DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3 Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỉ lệ pha động khảo sát 21 Bảng 4 Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi thêm 7,5% AcOH trong pha động 22 B
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC ĐẶNG NGỌC ANH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN
TRONG DƯỢC PHẨM
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2017
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC ĐẶNG NGỌC ANH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ
Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa
Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này
Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm
thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có
thể thực hiện khóa luận này
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo
trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học
tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện
khóa luận này
Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2017
Sinh viên
Đặng Ngọc Anh
Trang 4CHỮ VIẾT TẮT
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid
chromatography)
MS Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ)
DAD Máy đo quang (Diode Array Detector)
ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược
phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use)
BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)
EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)
USP Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)
EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)
LD 50 Liều gây chết trung bình (Lethal dose, 50%)
GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
ACN Acetonitril
ATC Phân loại thuốc theo hệ thống Giải phẫu – Điều trị – Hoá học
(Anatomical – Therapeutic – Chemical Code)
NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm không steroid
Trang 5MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……… 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3
1.1 Giới thiệu chung về flurbiprofen 3
1.1.1 Cấu trúc, tính chất 3
1.1.2 Tác dụng dược lý 4
1.2 Các phương pháp định lượng flurbiprofen 4
1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ 4
1.2.2 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử 5
1.2.3 Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 6
1.2.4 Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí 11
1.3 Thẩm định quy trình phân tích 11
1.3.1 Tính đặc hiệu 11
1.3.2 Miền giá trị 12
1.3.3 Tính tuyến tính 12
1.3.4 Giới hạn phát hiện 13
1.3.5 Giới hạn định lượng 14
1.3.6 Độ đúng 15
1.3.7 Độ chính xác 15
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 17
2.1.1 Dung môi, hoá chất 17
2.1.2 Trang thiết bị 17
Trang 62.2 Phương pháp nghiên cứu 18
2.2.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 18
2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích 18
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 20
3.2 Tính đặc hiệu 23
3.2.1 Khả năng phân tách 23
3.2.2 Thời gian lưu 25
3.3 Tính tuyến tính và miền giá trị 27
3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 29
3.5 Độ đúng 29
3.6 Độ chính xác 30
3.6.1 Độ lặp lại 30
3.6.2 Độ chính xác trung gian 30
3.7 Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén 32
3.8 Bàn luận 32
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN 35
4.1 Kết luận 35
4.2 Kiến nghị……….35 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3 Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỉ
lệ pha động khảo sát
21
Bảng 4 Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi
thêm 7,5% AcOH trong pha động
22
Bảng 5 Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu
phân tích và mẫu chuẩn
26
Bảng 6 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan
giữa nồng độ lý thuyết và diện tích pic của flurbiprofen
27
Bảng 7 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương
pháp
29
Bảng 8 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 30
Bảng 9 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3 Khảo sát độ hấp thụ quang theo bước sóng 20
Hình 4 Hiện tượng kéo đuôi pic trên sắc ký đồ 21
Hình 5 Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá 23
Hình 6 Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydroperoxid 24
Hình 7 Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời
gian xuất hiện các pic
25
Hình 8 Đổ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ
chất phân tích và diện tích pic
28
Trang 9MỞ ĐẦU
Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid (NSAID) với tác dụng giảm đau, hạ sốt Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ Flurbiprofen được sử dụng bằng đường uống để điều trị tấn công trong các bệnh viêm gan cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt lưng Viên nén và gel dùng ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp [7,11,17,26,29]
Flurbiprofen hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ dưới nhiều tên thương mại khác nhau như Antadys, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên các thuốc này lại chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng không có chuyên luận về Flurbiprofen
Phát triển các nghiên cứu về Flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm một lựa chọn thuốc trong điều trị Một điểm đáng chú ý là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ thuốc dẫn nano có cấu trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là hướng nghiên cứu được quan tâm trên thế giới [4,12,16,24]
Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen theo tiêu chuẩn quốc tế
là cơ sở ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm đau, chống viêm chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu tương đương sinh học và dược động học của chúng
Trên thế giới, một số phương pháp định lượng flurbiprofen và các chất chuyển hóa trong huyết tương, huyết thanh, nước tiểu và trong dịch nước mắt Một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được công bố bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép đầu dò UV (DAD), đầu dò huỳnh quang hoặc đầu dò khối phổ (MS) USP 35 và EP 2010 quy định sử dụng phương pháp HPLC để phân tích flurbiprofen trong nguyên liệu dùng làm thuốc và trong các dạng thuốc như viên nén, thuốc nhỏ mắt và cao dán [20,22]
Trang 10Mục tiêu của đề tài này nhằm tiến hành xây dựng và thẩm định quy trình định lượng flurbiprofen trong dược phẩm bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD theo hướng dẫn của Cơ quan quản
lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency- EMA) [9] và Hội nghị quốc
tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) [21]
Trang 112-(3-flouro-4-Hình 1 Công thức cấu tạo flurbiprofen
Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học (+) S và (-) R Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [6]
Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như trắng và nóng chảy ở 110 – 111oC Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22oC
là 8 mg/L (22o
C) ,các chỉ số LogP và logS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [27,29]
Trang 121.1.2 Tác dụng dược lý
Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và cảm nhận đau Enzym cyclooxygenase (COX) có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2) và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic Flurbiprofen có tác dụng chất ức chế cyclooxygenase (COX) không chọn lọc và ức chế sự hoạt động của cả hai COX-1 và COX-2 Từ đó, flurbiprofen ngăn cản việc chuyển hoá axit arachidonic thành PGG2, PGH2 là nguyên liệu trong quá trình tổng hợp các prostaglandin Từ đó, làm giảm nồng
độ prostaglandin và cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt Flurbiprofen cũng là một trong những NSAIDs mạnh nhất về hoạt động ức chế prostaglandin
Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp của hai đồng phân quang học (+) S và (-) R Đồng phân S-enantiomer thể hiện hầu hết trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt tính giảm đau
Flurbiprofen được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài đối với bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ [7,11,16,26,29]
1.2 Các phương pháp định lượng flurbiprofen
1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ
Theo dược điển châu Âu (EP) 2010 [20] và dược điển Hoa Kỳ (USP)
35 [22], phương pháp định lượng dựa vào phản ứng acid - base của gốc acid trong cấu trúc flurbiprofen Phương pháp được thực hiện bằng cách hòa tan 0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1
M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein, dừng lại khi dung dịch có màu hồng bền hơn 30 giây [22] Có thể thay thế chỉ thị phenolphthalein bằng phương pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện thế [20] 1 ml dung dịch NaOH 0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2
Trang 13Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và người phân tích
1.2.2 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử
Trong nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã giới thiệu hai phương pháp định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử Phương pháp được hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH
và EMA [5]
Quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang đã được thẩm định Trong đó, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV-Vis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet
1 cm, tốc độ quét 600 nm/phút, dải quét 190 - 320 nm, độ rộng khe 2 nm Tín hiệu được xử lý trên phần mềm Statistical Product and Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 1-14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml
Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng máy đo huỳnh quang Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU RF-5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm,
λex= 248 nm, λem= 308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product and Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ có giá trị là 0,03 μg/ml
Các phương pháp này có ưu điểm thời gian thực hiện ngắn, độ chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các nồng độ rất nhỏ Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi các tạp chất lạ và phải kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu
Trang 141.2.3 Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,5,13,18]
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
- Thời gian lưu
tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào
hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký
tR ’
(Thời gian lưu thực): tR ’
= tR – t0W: là chiều rộng đáy pic
W1/2: là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic
Hình 2 Minh hoạ các thông số sắc ký
- Hệ số dung lượng k
Trang 15Trong đó:
Vs : thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha động
Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu:
Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0
- Hệ số bất đối xứng As
Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ Trong đó:
W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2
Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối
- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
Trang 16
Trong đó
W: Chiều rộng đo ở đáy pic,
W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)
WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic
W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn
vị Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5
Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng
Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [3,5,13,18]
- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong
đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử
- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những
lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội.Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của
các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của mẫu
Trang 17thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng của diện tích hoặc chiều cao pic
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất
trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ
Định lượng bằng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD
Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ thống HPLC - DAD [20] Trong đó, dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp acetonitril : nước 45:55 Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung môi trên để được 100 ml Pha tĩnh là octadecylsilyl silicagel kích thước 5 µm trong cột thép kích thước 3,9 × 150 mm Pha động là hỗn hợp axit axetic : acetonitrile : nước tỷ lệ 5 : 35 : 60 Tốc độ dòng 1 ml/phút Thể tích tiêm là
10 µl Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu
dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm
Phương pháp có những ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy tốt tách được các thành phần riêng biệt ra khỏi mẫu và có thể áp dụng được cho những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc hiện đại
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ
Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen
và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC - MS/MS) [8,14,15,18]
Ví dụ như nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng Zheng, Hui Chen thực hiện (2015) [8] Trong đó hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu UFLC LC-30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối phổ QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ) Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ
Trang 18thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm Điều kiện chạy nguồn hoá ESI liệt kê trong bảng 1
Bảng 1 Điều kiện chạy nguồn hoá ESI
Thế phun điện tử -4,5 kV Nhiệt độ mao quản 400 oC
Detector với các thông số năng lượng va chạm (CE) = - 12 V, thế phân nhóm (DP) = - 26 V, Thế đầu vào (EP) = - 8 V, Năng lượng (CXP) = - 8 V Ion có dạng 242,9 → 198,7
Pha tĩnh: cột silicagel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex
Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 2
Bảng 2 Chương trình pha động gradient
Thời gian (phút) Tốc độ dòng
(ml/phút)
Kênh A (Acid formic : Nước 99,9 : 0,1)
Kênh B (Acetonitril : Acid formic 99,9 : 0,1)
Nhiệt độ cột 40oC và thể tích tiêm mẫu là 5 µl
Phương pháp đã xác định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml
Độ chính xác đạt 2,2 - 3,4%
Phương pháp có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, độ đặc hiệu cao do tính phân mảnh riêng biệt của các ion, thời phân tích nhanh, có thể định lượng các chất có thời gian lưu giống nhau và độ phân giải cao Nhược điểm của
Trang 19phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi, phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền
1.2.4 Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí
Trong nghiêm cứu của Yilmaz, Bilal, and Emrah Alkan (2015), các tác giả đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ [25] Trong đó, phân tích sắc ký thực hiện trên hệ thống sắc ký khí Agilent 6890 N được trang bị đầu dò MS 5973, hệ thống tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm điều khiển Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) Cột HP-5 MS có độ dày 0,25 μm (30
m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách Tiêm mẫu không chia dòng, khí mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút Nhiệt độ đầu phun và máy dò là 250°C Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV Miền giá trị được xây dựng trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt 99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml
Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất,
độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao tính phân mảnh riêng biệt của các ion Phương pháp có nhược điểm là giá thành cao, không áp dụng được cho những chất không bền nhiệt và chất dễ khó hơi
1.3 Thẩm định quy trình phân tích
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [21], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định
1.3.1 Tính đặc hiệu
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
Trang 20- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có
ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn
- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,9,21]
Phương pháp xác định
Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên
Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo
ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm
Phương pháp xác định
- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định
- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không
Trang 21của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x)
Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với
hệ số tương quan tuyến tính R2
[1,2,9,21]
Phương pháp xác định
- Khảo sát ở ít nhất 5 [21] hoặc 6 [9] mức nồng độ khác nhau
- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp
- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu
- Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOD là nồng
độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3
Trang 22- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp nhận
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc
Trang 23dựa vào đường cong chuẩn độ
1.3.6 Độ đúng
Khái niệm
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định
[1,2,8,20]
Phương pháp xác định
Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau)
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:
ỷ ệ ụ ồ Trong đó: là giá trị mẫu đo được
µ là giá trị mẫu theo lý thuyết
Yêu cầu
Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2] Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao
1.3.7 Độ chính xác
Khái niệm
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,9,21]