Bài giảng môi trường nuôi cấy trong IN VITRO

= MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG IN VITRO Giới thiệu   Nuôi cấy mô tế bào thực vật nuôi cấy vô trùng quan, mô, tế bào thực vật môi trường nuôi cấy xác định rõ Nghiên cứu thành phần để chuẩn bị môi trường thích hợp cho yêu cầu nuôi cấy khác định thành công công tác nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần môi trường(Ingredients) Các thành phần Các thành phần tự chọn -Nước -Chelates -Các nguyên tố khoáng -Chất thẩm thấu -Nguồn carbohydrate -Than -Vitamins -Amino acid -Chất tạo gel -Đạm hữu -Chất điều hòa sinh trưởng Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính *Nước: Sử dụng nước cất lần, nước cất lần nước khử khoáng *Nguồn carbohydrate,đường sucrose: Đường sucrose thường sử dụng 2-5% *Vitamins: Nicotinic acid, Pyridoxine(vit B6), Thiamine(vit B1), Myo inositol, Vit C chất chống oxy hóa *Chất tạo gel: Agar thường sử dụng Các nguyên tố khoáng Các nguyên tố đa lượng(mM) -Nitrogen(amonium nitrate) -Lân (P) -Potassium (K) -Magnesium (Mg) -Calcium (Ca) -Lưu huỳnh (S) -Sodium (Na) -Chloride (Cl) Các nguyên tố vi lượng(µM) -Iodine (I) -Bo (B) -Mangan (Mn) -Kẽm (Zn) -Molybdenum (Mo) -Đồng (Cu) -Cobalt (Co) -Aluminium (Al) -Nickel (Ni) -Sắt (Fe) Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính Các nguyên tố khoáng SPB2, Plant tissue culture, 2/27/2003 4:06 PM Page 37 Các chất điều hòa sinh trưởng PGR Auxin Cytokinin Gibberellins Hiệu nuôi cấy mô -Kích thích phân chia tế bào -Kích thích trình tạo rễ -Kích thích thành lập chồi quan - Kích thích sinh trưởng kéo dài mô phân sinh chồi - Tạo phôi vô tính(somatic embryogenesis) biến đổi Abscisic acid phôi thành Ethylene Ngăn cản sinh trưởng phát triển mô cấy Bình nuôi cấy dậy kín điều kiện để tích lũy ethylene Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính Tương tác auxin/cytokinin    Auxin thấp/cytokinin cao Auxin cao/cytokinin thấp Trung gian tạo chồi (2) tạo rễ (3) tạo callus (1) SPB2, Plant tissue culture, 2/27/2003 4:06 PM Page 37 Pradeep Kumar Naik and Sanghamitra Nayak, Different modes of plant regeneration and factors affecting in vitro bulblet production in Ornithogalum virens, ScienceAsia 31 (2005): 409-414 Pradeep Kumar Naik and Sanghamitra Nayak, Different modes of plant regeneration and factors affecting in vitro bulblet production in Ornithogalum virens, ScienceAsia 31 (2005): 409-414 Các thành phần tự chọn       Chelate: EDTA, EDDHA ( thành lập phức chất với cation kim loại, giúp giữ chúng dung dịch) Tác nhân thẩm thấu ( mannitol đường alcohol không biến dưỡng có hiệu tác nhân thẩm thấu) Than hoạt tính (làm tối môi trường, hấp thu kim loại…) pH ( điều chỉnh khoảng 5.5 – 6) Acid hữu cơ( acid citric, malic…) Thành phần bổ sung không xác định (dịch chiết nấm men, dịch trích cá, dịch trích trái cây…) Một vài loại môi trường nuôi cấy mô Murashige T and Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures Physiologia Plantarum 15 473-497 Macronutrients (mg/l) Murashige & Skoog Inorganic Salt Formulation Micronutrients (mg/l) Ammonium nitrate (NH4NO3) 1,650mg/l Calcium chloride (CaCl2*H2O) 440mg/l Colbalt chloride (CoCl2*6H2O) 0.025mg/l Magnesium sulfate (MgSO4*7H2O) 370mg/l Cupric Sulfate (CuSO4*5H2O) 0.025mg/l Potassium phosphate (KH2PO4) 170mg/l Ferrous sulfate (FeSO4*7H2O) 27.8mg/l Manganese sulfate (MnSO4*4H2O) 22.3mg/l Potassiom Iodine (KI) 0.83mg/l Sodium molybdate (Na2MoO4*2H2O) 0.25mg/l Zinc Sulfate (ZnSO4*7H2O)c 8.6mg/l Potassium nitrate (KNO3) 1,900mg/l Boric Acid (H3BO3) Na2EDTA*2H2Oa 6.2mg/l 37.2mg/lb Murashige & Skoog Common Organic Additives i-Inositol 100mg/l Nicotinic Acid 0.5mg/l Pyridoxine*HCl 0.5mg/l Thiamine *HCl 0.1mg/l IAA 1-30mg/l Kinetin 0.04-10mg/l Glycine (recrytallized) 2.0g/l Edamine 1.0g/l Sucrose 20g/l Agar 10g/l Components MurashigeSkoog (1962) White (1963 Gamborg (1968) Nitsch (1951) Heller (1953) Schenk Hildebrandt (1972) Nitsch Nitsch (1967) Kohlenbach Schmidt (1975) Knop (1865) - - 134 - - - - - - 370 720 500 250 250 400 125 185 250 Na2SO4 - 200 - - - - - - - KC1 - 65 - 1,500 750 - - - - 440 - 150 25 75 200 - 166 - NaNO3 - - - - 600 - - - - KNO3 1,900 80 3,000 2,000 - 2,500 125 950 250 - 300 - - - - 500 - 1,000 1,650 - - - - - - 720 - NaH2PO4× H2O - 16.5 150 250 125 - - - - NH4H2PO4 - - - - - 300 - - - KH2PO4 170 - - - _ - 125 68 250 FeSO4× 7H2) 27.8 - 27.8 - - 15 27.85 27.85 - Na2EDTA 37.3 - 37.3 - - 20 37.25 37.25 - MnSO4× 4H2O 22.3 10 (1 H2O) 0.1 10 25 25 - ZnSO4× 7H2O 8.6 0.5 0.1 10 10 - CuSO4× 5H2O 0.025 - 0.025 0.025 0.03 0.2 0.025 0.025 - H2SO4 - - - 0.5 - - - - - Fe2(SO4)3 - 2.5 - - - - - - - NiC12× 6H2O - - - - 0.03 - - - - CoC12× 6H2O 0.025 - 0.025 - - 0.1 0.025 - - (NH4)2SO4 MgSO4× 7H2O CaC12× 2H2O Ca(NO3)2× 4H2O NH4NO3 Components MurashigeSkoog (1962) White (1963 Gamborg (1968) Nitsch (1951) Heller (1953) Schenk Hildebrandt (1972) Nitsch Nitsch (1967) Kohlenbach Schmidt (1975) Knop (1865) A1C13 - - - - 0.03 - - - - FeC13× 6H2O - - - - - - - - FeC6O5H7× 5H2O - - - 10 - - - - - K1 0.83 0.75 0.75 0.5 0.01 1.0 - - - H3BO3 6.2 1.5 0.5 10 10 - Na2M0O4× 2H2O 0.25 - 0.25 0.25 - 0.1 0.25 0.25 - 30,000 - 20,00 - 20,000 - 50,000 or 36,000 20,000 - 30,000 - 20,000~30 ,000 - 10,000 - - Myo-Inositol 100 - 100 - - 1,000 100 100 - Nicotinic Acid 0.5 0.5 1.0 - - 0.5 5 - Pyridoxine HC1 0.5 0.1 1.0 - - 0.5 0.5 0.5 - Thiamine HC1 0.1-1 0.1 10 1 0.5 0.5 - CaPantothenate - - - - - - - - Biotin - - - - - - 0.05 0.05 - Glycine - - - - 2 - Cysteine HC1 - - 10 - - - - - Folic Acid - - - - - - 0.5 0.5 - Glutamine - - - - - - - 14.7 - Sucrose Glucose Originated by: Agriculture and Consumer Protection (FAO) Dr Masanaru Misawa Bio Inernational Inc.Toronto, Canada Title: PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE (chapter 4) Explant material, methods and results of published works on the in vitro culture of Antirrhinum majus Medium pH Sucro se (g/l) Agar (g/l) Plant Growth Regulators (mg/l) Results Author Leaf and stem segments Murashige & Skoog (1962) 5.8 30 (2,4-D) Callus formation Rao et al (1976) Stem internode Sangwan & Harada (1975) Callus formation Pfister & Widholm (1984) Seedling root Sangwan & Harada (1975) 5.5 20 0.25 (NOA) Callus formation Pfister & Widholm (1984) Shoot tips Murashige & Skoog (1962) 5.7 30 (BAP) Callus formation Atkinson et al (1989) Seedling root Sangwan & Harada (1975) 0.25 (NOA) Shoot regeneration via callus Pfister & Widholm (1984) 0.4 (2,4-D) Shoot regeneration via callus Pfister & Widholm (1984) 0.5-2 (2,4-D) Embryoids via callus PoirierHamon et al (1974) Liquid (2,4-D) + 0.5 (BAP) Embryoids via colonies PoirierHamon et al (1974) Explant Root callus Syono & Furuya (1972) Stem internode Poirier-Hamon et al (1974) Protoplasts Poirier-Hamon et al (1974) 5.5 5.5 5.8 5.5 - 20 20 30 20 20.5 6 Liquid 0.25 NOA Explant material, methods and results of published works on the in vitro culture of Antirrhinum majus Explant Internode stem segments Callus Medium pH Sucro se (g/l) Agar (g/l) Plant Growth Regulators (mg/l) Results Author Friable green callus embryogenesis Sangwan & Harada (1975) Nitsch et al (1967) 5.5 20 0.25-0.5 (NOA) or 0.5 (2,4-D) Murashige & Skoog (1962) 5.8 30 (2,4-D) + 0.5 (BAP) Indirect embryogenesis Rao et al (1976) Sangwan & Harada (1975) Internode stem segments Nitsch et al (1967) 5.5 20 (IAA) + (Kin) Roots & multiple shoots Shoot tips Murashige & Skoog (1962) 5.7 30 (BAP) Multiple shoots Atkinson et al (1989) Nodal segments Murashige & Skoog (1962) 0.5 (NAA) + (BAP) Multiple shoots GonzálezBenito et al (1996) Rooted plantlets Pfister & Widholm (1984) Rooted plantlets GonzálezBenito et al (1996) Shoots Bourgin & Nitsch (1967) Shoots Murashige & Skoog (1962) 5.8 5.5 5.8 30 10 30 8 None None Micropropagation of snapdragon,J.M Iriondo and E Torres Dpto Biología Vegetal E.U.I.T Agrícola,Universidad Politécnica de Madrid,E-28040 Madrid, Spain IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var lanceolata: TWO FLORIDA NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS By PHILIP KAUTH MASTER OF SCIENCE UNIVERSITY OF FLORIDA,2005 IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var lanceolata: TWO FLORIDA NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS By PHILIP KAUTH, MASTER OF SCIENCE, UNIVERSITY OF FLORIDA,2005 Sự phát triển Calopogon tuberosussau 12 tuần loại môi trường (IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var lanceolata: TWO FLORIDA NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS By PHILIP KAUTH, MASTER OF SCIENCE, UNIVERSITY OF FLORIDA,2005) Kết luận    Môi trường muôi cấy yếu tố quan trọng định thành công công tác nuôi cấy mô Có nhiều loại môi trường khác mà loại đáp ứng với mục đích nuôi cấy khác Chuẩn bị môi trường thích hợp với mục đích nuôi cấy đạt kết mong muốn Xin chân thành cám ơn ! [...]... KAUTH, MASTER OF SCIENCE, UNIVERSITY OF FLORIDA,2005) Kết luận    Môi trường muôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định thành công của công tác nuôi cấy mô Có nhiều loại môi trường khác nhau mà mỗi loại sẽ đáp ứng với những mục đích nuôi cấy khác nhau Chuẩn bị môi trường thích hợp với mục đích nuôi cấy thì mới đạt được kết quả mong muốn Xin chân thành cám ơn ! ... MASTER OF SCIENCE UNIVERSITY OF FLORIDA,2005 IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var lanceolata: TWO FLORIDA NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS By PHILIP KAUTH, MASTER OF SCIENCE, UNIVERSITY OF FLORIDA,2005 Sự phát triển của Calopogon tuberosussau 12 tuần trên 3 loại môi trường (IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus... 10,000 - - Myo-Inositol 100 - 100 - - 1,000 100 100 - Nicotinic Acid 0.5 0.5 1.0 - - 0.5 5 5 - Pyridoxine HC1 0.5 0.1 1.0 - - 0.5 0.5 0.5 - Thiamine HC1 0.1-1 0.1 10 1 1 5 0.5 0.5 - CaPantothenate - 1 - - - - - - - Biotin - - - - - - 0.05 0.05 - Glycine 2 3 - - - - 2 2 - Cysteine HC1 - 1 - 10 - - - - - Folic Acid - - - - - - 0.5 0.5 - Glutamine - - - - - - - 14.7 - Sucrose Glucose Originated by: Agriculture... giữ chúng trong dung dịch) Tác nhân thẩm thấu ( mannitol là một đường alcohol không biến dưỡng và chỉ có hiệu quả trong tác nhân thẩm thấu) Than hoạt tính (làm tối môi trường, hấp thu kim loại…) pH ( được điều chỉnh trong khoảng 5.5 – 6) Acid hữu cơ( acid citric, malic…) Thành phần bổ sung không xác định (dịch chiết nấm men, dịch trích cá, dịch trích trái cây…) Một vài loại môi trường nuôi cấy mô Murashige... Sodium molybdate (Na2MoO4*2H2O) 0.25mg/l Zinc Sulfate (ZnSO4*7H2O)c 8.6mg/l Potassium nitrate (KNO3) 1,900mg/l Boric Acid (H3BO3) Na2EDTA*2H2Oa 6.2mg/l 37.2mg/lb Murashige & Skoog Common Organic Additives i-Inositol 100mg/l Nicotinic Acid 0.5mg/l Pyridoxine*HCl 0.5mg/l Thiamine *HCl 0.1mg/l IAA 1-30mg/l Kinetin 0.04-10mg/l Glycine (recrytallized) 2.0g/l Edamine 1.0g/l Sucrose 20g/l Agar 10g/l Components... (1984) Rooted plantlets GonzálezBenito et al (1996) Shoots Bourgin & Nitsch (1967) Shoots Murashige & Skoog (1962) 5.8 5.5 5.8 30 10 30 8 8 None None Micropropagation of snapdragon,J.M Iriondo and E Torres Dpto Biología Vegetal E.U.I.T Agrícola,Universidad Politécnica de Madrid,E-28040 Madrid, Spain IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var... colonies PoirierHamon et al (1974) Explant Root callus Syono & Furuya (1972) Stem internode Poirier-Hamon et al (1974) Protoplasts Poirier-Hamon et al (1974) 5.5 5.5 5.8 5.5 - 20 20 30 20 20.5 6 6 Liquid 0.25 NOA Explant material, methods and results of published works on the in vitro culture of Antirrhinum majus Explant Internode stem segments Callus Medium pH Sucro se (g/l) Agar (g/l) Plant Growth... Sucrose Glucose Originated by: Agriculture and Consumer Protection (FAO) Dr Masanaru Misawa Bio Inernational Inc.Toronto, Canada Title: PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE (chapter 4) Explant material, methods and results of published works on the in vitro culture of Antirrhinum majus Medium pH Sucro se (g/l) Agar (g/l) Plant Growth Regulators (mg/l) Results Author... 0.25-0.5 (NOA) or 0.5 (2,4-D) Murashige & Skoog (1962) 5.8 30 8 1 (2,4-D) + 0.5 (BAP) Indirect embryogenesis Rao et al (1976) Sangwan & Harada (1975) Internode stem segments Nitsch et al (1967) 5.5 20 7 2 (IAA) + 4 (Kin) Roots & multiple shoots Shoot tips Murashige & Skoog (1962) 5.7 30 7 1 (BAP) Multiple shoots Atkinson et al (1989) Nodal segments Murashige & Skoog (1962) 8 0.5 (NAA) + 1 (BAP) Multiple... (1962) 5.8 30 8 1 (2,4-D) Callus formation Rao et al (1976) Stem internode Sangwan & Harada (1975) Callus formation Pfister & Widholm (1984) Seedling root Sangwan & Harada (1975) 5.5 20 6 0.25 (NOA) Callus formation Pfister & Widholm (1984) Shoot tips Murashige & Skoog (1962) 5.7 30 7 1 (BAP) Callus formation Atkinson et al (1989) Seedling root Sangwan & Harada (1975) 0.25 (NOA) Shoot regeneration via ... thiệu   Nuôi cấy mô tế bào thực vật nuôi cấy vô trùng quan, mô, tế bào thực vật môi trường nuôi cấy xác định rõ Nghiên cứu thành phần để chuẩn bị môi trường thích hợp cho yêu cầu nuôi cấy khác... cản sinh trưởng phát triển mô cấy Bình nuôi cấy dậy kín điều kiện để tích lũy ethylene Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính Tương tác auxin/cytokinin    Auxin thấp/cytokinin cao Auxin cao/cytokinin... Kết luận    Môi trường muôi cấy yếu tố quan trọng định thành công công tác nuôi cấy mô Có nhiều loại môi trường khác mà loại đáp ứng với mục đích nuôi cấy khác Chuẩn bị môi trường thích hợp