Bào chế và đánh giá tác dụng kháng khuẩn của thuốc mỡ thân nước bạc clorid

Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN XUÂN TÙNG BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA THUỐC MỠ THÂN NƯỚC NANO BẠC CLORID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2017 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN XUÂN TÙNG BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA THUỐC MỠ THÂN NƯỚC NANO BẠC CLORID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI - 2017 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Thị Thanh Bình - Chủ nhiệm Bộ môn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian vừa qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS.Nguyễn Thanh Hải – Phó chủ nhiệm phụ trách khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội định hướng cho nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy môn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc anh chị môn Bào chế Công nghiệp Dược, khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội bảo, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành thí nghiệm Hà Nội, ngày 30/5/2017 Tác giả Nguyễn Xuân Tùng Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AAS AgNO3 ATCC DĐVN MRSA NaCl PDI PEG SEM USP UV VK Atomic Absorption Spectrometric (Quang phổ hấp thụ nguyên tử) Bạc nitrat American type culture collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ) Dược điển Việt Nam Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu kháng Methicillin) Natri clorid Poly Dispersity Index (Chỉ số đa phân tán) Polyethylen glycol Scanning Electron Microscope (Kính hiển vi điện tử quét) Dược điển Mỹ Ultra violet (Tia tử ngoại) Vi khuẩn Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Tên bảng Cơ chế kháng khuẩn thuốc kháng khuẩn Kích thước số vật liệu micro nano Số nguyên tử có hạt nano bạc Nguyên liệu bào chế thuốc mỡ bạc clorid Độ hấp thụ nguyên tử dung dịch bạc chuẩn Kết định lượng mẫu thuốc mỡ AgCl 0,13% Lượng ion bạc giải phóng từ thuốc mỡ bạc clorid 0,13% so với Silvasorb® gel theo thời gian Bảng 3.4 Vòng vô khuẩn thuốc mỡ bạc clorid (TM), kem bạc sulfadiazin 1% (SS) mẫu trắng số vi khuẩn Gram dương Bảng 3.5 Vòng vô khuẩn thuốc mỡ bạc clorid (TM), kem bạc sulfadiazin 1% (SS) mẫu trắng số vi khuẩn Gram âm Bảng 3.6 Đường kính vòng vô khuẩn thuốc mỡ bạc clorid 0,13% S aureus E coli so với dạng gel bạc clorid 0,13% Silvasorb® Gel Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Trang 12 24 35 36 37 40 41 42 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Tác động ion bạc lên vi khuẩn Hình 1.2 Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy vi khuẩn 10 Hình 1.3 Ion bạc liên kết với base DNA 10 Hình 1.4 Ứng dụng bạc nano bạc y học 14 Hình 1.5 Ưu điểm bạc clorid so với dạng khác bạc 16 Hình 2.1 Quy trình bào chế thuốc mỡ bạc clorid 0,13% 26 Hình 3.1 Kích thước tiểu phân dược chất thuốc mỡ AgCl 0,13% Silvasorb® Gel Hình dạng tiểu phân bạc clorid quan sát kính hiển vi điện tử quét Đồ thị biểu diễn phụ thuộc cường độ hấp thụ nồng độ bạc Lượng ion bạc giải phóng từ thuốc mỡ bạc clorid 0,13% so với Silvasorb® Gel theo thời gian Kích thước tiểu phân sản phẩm trước sau chiếu UV Kích thước tiểu phân sản phẩm sau bào chế sau tháng Hoạt tính kháng khuẩn thuốc mỡ bạc clorid (TM) so với kem bạc sulfadiazin 1% (SS) mẫu trắng (MT) số vi khuẩn Gram dương Hoạt tính kháng khuẩn thuốc mỡ bạc clorid (TM) so với kem bạc sulfadiazin 1% (SS) mẫu trắng (MT) số vi khuẩn Gram âm Tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ bạc clorid 0,13% S aureus E coli so với gel bạc clorid 0,13% Silvasorb® Gel 34 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 35 36 37 38 39 40 41 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Thuốc kháng khuẩn vết thương bỏng 1.1.1 Giới thiệu chung thuốc kháng khuẩn 1.1.2 Các thuốc kháng khuẩn sử dụng điều trị nhiễm trùng vết thương bỏng 1.2 Công nghệ nano công nghệ nano sinh y dược 1.2.1 Công nghệ nano 1.2.2 Công nghệ nano sinh y dược 1.3 Bạc thuốc kháng khuẩn từ bạc 1.3.1 Cơ chế kháng khuẩn thuốc từ bạc 1.3.2 Các dạng bạc sử dụng làm thuốc kháng khuẩn 10 1.3.3 Hệ giải phóng ion bạc kéo dài – tiểu phân nano bạc clorid 15 1.4 Đại cương thuốc mỡ 16 1.4.1 Khái niệm thuốc mỡ 16 1.4.2 Phân loại thuốc mỡ 16 1.4.3 Các đặc tính thuốc mỡ 18 1.4.4 Các phương pháp bào chế thuốc mỡ 20 CHƯƠNG - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 24 2.1.1 Nguyên vật liệu 24 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 2.2.1 Bào chế thuốc mỡ bạc clorid 0,13% 26 2.2.2 Xác định số đặc tính thuốc mỡ bạc clorid 27 2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ bạc clorid 31 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Xác định số đặc tính thuốc mỡ bạc clorid 0,13% 34 3.1.1 Kích thước Zeta tiểu phân dược chất 34 3.1.2 Hình dạng tiểu phân 34 3.1.3 Độ nhớt 35 3.1.4 Hàm lượng hoạt chất 35 3.1.5 Khả giải phóng hoạt chất 36 3.1.6 Độ bền với ánh sáng 37 3.1.7 Độ ổn định theo thời gian 38 3.2 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ bạc clorid 39 3.2.1 So với kem bạc sulfadiazin 1% 39 3.4.2 So với Silvasorb® Gel gel bạc clorid 0,13% 41 3.3 Bàn luận 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xưa, người sử dụng bạc làm dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để trị bệnh Bạc biết đến nguyên tố có khả khử trùng mạnh tồn tự nhiên Đặc tính kháng khuẩn bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học ion Ag+ [14] Ion có khả tiêu diệt vi sinh vật theo nhiều chế [29], nên bị đề kháng [15] Trong lịch sử, bạc sử dụng làm thuốc nhiều dạng khác [13], loại có ưu nhược điểm riêng Điển hình dung dịch sát khuẩn bạc nitrat 0,5%, kem chữa bỏng bạc sulfadiazin 1% Về mặt bệnh lý, bỏng tổn thương da có nguồn gốc từ tác nhân học hóa chất, điện, nhiệt, ánh sáng mặt trời xạ hạt nhân Không giống loại chấn thương khác, vết thương bỏng gây biến đổi mặt chuyển hóa phản ứng viêm, đó, đặt bệnh nhân trước nhiều biến chứng nguy hiểm Trong điều trị bỏng, nhiễm trùng nguyên nhân phổ biến dẫn đến bệnh tật tử vong, biến chứng gây 61% tổng số trường hợp tử vong bỏng Nhiễm trùng vết thương bỏng đòi hỏi phải chăm sóc y tế làm chậm trình lành vết thương, gia tăng để lại sẹo, dẫn đến nhiễm trùng máu hội chứng bất hoạt đa quan [1] Ở bệnh nhân bỏng, tổn thương da diện rộng thời gian nhập viện dài nguyên nhân làm cho vết bỏng trở thành môi trường thích hợp cho phân chia nhanh chóng vi sinh vật gây bệnh Nhiễm trùng vết thương bỏng thường kéo dài có nguồn gốc từ nhiều loại vi sinh vật so với vết thương phẫu thuật Tác nhân gây nhiễm trùng vết bỏng vi khuẩn Gram dương tụ cầu vàng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), vi khuẩn Gram âm Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex, Pseudomonas aeruginosa loài Klebsiella Đáng ý Klebsiella gia tăng đề kháng với nhiều loại kháng sinh Nhiễm trùng vi khuẩn đề kháng kháng sinh bệnh nhân bỏng gắn liền với thời gian nhập viện kéo dài Điều trị nhiễm trùng đa đề kháng (MDR) liệu pháp kháng sinh ban đầu không đầy đủ làm gia tăng tỷ lệ tử vong Vết thương bỏng bị nhiễm nấm, đó, phổ biến Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 10 of 169 Candida albicans Sử dụng thuốc kháng khuẩn chỗ thích hợp mang lại hiệu việc điều trị nhiễm trùng kiểm soát vết thương [1] Sự đời thuốc kháng khuẩn hệ từ muối tan bạc với ưu điểm kiểm soát tốc độ giải phóng ion bạc mức tối ưu, thời gian dài góp phần giải vấn đề kể Theo định hướng nghiên cứu đó, khoa Y Dược – ĐHQGHN tổng hợp thành công xác định đặc tính tiểu phân nano bạc clorid Các thử nghiệm sinh học in vitro chứng tỏ tiểu phân có tác dụng vi khuẩn Gram âm Gram dương [1,7,8,32] Hướng đến việc bào chế thuốc kháng khuẩn từ bạc clorid có hiệu lực cao, phổ rộng nhằm điều trị nhanh hiệu nhiễm trùng, đặc biệt vết thương bỏng, tiến hành đề tài:“Bào chế đánh giá tác dụng kháng khuẩn thuốc mỡ thân nước bạc clorid” với mục tiêu cụ thể sau: Bào chế thuốc mỡ bạc clorid nồng độ 0,13% xác định số đặc tính thuốc Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ bào chế số chủng vi sinh vật Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 10 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 55 of 169 21 Hwang C.Y, Kim J.S, Kuk E et al (2007), “Antimicrobial effects of silver nanoparticles”, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 95–101 22 Jain N.K (2007), Pharmaceutical technology, Hari Singh Gour University, 1-19 23 Kim JS, Kuk E, Yu KN, Kim J-H, Park SJ, Lee HJ, et al (2007), “Antimicrobial effects of silver nanoparticles”, Nanomedicine Nanotechnol Biol Med 2007 Mar, 95-101 Lara HH, Ayala-Nuñez NV, Ixtepan-Turrent L, Rodriguez-Padilla C (2010), “Mode of antiviral action of silver nanoparticles against HIV1”, J Nanobiotechnology, 8(1) Mejeti N.V Ravi Kumar (2000), “Nano and microparticles as controlled drug delivery devices”, J.Pharm Sci, 3(2), 234-258 Morones-Ramirez, J Winkler, C S Spina & James J Collins (2013), “Silver enhances antibiotic activity against Gram-negative bacteria”, Science Translational Medicine, 5(190), 190 Ram B Gupta, Uday B Kompella (2006), “Nanoparticles Technology for Drug Delivery”, Taylor & Francis Group, London Rathod K.B et al (2011), “Glimpses of current advances of nanotechnology in therapeutics”, Int Pharm Pharm.Sci, 3(1), 8-12 Ratte H T (1999), “Bioaccumulation and toxicity of silver compounds”, A review Environ Toxicol Chem,18 (1), 89–108 Sun Q, Cai X, Li J, Zheng M, Chen Z, Yu C-P (2014), “Green synthesis of silver nanoparticles using tea leaf extract and evaluation of their stability and antibacterial activity”, Colloids Surf Physicochem Eng Asp, 444, 226–231 Sun RW-Y, Chen R, Chung NP-Y, Ho C-M, Lin C-LS, Che C-M (2005), “Silver nanoparticles fabricated in Hepes buffer exhibit cytoprotective activities toward HIV-1 infected cells”, Chem Commun Camb Engl, 40, 5059-5061 24 25 26 27 28 29 30 31 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 55 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 56 of 169 32 Trinh N D., Nguyen T T B., Nguyen T H (2015), “Preparation and characterization of silver chloride nanoparticles as an antibacterial agent”, Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol, 6, 45011-45016 33 Wright JB, Lam K, Hansen D, Burrell RE (1999), “Efficacy of topical silver against fungal burn wound pathogens”, Am J Infect Control,27(4),344-350 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 56 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 57 of 169 PHỤ LỤC GIẢI THƯỞNG KHOA HỌC VÀ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài Khóa luận tốt nghiệp đạt Giải Nhất tiểu ban Dược học, Giải Nhất chung khảo, Giải Ba Poster Hội nghị Khoa học Sinh viên năm 2017 Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Bài báo khoa học đăng Kỷ yếu Hội nghị Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 57 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 58 of 169 Phụ lục Báo cáo: “Bào chế đánh giá tác dụng kháng khuẩn thuốc mỡ thân nước bạc clorid” P08 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA THUỐC MỠ THÂN NƯỚC BẠC CLORID Nguyễn Xuân Tùng Khoa Y-Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Thanh Bình Tóm tắt: Thuốc kháng khuẩn bạc clorid 0,13% tá dược thuốc mỡ thân nước bào chế công nghệ nano in situ Hoạt chất sản phẩm tồn dạng dung dịch, bền với ánh sáng Khi tiếp xúc với vết thương, tiểu phân nano bạc clorid dạng lập phương, có kích thước trung bình 180 nm, Zeta -41 mV hình thành Sản phẩm có khả giải phóng ion bạc vòng ngày, hứa hẹn làm giảm số lần dùng thuốc thay băng cho bệnh nhân Các thử nghiệm sinh học cho thấy thuốc mỡ bạc clorid 0,13% có hoạt phổ rộng vi khuẩn Gram dương Gram âm; tác dụng kháng khuẩn tốt hẳn kem bạc sulfadiazin 1% tất chủng vi sinh vật thử nghiệm Từ khóa: Bạc clorid, PEG 600, PEG 4000, kháng khuẩn, thuốc mỡ thân nước, nano in situ Summary Preparation and evaluation of antibacteria activities of hydrophilic silver chloride ointment Abstract: 0.13% silver chloride antimicrobial drug on hydrophilic ointment excipients was prepared by in situ nanotechnology Active ingredients in the product existed in solution, stable to the light When exposed to the wounds, the cubic silver nanoparticles which had average size of 180 nm and Zeta potential of -41 mV were formed The product was capable of releasing silver ions within days, promising to reduce the number of medications and dressing changes for patients Biological tests have shown that 0.13% silver chloride ointment had a broad spectrum on both Gram-positive and Gram-negative bacteria; the antibacterial activities of product were better than those of 1% sulfadiazine cream on all nine tested microorganisms Keywords: Silver chloride, PEG 600, PEG 4000, antibacterial, hydrophilic ointment, in situ nanotechnology Đặt vấn đề Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 58 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 59 of 169 Từ xa xưa, người sử dụng bạc làm dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để trị bệnh Bạc biết đến nguyên tố có khả khử trùng mạnh tồn tự nhiên Đặc tính kháng khuẩn bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học ion Ag+ [1] Ion có khả tiêu diệt vi sinh vật theo nhiều chế [2], nên bị đề kháng [3] Trong lịch sử, bạc sử dụng làm thuốc nhiều dạng khác [4], loại có ưu nhược điểm riêng Điển hình dung dịch sát khuẩn bạc nitrat 0,5%, kem chữa bỏng bạc sulfadiazin 1% Về mặt bệnh lý, bỏng tổn thương da có nguồn gốc từ tác nhân học hóa chất, điện, nhiệt, ánh sáng mặt trời xạ hạt nhân Trong điều trị bỏng, nhiễm trùng nguyên nhân phổ biến dẫn đến bệnh tật tử vong, biến chứng gây 61% tổng số trường hợp tử vong bỏng Nhiễm trùng vết thương bỏng đòi hỏi phải chăm sóc y tế làm chậm trình lành vết thương, gia tăng để lại sẹo, dẫn đến nhiễm trùng máu hội chứng bất hoạt đa quan Các thuốc kháng khuẩn thông dụng điều trị bỏng nhìn chung có nhược điểm thời gian tác dụng ngắn, phải thay băng nhiều lần, việc thay băng khó khăn gây đau đớn cho bệnh nhân Sự đời thuốc kháng khuẩn hệ từ muối tan bạc với ưu điểm kiểm soát tốc độ giải phóng ion bạc mức tối ưu, thời gian dài góp phần giải vấn đề kể Tuy nhiên giới có Mỹ thành công việc bào chế thuốc dạng này, sản phẩm thương mại tiêu biểu Silvasorb® gel AcryMed sản xuất, Medline Industries phân phối Hầu hết nghiên cứu tập trung vào giai đoạn phát triển phương pháp tổng hợp tiểu phân nano muối bạc, công trình nghiên cứu mặt bào chế Trong nghiên cứu này, đặt mục tiêu bào chế thuốc mỡ thân nước bạc clorid 0,13% sử dụng điều trị nhiễm trùng vết thương, đặc biệt vết thương bỏng Một số đặc tính sản phẩm hình dạng, kích thước tiểu phân, Zeta, hàm lượng bạc toàn phần, khả giải phóng ion Ag+, độ ổn định tác dụng kháng khuẩn sản phẩm đánh giá Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Thuốc mỡ thân nước bạc clorid 0,13% bào chế từ nguyên liệu bạc nitrat natri clorid đạt tiêu chuẩn DĐVN IV; PEG 600 PEG 4000 đạt tiêu chuẩn USP 24; nước cất lần tinh chế máy GenPure UV-TOC, điện trở suất 18,2 MΩ.cm Các giống vi sinh vật kiểm định, môi trường thử nghiệm, mẫu kháng sinh chứng để đánh giá tác dụng kháng khuẩn thuốc mỡ nano bạc clorid môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 59 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 60 of 169 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Bào chế thuốc mỡ thân nước bạc clorid 0,13% Thuốc mỡ thân nước bạc clorid 0,13% bào chế theo quy trình sau: hòa tan hoàn toàn dung dịch chứa 30 mmol natri clorid vào 100g PEG 600 Nhỏ từ từ dung dịch chứa 1,47 mmol bạc nitrat vào dung dịch trên, tốc độ nhỏ 0,5 ml/phút, vừa nhỏ vừa khuấy trộn tốc độ 500 vòng/phút Sau đó, thêm 40g PEG 4000 vào đun nóng hỗn hợp đến 60±5oC, khuấy trộn nhẹ PEG 4000 tan chảy hoàn toàn, thu dung dịch suốt, đồng Cách ly hỗn hợp khỏi nguồn nhiệt, tiếp tục khuấy trộn đến hỗn hợp nguội nhiệt độ phòng thu thuốc mỡ bạc clorid 0,13% màu trắng đục, thể chất mềm, mịn 2.2.2 Xác định số đặc tính thuốc mỡ chứa tiểu phân nano bạc clorid 2.2.2.1 Kích thước Zeta tiểu phân dược chất Kích thước Zeta tiểu phân dược chất xác định cách pha loãng chế phẩm lượng nước cất thích hợp tiến hành đo máy HORIBA Nano Partica SZ-100, số khúc xạ môi trường phân tán 1,330, độ nhớt môi trường phân tán 0,8872, số khúc xạ tiểu phân 0,14 2.2.2.2 Hình dạng tiểu phân dược chất Cân chế phẩm pha loãng mẫu 10 thể tích nước cất Sau ly tâm máy Biocen 22R, tốc độ 16000 vòng/phút, 5°C 10 phút Rửa tủa lần nước cất Quan sát tủa thu kính hiển vi điện tử quét phân giải cao HITACHI S4800NIHE, điện gia tốc 10,0 kV 2.2.2.3 Hàm lượng dược chất Hàm lượng bạc toàn phần mẫu xác định cách đo phổ hấp thụ nguyên tử với máy Thermo iCE™ 3500, đèn cathod rỗng Ag, bước sóng 328,10 nm, cường độ đèn 9,0 mA, lửa không khí nén - acetylen, tốc độ dòng acetylen 2,2 l/phút, áp suất khí nén 160 Kpa Hàm lượng bạc clorid chế phẩm tính từ hàm lượng bạc toàn phần theo công thức: 143,32 HL  HL  Ag 107,87 AgCl 2.2.2.4 Độ ổn định Độ ổn định sản phẩm bào chế đánh giá cách theo dõi thay đổi kích thước tiểu phân dược chất theo thời gian Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 60 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 61 of 169 2.2.3 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất Khả giải phóng ion Ag+ từ thuốc mỡ bạc clorid 0,13% đánh giá phương pháp khuếch tán qua màng thẩm tích Sử dụng màng thẩm tích dạng ống Spectral/Por® MWCO 12000-14000 daltons, tiến hành sau: chuẩn bị cốc có mỏ đựng 500 ml nước cất (dung dịch nhận) Cân 0,5g thuốc mỡ cho vào màng thẩm tích Kẹp hai đầu túi Treo túi miệng cốc có mỏ cho đầu túi cao mực nước cốc; phần thân túi chứa thuốc mỡ ngập hoàn toàn nước Khuấy trộn tốc độ 500 vòng/phút, tránh ánh sáng suốt thời gian khảo sát Tại thời điểm xác định, lấy mẫu để định lượng bạc toàn phần đồng thời bổ sung vào dung dịch nhận lượng nước cất tương đương Lượng ion bạc Qn (mg) giải phóng thời điểm tn tính công thức: Trong đó: V (l): thể tích dung dịch nhận v (l): thể tích lấy mẫu Cn (mg/l): nồng độ dung dịch nhận thời điểm tn Ci (mg/l): nồng độ dung dịch nhận thời điểm lấy mẫu ti 2.2.4 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% 2.2.4.1 So với kem bạc sulfadiazin 1% Tác dụng kháng khuẩn in vitro sản phẩm bào chế so sánh với kem bạc sulfadiazin 1% (Satyam Pharmaceuticals & Chemicals PVT.LTD – Ấn Độ, số lô: T14066) phương pháp khuếch tán từ giấy lọc thạch chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus ATCC 9946 (B cereus), Bacillus pumilus ATCC 6633 (B pumillus), Bacillus subtilis ATCC 10241 (B subtilis), Sarcina lutea ATCC 9341 (S lutea), Staphylococcus aureus ATCC 6538 (S aureus) chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli ATCC 8739 (E coli), Salmonella typhimurium ATCC 13311 (S typ), Shigella flexneri DT 112 (S flexneri), Proteus mirabilis BV 108 (P mirabilis) Mẫu trắng (MT) thuốc mỡ không chứa hoạt chất với thành phần tương tự mẫu thử Kháng sinh chứng chuẩn sử dụng benzathin penicillin (BZP, 20 IU/ml) vi khuẩn Gram dương streptomycin (STM, 20 IU/ml) vi khuẩn Gram âm Các khoanh giấy lọc tẩm hai mặt với chế phẩm cho mặt khoanh giấy dính thuốc VSV kiểm định cấy vào môi trường canh thang, nuôi cấy cho phát triển tủ ấm 37oC thời gian 18-24 đến nồng độ 107 tế bào/ml Môi trường thạch thường vô trùng cấy giống VSV kiểm định với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml, đổ vào đĩa Petri vô trùng Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 61 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 62 of 169 với thể tích 20ml/đĩa thạch đông lại Các khoanh giấy lọc (6,0-6,5 mm) vô trùng sấy khô tẩm lần với mẫu, sau lần tẩm sấy < 60oC đến khô hết dung môi, đặt lên bề mặt môi trường thạch chứa vi khuẩn kiểm định theo sơ đồ định sẵn, số thí nghiệm song song Ủ đĩa Petri có mẫu tủ ấm 37oC 18-24 lấy đọc kết Đo đường kính vòng vô khuẩn, có, thước kẹp Panmer độ xác 0,02 mm Kết đánh giá dựa đường kính vòng vô khuẩn độ lệch thực nghiệm 2.2.4.2 So với Silvasorb® gel gel bạc clorid 0,13% Tác dụng kháng khuẩn in vitro sản phẩm bào chế so sánh với Silvasorb® Gel (thuốc điều trị nhiễm trùng da chứa 0,13% bạc clorid, AcryMed, số lô: 16024102) gel nano bạc clorid 0,13% (do học viên cao học Đại học Dược Hà Nội bào chế) phương pháp khuếch tán từ giếng, đo vòng vô khuẩn đĩa thạch Thử nghiệm với chủng vi sinh vật Gram âm E coli ATCC 25922 chủng vi sinh vật Gram dương S aureus ATCC 1128 Giếng có đường kính 6,5 mm, sâu mm, thể tích mẫu 0,09 – 0,11 ml Cách tiến hành, đọc đánh giá kết tương tự mô tả mục 2.2.4.1 Kết 3.1 Một số đặc tính thuốc mỡ chứa tiểu phân nano bạc clorid 0,13% 3.1.1 Kích thước tiểu phân Zeta tiểu phân dược chất Các tiểu phân dược chất thuốc mỡ AgCl 0,13% có đường kính trung bình khoảng 180 nm, phân bố kích thước tương giá trị PDI khoảng 0.2 Các tiểu phân nano AgCl sản phẩm Zeta khoảng -41 mV Giá trị tuyệt đối Zeta tương đối lớn, kết hợp với số PDI nhỏ dự báo độ ổn định cao sản phẩm Trong đó, tiểu phân hoạt chất Silvasorb® gel có kích thước lớn với đường kính trung bình khoảng 870 nm, giá trị PDI khoảng 0.37 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 62 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 63 of 169 Hình 1: Kích thước tiểu phân dược chất thuốc mỡ AgCl 0,13% (a) Silvasorb® gel (b) 3.1.2 Hình dạng tiểu phân Ảnh chụp SEM hỗn dịch cho thấy tiểu phân có hình dạng chủ yếu hình lập phương Các tiểu phân không sắc cạnh chúng bao bọc PEG Hình 2: Hình dạng tiểu phân bạc clorid quan sát kính hiển vi điện tử quét 3.1.3 Hàm lượng dược chất Hàm lượng dược chất thuốc mỡ xác định phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử 1320,4 ppm; 101,57% hàm lượng lý thuyết Kết thu chứng tỏ xác quy trình bào chế Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 63 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 64 of 169 3.1.4 Độ ổn định Kết theo dõi độ ổn định thuốc mỡ bạc clorid 0,13% cho thấy sau tháng, kích thước tiểu phân dược chất gần không thay đổi, đường kính trung bình mẫu trì khoảng 162-180 nm, số PDI khoảng 0,2 3.2 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất Khả giải phóng ion Ag+ từ thuốc mỡ chứa tiểu phân nano bạc clorid 0,13% so với Silvasorb® gel trình bày hình bảng Hình 3: Lượng ion bạc giải phóng từ thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% so với Silvasorb® gel theo thời gian (giờ) Bảng 1: Lượng ion bạc giải phóng từ thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% so với Silvasorb® gel theo thời gian Thời gian Thuốc mỡ AgCl 0,13% Silvasorb® gel t (giờ) Q (mg) Q (mg) 0,000 0,00 0,060 0,079 24 0,097 0,152 48 0,156 0,210 72 0,198 0,254 168 0,221 0,287 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 64 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 65 of 169 Như thuốc mỡ chứa tiểu phân nano bạc clorid bào chế có khả giải phóng ion Ag+ ngày, lên đến ngày Tổng lượng ion Ag+ giải phóng 0,221 mg So với Silvasorb® Gel, khả giải phóng hoạt chất sản phẩm bào chế thấp Sự khác ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% 3.3.1 So với kem bạc sulfadiazin 1% Tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% so với kem bạc sulfadiazin 1% chủng vi sinh vật Gram (+) chủng vi sinh vật Gram (-) thể hình bảng 2, Kết thu cho thấy thuốc mỡ bạc clorid có tác dụng tốt hẳn kem bạc sulfadiazin 1% tất nồng độ khảo sát (0,07%; 0,1% 0,13%) tất chủng vi sinh vật thử nghiệm Hình 4: Hoạt tính kháng khuẩn thuốc mỡ bạc clorid (TM) so với kem bạc sulfadiazin 1% (SS) số chủng vi khuẩn Gram (+): (a) S aureus, (b) B subtilis, (c) B cereus, (d) B pumilus, (e) S lutea Gram (-): (f) E coli, (g) P mirabilis, (h) S flexneri, (i) S typhimurium Bảng 2: Vòng vô khuẩn thuốc mỡ bạc clorid, bạc sulfadiazin mẫu trắng số vi khuẩn Gram dương S aureus STT B cereus B pumilus S lutea Ký hiệu (mm) B subtilis TM 0,07% 10,13 S 0,15 (mm) 12,30 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 65 of 169 S 0,87 (mm) 10,67 S 1,00 (mm) 10,03 S 1,00 (mm) 11,65 S 1,01 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 66 of 169 TM 0,1% 10,44 0,10 10,89 0,35 10,37 0,50 10,20 0,60 12,00 0,62 TM 0,13% 10, 80 0,35 10,81 0,60 10,96 0,44 10,11 0,89 12,47 0,40 MT 0 8,33 0,12 0 0 SS 9,48 0,38 9,25 0,06 8,87 0,42 9,51 0,94 10,31 0,10 KSC-P 25,64 0,92 15,91 0,71 17,50 0,98 0 0 Bảng 3: Vòng vô khuẩn thuốc mỡ bạc clorid, bạc sulfadiazin mẫu trắng số vi khuẩn Gram âm E coli STT P mirabilis S flexneri (mm) (mm) S typhimurium Ký hiệu (mm) S s S (mm) S TM 0,07% 10,17 0,15 11,19 0,34 10,58 0,33 10,13 0,55 TM 0,1% 9,76 0,36 11,57 0,95 10,79 0,53 9,00 0,95 TM 0,13% 9,70 0,36 11,08 0,39 10,52 0,34 9,11 0,55 MT 0 0 0 0 SS 8,01 0,01 9,05 0,20 8,91 0,25 8,07 0,63 KSC-S 9,03 0,39 16,01 0,67 14,58 0,62 13,87 1,00 3.3.2 So với Silvasorb® gel gel nano bạc clorid 0,13% Tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ AgCl 0,13% so với gel AgCl 0,13% Silvasorb® gel vi khuẩn Gram âm E coli vi khuẩn Gram dương S aureus trình bày hình bảng Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 66 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 67 of 169 Hình 5: Tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ (TM) AgCl 0,13% S aureus (bên trái) E coli (bên phải) so với Silvasorb® Gel gel AgCl 0,13% Bảng 4: Đường kính vòng vô khuẩn thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% S aureus E coli so với Silvasorb® Gel gel nano bạc clorid 0,13% S aureus STT Mẫu (mm) E coli S (mm) S Gel AgCl 10,69 0,24 11,15 0,27 Mẫu trắng gel 0,00 0,00 0,00 0,00 TM AgCl 10,37 0,14 11,41 0,16 Mẫu trắng TM 0,00 0,00 0,00 0,00 Silvasorb® Gel 33,50 0,53 10,52 0,11 Từ kết thu được, thấy thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% bào chế có phổ kháng khuẩn rộng, vi khuẩn Gram (+) Gram (-) Sản phẩm có tác dụng S aureus yếu so với Silvasorb® Gel tác dụng E coli lại mạnh đáng kể Tác dụng kháng khuẩn bạc clorid dạng thuốc mỡ gel gần tương đương hai chủng vi sinh vật khảo sát Các mẫu trắng hoạt tính Bàn luận Từ nghiên cứu, thuốc mỡ thân nước nano bạc clorid 0,13% với phổ kháng khuẩn rộng, hiệu lực cao, tác dụng kéo dài bào chế công nghệ nano in situ Đây sản phẩm nước phát triển từ muối tan bạc Nghiên cứu góp phần nâng cao lực sản xuất thuốc công nghệ nước, nhờ làm hạ giá thành sản phẩm, giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân Sản phẩm bào chế hứa hẹn khả giảm số lần dùng thuốc, thay băng cho bệnh nhân, giúp giảm công việc cho cán y tế Về lâu dài, độc tính sản phẩm lâm sàng, tác dụng in vivo vết thương, vết bỏng cần khảo sát, đánh giá Bên cạnh đó, độ ổn định sản phẩm thời gian dài cần theo dõi Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 67 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 68 of 169 Kết luận Như vậy, thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% bào chế thành công nhờ công nghệ nano in situ Các tiểu phân nano AgCl thuốc mỡ chủ yếu có dạng lập phương, đường kính trung bình khoảng 180 nm, phân bố kích thước tương đối đồng Các đặc tính khác tiểu phân Zeta, hàm lượng dược chất, độ ổn định xác định Sản phẩm bào chế có khả giải phóng ion Ag+ vòng ngày Thuốc mỡ thân nước AgCl cho tác dụng tốt hẳn kem bạc sulfadiazin 1% tất chủng vi khuẩn Gram (+) Gram (-) thử nghiệm So với Silvasorb® Gel, thuốc mỡ bạc clorid 0,13% có tác dụng S aureus yếu tác dụng E coli lại mạnh đáng kể Lời cảm ơn Em xin gửi lời cảm ơn tới TS.Nguyễn Thị Thanh Bình - Phó chủ nhiệm Bộ môn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian vừa qua Tài liệu tham khảo [1] Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications Trends Biotechnol 2010; 28 (11): 580–8 [2] Ratte H T Bioaccumulation and toxicity of silver compounds: A review Environ Toxicol Chem 1999; 18 (1): 89–108 [3] Choi O, Deng K K, Kim N J, Ross L, Surampalli R Y, Hu Z The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth Water Res 2008; 42 (12): 3066–3074 [4] Atiyeh B S, Costagliola M, Hayek S N, Dibo S A Effect of silver on burn wound infection control and healing: review of the literature Burns J Int Soc Burn Inj 2007; 33 (2): 139–148 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 68 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 69 of 169 Phụ lục Poster: “Bào chế đánh giá tác dụng kháng khuẩn thuốc mỡ thân nước bạc clorid” Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 69 of 169 ... tài: Bào chế đánh giá tác dụng kháng khuẩn thuốc mỡ thân nước bạc clorid với mục tiêu cụ thể sau: Bào chế thuốc mỡ bạc clorid nồng độ 0,13% xác định số đặc tính thuốc Đánh giá tác dụng kháng khuẩn. .. 2.2.1 Bào chế thuốc mỡ bạc clorid 0,13% 26 2.2.2 Xác định số đặc tính thuốc mỡ bạc clorid 27 2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro thuốc mỡ bạc clorid 31 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO... thớt Cơ chế tác dụng tác nhân hóa học sử dụng thuốc kháng khuẩn trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Cơ chế kháng khuẩn thuốc kháng khuẩn [20] Đích tác dụng Thuốc kháng khuẩn Cơ chế hoạt động Vỏ tế bào (vách