụ thể sau: Carbon với giới hạn nồng độ, mg/l 50 Sunfat 350 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp Clorit 150 Nitrat 40 SiO2 20 Muối Mg 100 Sắt 0,3 Amoniac 0,1 Độ oxy hóa mgO2/l Độ cứng tạm thời bia sáng màu vào khoảng 0,71 mg đương lượng độ cứng vĩnh cửu 0,36- 0,72 mg đương lượng, bia sẫm màu, độ cứng tạm thời 2,85 – 4,8 mg đương lượng độ cứng vĩnh cửu không xác định  Nước dùng pha nước rượu có độ cứng chung không 1,6 mg đương lượng độ cứng tạm thời 0.36 mg đương lượng Nếu nước có chứa chất rắn lơ lửng, độ cứng vượt tiêu chuẩn cần phải xử lí trước sử dụng 1.2 Xử lí nước Với mục đích loại chất rắn có nước giảm độ cứng ta sử dụng phương pháp sau: • Lắng lọc • Đông tụ • Loại muối canxi magie làm mềm phương pháp lắng đọng trao đổi ion a) Lắng đọng lọc nước Để tách nước khỏi vật thể nhỏ, thường để lắng lọc Lắng trình lắng đọng tác dụng trọng lực, lọc trình tách vật rắn khỏi nước nhờ lỗ hở khe hở vật liệu lọc giữ lại vật thể rắn có kích thước lớn lỗ màng vật liệu Lắng cặn thường chậm, yêu cầu phải có bể với diện tích mặt lớn, sử dụng Phương pháp phổ biến cho việc tách vật thể rắn nhỏ khỏi nước lọc với vật liệu lọc cát vàng, sỏi, than đá đập nhỏ b) Đông tụ hay keo tụ Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp Khi nước keo khó cho việc lọc bình thường Trong trường hợp này, cần bổ sung chất keo tụ làm cho thể keo kết lại với kích thước lớn sau để lắng cặn Quá trình họi đông tụ Những chất làm đông tụ sunfat nhôm, sunfat sắt Sunfat nhôm gọi phèn Có hai dạng phèn đơn phèn kép Ngày người ta tạo dạng polymer dạng phèn có khả đông tụ cao Sunfat nhôm cho vào nước phản ứng với bicarbonat canxi magie: Al2(SO4)3 + 3Ca(HCO3)2 = 2Al(HCO3)3 + 3CaSO4 Al(HCO3)3 không bền phân hủy thành nhôm carbonic Al(HCO3)3 = Al(OH)3 + CO2 Hydroxit nhôm tạo thành dạng dịch keo, dịch thể keo mang điện dương, xảy keo tụ thể keo nước hydroxit nhôm, tạo thành cặn lắng xuống đáy Cặn lắng kéo theo vật thể rắn nhỏ dạng huyền phù, để lắng lọc c) Làm mềm nước Làm mềm nước tiến hành phương pháp với vôi, xút vôi trao đổi ion Phương pháp dùng vôi làm mềm nước thường dùng với nước có độ cứng tạm thời cao độ cứng vĩnh cửu thấp Phản ứng xảy sau: Ca(HCO3)2 + Ca(OH)2 = 2CaCO3 + 2H2O Mg(HCO3)2 + Ca(OH)2 = CaCO3 + MgCO3 + 2H2O MgCO3 hòa tan tốt nước lại phản ứng với hydroxyt canxi thành Mg(OH)2 không tan MgCO3 + Ca(OH)2 = Mg(OH)2 + CaCO3 Sau đem lọc Để làm giảm độ cứng tạm thời độ cứng vĩnh cửu nước, người ta sử dụng phương pháp xút vôi (hydroxyt canxi natri carbonat): hydroxyt canxi làm kết lắng muối độ cứng tạm thời, natri carbonat – muối độ cứng vĩnh cửu CaSO4 + Na2CO3 = CaCO3 + Na2SO4 MgSO4 + Na2CO3 = MgCO3 + Na2SO4 MgCO3 + Ca(OH)2 = Mg(OH)2 + CaCO3 Các cặn lắng lọc bỏ Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp d) Phương pháp trao đổi ion Trao đổi ion trao đổi ion nước với nhựa ionit Nhựa ionit vật liệu rắn không tan nước, có khả trao đổi ion Nếu nhựa có khả trao đổi với cation gọi catinoit, ngược lại anionit Ionit chất hữu hay vô cơ, có tự nhiên nhân tạo Các cationit có nguồn gốc vô tự nhiên nhóm silicat alumin (nhôm silicat), xeolit, đất sét, glaucolit (kali sắt alumino silicat),… Những ionit tổng hợp nhân tạo permunit (aluminat silicat acid yếu) Ionit hữu tự nhiên acid humic có đất, có tác dụng điều chỉnh dinh dưỡng thực vật acid humic than đá, than nâu Trong xí nghiệp lên men hay dùng than lưu huỳnh để làm mềm nước Khi lọc nước qua than lưu huỳnh (Na – cation) xảy phản ứng sau: Na2R + CaSO4 = CaR + CaSO4 Na2R + CaCl2 = CaR + 2NaCl Na2R + MgSO4 = MgR + Na2SO4 Na2R + MgCl2 = MgR + 2NaCl Na2R + Ca(HCO3)2 = CaR + 2NaHCO3 Na2R + Mg(HCO3)2 = MgR + 2NaHCO3 R phức cationit Làm mềm nước than lưu huỳnh cationit khác thực ống lọc đứng Các ống ống kim loại hình trụ kín Dưới đáy ống lọc để lớp lót hạt than đá có kích thước xác định.Trên lớp lót đổ đầy nhựa cationit Sau cho nước chảy từ từ qua cột Trong xảy trao đổi ion: tất ion Na+ trao đổi với ion Ca 2+ Mg2+ Khả trao đổi ion nhựa giảm dần theo thời gian Để phục hồi khả ta cho chảy vào cột dung dịch NaCl: CaR + 2NaCl = Na2R + CaCl2 MgR + 2NaCl = Na2R + MgCl2 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp Dùng Na- cation làm cho nước giảm độ cứng đáng kể, phương pháp không làm giảm độ kiềm nước Nếu yêu cầu làm giảm độ kiềm, acid hóa nước mềm acid sunfuric acid clohydric Phản ứng trung hòa xảy sau: 2NaHCO3 + H2SO4 = Na2SO4 + 2H2O + 2CO2 Có thể làm mềm nước cách kết hợp hai phương pháp với vôi Na – cationit Vôi khử độ cứng tạm thời, Na – cationit loại muối vĩnh cửu Cũng dùng H- cationit làm mềm nước Ion H + trao đổi với ion Ca 2+ Mg2+ Nước chảy qua phin lọc chứa nhựa H – cationit phản ứng xảy sau: H2R + Ca(HCO3)2 = CaR + 2H2O + 2CO2 H2R + + Mg(HCO3)2 = MgR + 2H2O + 2CO2 H2R + CaSO4 = CaR + H2SO4 H2R + CaCl2 = CaR + 2HCl H2R + MgSO4 = MgR + H2SO4 H2R + MgCl2 = MgR + 2HCl Trong dung dịch H – cationit, acid vô tự tạo thành (acid sunfuric clohydric) Các acid ăn mòn kim loại Do vậy, người ta thường dùng H – Na – cationit liên tiếp đồng thời Khi sử dụng đồng thời phần nước cho chảy qua phin lọc chứa Na – cationit, phần nước khác chảy qua phin H – caionit Nước qua Na – cationit kiềm hóa, qua H – cationit – acid hóa Cho hai loại nước chảy chung với xảy phản ứng trung hòa Cũng cho nước chảy qua phin lọc liên tiếp thu nước trung hòa: H2SO4 + Ca(HCO3)2 = CaSO4 + 2H2O + 2CO2 2HCl + Ca(HCO3)2 = CaCl2 + 2H2O + 2CO2 Để khử muối cho nước, người ta cho nước chảy liên tiếp vào lọc H – cationit lọc anionit Trong phin lọc thứ có ion nước Ca 2+, Mg2+, Na+ ion khác trao đổi với ion H + cationit, CO2 thoát Để khử anion nước, người ta cho nước qua lọc chứa anion dạng OH- phản ứng xảy sau: 2ROH + H2SO4 = R2SO4 + 2H2O Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp ROH + HCl = RCl + H2O Vì vậy, cho nước chảy qua phin lọc loại bỏ tất cation anion nước Tái sinh phin lọc H – cationit cách cho dung dịch H2SO4 HCl chảy qua, tái sinh lọc anionit dạng OH- dung dịch xút 1.3 Khử khuẩn cho nước Nước cung cấp cho lên men nhiễm khuẩn vượt mức cho phép cần phải tiến hành diệt khuẩn Diệt khuẩn phương pháp hóa học phương pháp vật lí, kết hợp phương pháp: a) Khử khuẩn Clo Phương pháp clorit diệt khuẩn, dùng với khí clo clorua vôi (hypoclorit vôi – Ca(ClO)2) nước Javel (hypoclorit Natri – NaClO) Trong nước Cl OCl- có tính sát khuẩn gọi Clo hoạt tính Cl2 + H2O = HOCl + HCL HOCl  H+ + OCl- (ion OCl-này không bền dễ bị phân hủy thành H Cl) H Cl có tác dụng diệt khuẩn Cl2 + 2NaOH = NaClO (nước Javel) + NaCl + H2O NaClO  Na+ + OCl- (dễ phân ly thành Cl O) Cl2 + 2Ca(OH)2 = Ca(ClO)2 + CaCl2 + H2O Sát khuẩn cho nước thường dùng khí clo (Cl 2) bình thép clo hóa nước cần với nồng độ 0,1 – 0,2 mg/l Nước Javel dạng lỏng chất oxy hóa mạnh, có tính sát khuẩn cao Clorua vôi dạng bột: hòa tan thành dịch – 5% cho vào nước Hiện diệt khuẩn người ta hay dùng hợp chất clo viên cloramin B (CH 3C6H4SO2NaNCl) Dung dịch cloramin B 0,02% ức chế tụ cầu vàng diệt khuẩn đường ruột Các viên thường có 20 – 40% lượng clo hoạt động.Thời gian khử khuẩn khoảng 20 – 40 phút Dùng clo diệt khuẩn cho nước thường dư chút hóa chất nước làm cho nước có mùi clo Để khắc phục, người ta thường gia nhiệt thổi khí cho nước Dùng clo có nhược điểm yếu nước có mặt hợp chất Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp phenol clo dễ kết hợp với phenol tạo thành clophenol Hợp chất với nồng độ vô nhỏ làm cho nước có mùi khó chịu Một điều cần lưu ý: dùng clo diệt khuẩn cho nước với điều kiện nước chứa chất hữu Nếu nồng độ chất hữu cao dễ tạo thành phức chứa clo dạng AOX Dạng gây độc tác nhân gây ung thư b) Khử khuẩn ozon Ozon có công thức O3 dễ bị phân hủy thành O O O nguyên tử có tác dụng diệt khuẩn Dưới tác dụng tia lửa điện điện cực, oxy không khí tạo thành ozon Nồng độ ozon khỏi thiết bị tạo ozon – 2% hỗn hợp khí đưa vào nước để sát khuẩn Ozon dễ hòa tan vào nước, liều diệt khuẩn 2- 15mg/l Khi hòa vào nước, tác dụng diệt khuẩn chưa rõ ràng, đủ lượng, ozon diệt khuẩn – 8s Phương pháp tiện lợi, cần phải trang bị thiết bị sinh ozon với tần số cao Ngoài hai phương pháp trên, người ta sử dụng ion bạc sát khuẩn nước Dịch chứa ion với nồng độ thấp có khả sát khuẩn c) Khử khuẩn tia cực tím (UV) Trong ánh nắng mặt trời có tia cực tím Đèn thủy ngân – thạch anh áp lực cao đèn thủy ngân – argon áp lực thấp sinh tia cực tím Tia cực tím phát từ đèn chiếu qua nước Yêu cầu nước phải ít, chất hữu Nhược điểm tia cực tím không xuyên qua vật rắn Với nước, diệt khuẩn ozon clo có chi phí cao, phần nhiều chi phí thiết bị Nguồn lượng Năng lượng cho tăng trưởng vi sinh vật bắt nguồn từ oxy hóa thành phần dinh dưỡng môi trường từ ánh sáng Hầu hết công nghiệp vi sinh, chủng thường dùng hóa dưỡng Do vậy, nguồn lượng thông dụng dùng từ nguồn carbon carbohydrate, lipid protein Một vài chủng Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp dùng hydrocarbon hay methanol làm nguồn C lượng cho trình tăng trưởng trao đổi chất Chu trình TCA vừa cung cấp acid hữu làm khung C để hình thành chất quan trọng khác cung cấp cho tế bào mặt khác cung cấp chất mang lượng lớn NADH, FADH, chất sau di vào chuỗi chuyển điện tử để tổng hợp ATP cung cấp nguồn lượng lớn cho hoạt động tế bào Các carbohydrate thường sử dụng: glucose, lactose, succrose, xylose Các protein: lysine, tryptophan, glycine  Đường phân (Embden, Meyerhof Parnas [EMP] Pathway) Đây đường phổ biến vi khuẩn dị hóa đường (nó tìm thấy hầu hết tế bào động thực vật) Một loạt trình chuyển đổi đường thành pyruvate, tạo ATP (adenosine triphosphate) NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) Năng lượng hóa học cần thiết cho mục đích sinh tổng hợp lưu trữ hợp chất thành lập (ATP NADH) * đề cập đến số lượng nguyên tử carbon phân tử Có lựa chọn thay cho đường cho việc chuyển hóa đường để sản xuất lượng lưu trữ ATP Chúng bao gồm đường pentose phosphate tìm thấy hầu hết tế bào động thực vật NADPH tạo đường Một đường khác, đường Entner-Doudoroff thường tìm thấy tế bào vi khuẩn định  Hô hấp kỵ khí Hô hấp kỵ khí bao gồm đường phân lên men Trong giai đoạn sau trình NADH (tạo trình đường phân) chuyển đổi trở lại NAD 10 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp Bảng 4.3: Thành phần hàm lượng nguyên tố tế bào vi sinh vật Dựa vào thành phần hàm lượng chất tế bào vi sinh vật để thiết kế đủ thành phần lượng cần thiết nhằm thu nhận sinh khối theo yêu cầu, bảo đảm sản xuất Bảng 4.4: Phân tích thành phần số chủng vi sinh vật 28 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp Từ kết phân tích thành phần tế bào Bảng 4.4 cho thấy, hàm lượng C thay đổi từ 46-50%, H từ 6-7%, N từ 8-14% O từ 29-35% Sự thay đổi tùy thuộc vào chất điều kiện tăng trưởng Trong tính toán kỹ thuật, người ta sử dụng công thức chung vi sinh vật là: CH1,8O0,5N0,2 Dựa công thức này, trọng lượng phân tử tế bào xác định là: 24,6 Từ đó, muốn sản xuất m (g) tế bào có công thức CH 1,8O0,5N0,2 sử dụng chất có công thức C xHyOZNt làm nguồn carbon lượng chất tối thiểu cần thiết môi trường: 1/x × m/24,6 × M (g) Với: x: số C m: khối lượng sinh khối tế bào thu Khối lượng phân tử tế bào: 24,6 M: khối lượng phân tử chất cần dùng Ví dụ: Muốn sản xuất thu 10g tế bào sử dụng glucose làm nguồn carbon luợng glucose tối thiểu cần thiết môi truờng phải bao nhiêu? Giải: Glucose C6H12O6 , M = 180 Số phân tử mol tế bào cần là: 10/24,6 Số mol glucose cần: (1/6) x (10/24,6) Lượng glucose cần: (1/6) x (10/24,6) x 180 = 12,2g 29 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp  MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG Môi trường sinh tổng hợp Amylase (Underkofler, 1966)  Phân tích thành phần môi trường: − Dịch thủy phân đậu nành, dịch chiết nấm men thủy phân, dịch thủy phân casein: nguồn nitrogen tự nhiên bổ sung vào môi trường để kích thích sinh trưởng vi sinh vật Riêng B subtilis DC5 tất nguồn nitơ kích thích làm tăng hoạt độ amylase, cao nấm có tác dụng kích thích mạnh nhất, có lẽ tế bào cần nitơ để tổng hợp protein Một số công trình công bố cho kết tương tự Hamilton cộng (1999) kết luận bổ sung 2% cao nấm vào môi trường nuôi cấy chủng Bacillus sp IMD 435 khả sinh tổng hợp amylase cao nhất; Đỗ Thị Bích Thủy đồng tác giả (2008) cho thấy cao nấm nguồn dinh dưỡng có tác dụng kích thích làm tăng hoạt độ amylase nhiều chủng B subtilis C10 − Lactose: nguồn carbon, cung cấp lượng, dinh dưỡng cho vi sinh vật sử dụng Theo báo “Ảnh hưởng số yếu tố lên trình thu nhận chế phẩm amylase ngoại bào từ Bacillus subtilis DC5” Phạm Trần Thùy Hương cộng chủng B subtilis DC5 có nguồn lactose có khả kích thích làm tăng hoạt độ amylase nguồn carbon khác làm giảm hoạt độ amylase Điều có lẽ chủng B subtilis DC5 có khả tiết enzyme ngoại bào thuỷ phân đường lactose, amylase ngoại bào chủng thiếu tính đặc hiệu với liên kết α-D1,4-glucoside nên thuỷ phân mối liên kết β-D-1,4-glucoside phân tử đường lactose Vì lactose xem chất cảm ứng để chủng tiết amylase − MgSO4.7H2O: nguồn dinh dưỡng khoáng cần cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật − Chất phá bọt: thường loại dầu, loại bỏ bọt khí tạo trình sục khí 30 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp Môi trường sản xuất glutamic acid (Gore cộng sự, 1968)  Phân tích thành phần môi trường: − Dextrose: hay gọi D-glucose, nguồn carbon lên men sản xuất acid glutamic Nó đường khử chiếm khoảng 20% mật rỉ đường mía, thường dùng để tạo vị − NH4H2PO4, (NH4)2HPO4: nguồn N sản xuất acid glutamic.Vì thời gian lên men, pH chuyển dần sang acid hình thành acid glutamic; nên người ta thường bổ sung vào môi trường nguồn nitrogen vô để giữ ổn định độ pH cho vi khuẩn hoạt động tốt Nguồn nitrogen bổ sung vào nhằm ức chế sản sinh chất kháng sinh toàn nguồn nitrogen sử dụng hết − Các muối sulfate K2SO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, FeSO4.7H2O: nguồn dinh dưỡng khoáng bổ sung vào môi trường cần cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật − Polyglycol 2000: sử dụng tác nhân chống tạo bọt thực phẩm − Biotin: vitamin, có vai trò quan trọng lên men acid glutamic Biotin không chất kích thích sinh trưởng mà định thành phần số lượng sản phẩm lên men Bởi vì, nồng độ biotin cao, nên bổ sung lượng rỉ đường thấp hơn, vượt gây tượng sinh khối phát triển mạnh, khả sinh tổng hợp acid glutamic thấp Nếu hàm lượng biotin môi trường cao phải bổ sung thêm chất ức chế sinh tổng hợp lipoglucoprotein − Penicillin: bổ sung vào môi trường làm tăng khả sinh tổng hợp chủng vi sinh vật Vì penicillin chất kìm hãm có ảnh hưởng đến tính thấm màng tế bào, việc bổ 31 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp sung penicillin gây hư hại tính thấm có ý nghĩa thực tiễn nhờ vi sinh vật sử dụng nguyên liệu phức tạp rỉ đường Ngoài penicillin ra, người ta nghiên cứu sử dụng chất kháng sinh khác như: cephlosporin C, oxamycin, novobiocin, tetracylin, bacitracin, cloramfenicol, streptomycin dextromycin − Dầu phá bọt: khuấy trộn, sục khí lên men thải CO nên tạo bọt nhiều, chúng làm giảm trao đổi chất trình lên men làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị Do đó, phá bọt có tác dụng tốt cho trình lên men Song có nhiều dầu gây nên ảnh hưởng có hại, dầu bám vào bề mặt tế bào ngăn cản trình trao đổi chất Để phá bọt kịp thời lúc ta dựa vào kinh nghiệm: • Khi bọt xốp, to dễ vỡ va chạm vào gạt bọt chưa cần cho • Bọt nhỏ, mịn dai cần cho dầu vào phá bọt, lượng dầu cho vào vừa đủ để bọt tan, thông thường với thiết bị lên men 50m3 cho vào chừng lít Các loại dầu phá bọt dùng là: dầu lạc tinh chế, dầu đậu, axit oleic, dầu ôliu, • Để tránh cho môi trường lên men khỏi bị nhiễm trùng dầu mang vào, dầu trước cho vào phá bọt phải trùng làm nguội, thường trùng dầu nhiệt độ 120 ÷ 140°C 120 phút Môi trường sản xuất penicillin - Glucose rỉ đường (feed liên tục) 10% - Dịch chiết bắp 4-5% - Phenylacetic acid 0,5-0,8% - Lard oil (hoặc dầu thực vật) dùng làm chất phá bọt 0,5% - pH 6.5-7.5  Phân tích thành phần môi trường: − Glucose rỉ đường: nguồn cung cấp carbon − Dịch chiết bắp: bổ sung hàm lượng khoáng, nguồn cung cấp N, dư thừa hiệu sinh tổng hợp penicillin giảm, thiếu xảy tượng tự phân hệ sợi − Phenylacetic acid: tiền chất tạo nhánh cho phân tử penicillin, thường bổ sung liên tục theo nhu cầu lên men 32 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp − Lard oil (hoặc dầu thực vật) dùng làm chất phá bọt, loại bỏ bọt khí tạo trình sục khí Ngoài ra, sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử dụng phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính toán điều chỉnh nồng độ glucose môi trường lên men (và cản trở tình chuyển khối ảnh huởng dầu phá bọt) Môi trường sản xuất endotoxyn từ Baccillus thuringiensis - Rỉ đường 0-4% - Bột đậu nành 2-6% - KH2PO4 0,5% - K2HPO4 0,5% - MgSO4 0,0005% - MnSO4 0,003% - FeSO4 0,001% - CaCl2 0,005% - Na(NH4)2PO4.4H2O 0,15%  Phân tích thành phần môi trường: − Rỉ đường: nguồn cung cấp carbon, chứa hàm lượng lớn biotin - chất sinh trưởng cần thiết cho nhiều loại vi sinh vật chất điều hòa trình sinh tổng hợp acid amin − Bột đậu nành: nguồn cung cấp nitơ − Các chất lại KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, MnSO4, FeSO4, CaCl2, Na(NH4)2PO4.4H2O: bổ sung nguyên tố khoáng cần thiết Môi trường lên men L-lysine từ rỉ đường - Rỉ đường 12-20% - (NH4)2SO4 24g/l - KH2PO4 0,5g/l - MgSO4 0,4g/l - Tiamine 200g/l 33 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp - Treonin 0,2-0,8g/l - Methionine 0,15-0,25g/l - Biotin 15-20g/l  Phân tích thành phần môi trường: − Với rỉ đường nguồn carbon, (NH4)2SO4 nguồn nitơ, muối khoáng dinh dưỡng nguồn chất cần thiết cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật − Tiamine, Treonin, Methionine: acid amine ảnh hưởng đến hiệu suất sinh lysine − Biotin chất kích thích sinh trưởng vi sinh vật V ĐÁNH GIÁ MÔI TRƯỜNG  Mục đích: • Bảo đảm mặt kỹ thuật: phù hợp, hiệu cao • Yếu tố kinh tế: giá thành sản xuất thấp, tính ổn định • Yếu tố an toàn cho sản phẩm  Dựa tiêu chí: Thành phần Lượng Chất lượng Giá Tính ổn định nguồn nguyên liệu VI PHƯƠNG PHÁP ĐƯỜNG HÓA TẠO DUNG DỊCH GLUCOSE TỪ TINH BỘT  Tinh bột (starch): carbohydrate dự trữ phổ biến thực vật, nguồn nguyên liệu có nguồn gốc nông nghiệp gạo, ngô (đã tách phôi), sắn, khoai tây, đại mạch, yến mạch, cao lương…, sử dụng để sản xuất đường glucose Trước đưa vào khâu đường hóa, nguồn tinh bột phải qua xử lý nghiền nhỏ vỡ mảnh, nấu chín  Cấu trúc hóa học tinh bột: 34 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp − Tinh bột cấu tạo từ loại polysaccharid: • Amylose: chuỗi gồm hàng nghìn đơn vị β-D-glucose nối theo liên kết (1 4), mạch thẳng, phân nhánh • Amylopectin: có phân tử lượng lớn khoảng 10 -107 gồm 5000-50000 đơn vị glucose phân nhánh nhiều Các đơn vị α-D-glucose mạch nối với theo liên kết (14), chỗ phân nhánh theo liên kết (16) Tinh bột từ tất nguồn thực vật thường dạng hạt Các loại hạt khác biệt rõ rệt kích thước tính chất vật lý Những khác biệt mặt hoá học không rõ nét Sự khác biệt tỷ lệ amylose amylopectin; ví dụ tinh bột ngô từ ngô sáp chứa 2% amylose từ ngô vàng khoảng 80% amylose Một số tinh bột, ví 35 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp dụ khoai tây, có chứa lượng nhỏ phosphat (khoảng 0,2%), có tác dụng đáng kể đến tính chất vật lý tinh bột, không can thiệp vào thủy phân  Thủy phân tinh bột: Phương trình phản ứng thủy phân tinh bột thành đường glucose: (C6H10O5)nH2O MW: + (n-1)H2O → nC6H12O6 (162n + 18) (n ≥ 1) 180n Hiệu suất đường hóa = 180n/(162n + 18) Tùy theo loại tinh bột mà n có khoảng giá trị khác Do vậy, loại tinh bột hiệu suất đường hóa cực đại khác Hiệu suất đường hóa lớn toàn đơn phân glucose phân tử tinh bột cắt rời hoàn toàn, số lượng đơn phân dung dịch đạt cực đại Hiệu suất đường hóa tối đa = lim(180n/(162n + 18)) × 100 = 111,11% n→∞ Tác nhân thủy phân tinh bột thành đường glucose H2SO4 enzyme  Nhược điểm sử dụng H2SO4: hiệu suất thủy phân không cao, ổn định, thiết bị sử dụng đắt tiền, an toàn cho công nhân vận hành, dung dịch glucose có độ màu cao, chứa nhiều dư lượng SO42- gây ảnh hưởng xấu sử dụng cho môi trường lên men Ngày nay, công nghiệp sản xuất đường glucose từ tinh bột, người ta thường dùng enzyme amyloase, glucose amylase… enzyme khác enzyme nguồn gốc khác khả thủy phân khác Sự thủy phân tinh bột axit sử dụng rộng rãi khứ Nhưng thay trình enzyme  Ưu điểm sử dụng enzyme (amyloase glucose amyloase): tách chiết amylase từ chủng vi sinh vật chịu nhiệt phân lập từ suối nước nóng amylase có khả chịu nhiệt cao mà không bị hoạt tính; lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho trình tinh đường ENZYME α-Amylase NGUỒN TÁC DỤNG Chỉ cắt liên kết α-1,4 oligosaccharide Bacillus 36 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp tạo α-dextrins maltose (G2), G3, G6 G7 oligosaccharides Chỉ cắt liên kết α-1,4 oligosaccharide B licheniformis tạo α-dextrins maltose, G3, G4 G5 oligosaccharides Chỉ cắt liên kết α-1,4 oligosaccharide Aspergillus oryzae tạo α-dextrins, maltose G3 oligosaccharides Chỉ cắt liên kết α-1,4 oligosaccharide Saccharifyinga- B.subtilis tạo α-dextrins với maltose, G3, G4 amylase (amylosacchariticus) lên đến 50% (w/w) glucose Chỉ cắt liên kết α-1,4 tạo dextrins β-Amylase Malted lúa mạch giới hạn β-maltose Cắt liên kết α-1,4 α-1,6 cho βGlucoamylase A.niger glucose Chỉ cắt liên kết α-1,6 tạo maltodextrins Pullulanase B acidopullulyticus mạch thẳng  Khi thủy phân tinh bột thành đường glucose enzyme cần thông qua hai amyloliquefaciens giai đoạn:  Quá trình dịch hóa (liquefaction): Sử dụng enzyme α-amylase để thủy phân tinh bột thành đoạn oligosacchride mạch ngắn Phản ứng đuợc thực pH 5-6,5, nhiệt độ 70-105 oC thời gian khoảng 90-120 phút với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,8-1,3 L/t DS Nồng độ tinh bột dịch bột thích hợp cho phản ứng 30-35% Sản phẩm trình dịch hóa dung dịch chứa oligosacchride với DE (dextrose equivent) khoảng 12-20% Với thành phần thuận lợi cho giai đoạn phân cắt  Quá trình đuờng hóa (saccharification): − Phản ứng thủy phân đuợc thực enzyme glucose amylase, có đặc điểm thủy phân oligosaccharide thành đơn phân glucose − Phản ứng diễn pH 4,0-4,5, nhiệt độ tối ưu khoảng 60-62 oC Với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,35-0,5 L/t DBS (dried base starch) sau khoảng thời gian 60-80 thu đuợc dung dịch đường glucose với hiệu suất đuờng hóa đạt khoảng 110% 37 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp VII XỬ LÝ MẬT RỈ MÍA ĐƯỜNG TẠO DUNG DỊCH ĐƯỜNG PHỤC VỤ CHO LÊN MEN Khái niệm, thành phần: Rỉ đường hay rỉ mật, mật rỉ, mật rỉ đường, gọi ngắn gọn mật, chất lỏng đặc sánh lại sau rút đường phương pháp cô kết tinh Đây sản phẩm phụ công nghiệp chế biến đường (đường mía, đường nho, đường củ cải) Chất lượng rỉ đường phụ thuộc vào độ chín mía củ cải nguyên liệu, lượng đường chiết phương pháp chiết đường Thành phần mật rỉ đường mía (cane molasses) Việt Nam: Hàm lượng đường tổng số 46-60 Hàm lượng Ca2+ 0,3-1,2 Hàm lượng K+ 1,8-5,0 Màu l400nm (*250) 0,2-1,3 Tỷ trọng 1,4-1,7 Phương pháp xử lý mật rỉ đường trước dùng cho qui trình lên men: Một số chủng vi sinh vật sử dụng đường sucrose trực tiếp cho qui trình lên men (những chủng có hệ enzyme SPT…).Tuy nhiên, số chủng sử dụng đường đơn glucose fructose Có nhiều phương pháp để thuỷ phân sucrose: − Phương pháp thuỷ phân acid (H2SO4) − Phương pháp dùng enzyme invertase 2.1 Phương pháp thuỷ phân acid H2SO4 Thông thường H2SO4 sử dụng để thủy phân đường sucrose thành đường glucose fructose Mặt khác, thành phần mật rỉ đường có chứa làm lượng Ca 2+ cao, gây ức chế cho tăng trưởng vi sinh vật ảnh hưởng không tốt đến trình lên men thu hồi sản phẩm sau lên men Loại bỏ Ca 2+ việc sử dụng H2SO4 gốc SO42- phản ứng với Ca 2+ để tạo muối CaSO4 tan loại khỏi dung dịch đường cách ly tâm Sucrose + H+ → Glucose + Fructose Ca2+ + SO42- → CaSO4 (ít tan) 38 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp  Qui trình thực hiện: Pha loãng mật rỉ đường nồng độ thích hợp (thường từ khoảng 35-40%) → bổ sung H2SO4 (pH =2.5 → 3.0, t0= 50-600 C, 48-60h) → ly tâm 2000- 3000g (để loại CaSO4) Hiệu suất thủy phân glucose = 98% Lưu ý: trường hợp hàm lượng K+ mật rỉ đường cao, tạo nhiều K 2Ca(SO4)2, cần phải tăng lực ly tâm để tách loại triệt để 2.2 Phương pháp dùng enzyme invertase − Invertase loại enzyme thủy phân saccharose sử dụng phổ biến công nghiệp nước giải khát bánh Invertase có động thực vật, vi sinh vật đặc biệt nấm men có khả tổng hợp invertase cao − Phản ứng thủy phân saccharose invertase xúc tác sau: Saccharose α-Glucose + β-Fructose (đường khử) − Quy trình: nhân giống sản xuất không tiệt trùng phải có độ pH ổn định 4,0 Gây men giống thực theo số liệu sau đây: Dung tích gây men Nồng độ (%) Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Sục khí Thùng 200300 lít 15-16 28-30 15-18 Sục nhẹ Thùng 20003000 lít 17-18 28-30 12-15 Sục mạnh Thùng 10000 lít (khi lên men liên tục) 17-18 28-30 8-10 Sục mạnh 34 m3/m3.giờ Công dụng: − Phụ gia chế biến thức ăn chăn nuôi − Bổ sung vào đất trồng để tăng hoạt tính sinh học đất − Xử lý rác thải 39 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp − Sử dụng thủy canh để cung cấp dinh dưỡng cho trồng, gồm loại carbohydrat thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào thực vật trồng sử dụng nhanh deoxyribose, lyxose, ribose, xylulose xylose VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tài liệu nước Principles of fermentation technology second edition, P.F.Stanbury, A.Whitaker and S.J Hall • Tài liệu tiếng Việt “Ảnh hưởng số yếu tố lên trình thu nhận chế phẩm amylase ngoại bào từ Bacillus subtilis DC5”, Phạm Trần Thùy Hương cộng sự, tạp chí khoa học Đại học Huế “Công nghệ sản xuất mì sản phẩm lên men cổ truyền”, Nguyễn Thị Hiền, Đại học bách khoa Hà Nội Công nghệ lên men, PGS.TS Lương Đức Phẩm “Nghiên cứu môi trường sản xuất penicillin từ vi sinh vật”, nhóm sinh viên với hướng dẫn Ths Nguyễn Thị Lâm Đòan, Đại học lâm nghiệp Hà Nội Kĩ thuật lên men công nghiệp, Hoàng Văn Quốc Chương, 2011 Sinh hóa – Phần II, Tủ sách trường Đại học Khoa học Tự nhiên Nguyễn Đình Huyên, Hà Ái Quốc, Đồng Thị Thanh Thu, 2006 http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8462151/1/ 40 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp MỤC LỤC I GIỚI THIỆU II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN MEN III CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Nước 1.1 Yêu cầu nước cho lên men 1.2 Xử lí nước .5 1.2.a Lắng đọng lọc nước 1.2.b Đông tụ hay keo tụ .5 1.2.c Làm mềm nước 1.2.d Phương pháp trao đổi ion .7 1.3 Khử khuẩn cho nước .9 1.3.a Khử khuẩn clo .9 1.3.b Khử khuẩn ozon 10 1.3.c Khử khuẩn tia cực tím (UV) 10 Nguồn lượng .10 Nguồn carbon .15 Nguồn nitrogen 16 Các nguyên tố khoáng trung – vi lượng .19 Chelator (chất kìm) 22 Nhân tố tăng trưởng 23 Các chất đệm pH 23 Chất tiền thân .24 10 Chất kìm hãm 24 41 Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp 11 Chất cảm ứng 25 12 Yêu cầu oxy 26 IV THIẾT KẾ MÔI TRƯỜNG LÊN MEN 27 Yếu tố đa lượng 27 Yếu tố vi lượng 28 MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG 32 Môi trường sinh tổng hợp Amylase 32 Môi trường sản xuất glutamic acid .33 Môi trường sản xuất penicillin 34 Môi trường sản xuất endotoxin từ Baccillus thuringiensis 35 Môi trường lên men L-lysine từ rỉ đường 36 V ĐÁNH GIÁ MÔI TRƯỜNG 36 VI PHƯƠNG PHÁP ĐƯỜNG HÓA TẠO DUNG DỊCH GLUCOSE TỪ TINH BỘT 36 VII XỬ LÍ MẬT RỈ MÍA ĐƯỜNG TẠO DUNG DỊCH ĐƯỜNG PHỤC VỤ LÊN MEN 40 Khái niệm, thành phần .40 Phương pháp xử lí mật rỉ đường trước dùng cho quy trình lên men .40 2.1 Phương pháp thủy phân acid H2SO4 .40 2.2 Phương pháp thủy phân dùng enzyme 41 VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 42 ...Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Hiện nay, có nhiều loại môi trường sử dụng công nghiệp lên men, tùy vào điều kiện mục đích lên men mà người... phẩm biến dưỡng, Chương 4: Môi trường nuôi cấy lên men công nghiệp III CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Nước 1.1 Yêu cầu nước cho lên men  Nước dùng cho xí nghiệp lên men phải đáp ứng yêu cầu... tự phân IV THIẾT KẾ MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Thiết kế môi trường lên men có vai trò quan trọng, tảng cho trình lên men, định thành công nuôi cấy vi sinh.Thành phần môi trường nuôi cấy phải bảo đảm đủ