Cây trồng chuyển gen là sự biến đổi vật chất di truyền, tiếp nhận thêm những gen mới, kết quả là xuất hiện những tính trạng mới dưới sự tác động của môi trường. Quá trình biến đổi vật chất di truyền (thêm gen mới) nhờ vào công nghệ chuyển gen, nếu so sánh quá trình này với quá trình đột biến trong tự nhiên về bản chất thì hai quá trình là một, bởi vì quá trình tiến hóa của sinh vật đều phải trông chờ vào quá trình biến đổi vật chất di truyền, trong đó đột biến đóng vai trò quan trọng. Dưới tác động của các nhân tố gây đột biến, vật chất di truyền được biến đổi theo hai hướng: thêm đoạn hay bớt đoạn. Như vậy, quá trình thêm đoạn nhờ chuyển gen cũng tương tự như quá trình thêm đoạn ADN trong đột biến tự nhiên. Tuy nhiên, hai quá trình này có nhiều điểm khác nhau: Nếu quá trình chọn lọc tự nhiên chỉ giữ lại những biến dị có lợi cho quá trình tiến hóa của loài, thì trong kỹ thuật chuyển gen cây trồng chỉ giữ lại tính trạng đã được định hướng trước, có lợi về kinh tế, không đóng góp gì cho quá trình tiến hóa của loài. Đây là điểm khác biệt căn bản nhất giữa đột biến tự nhiên và đột biến nhờ kỹ thuật chuyển gen. Sản phẩm của đột biến tự nhiên là tính trạng có lợi cho tiến hóa, còn sản phẩm của quá trình chuyển gen là các tính trạng có lợi cho con người, đây là ưu điểm nổi bật nhất của công nghệ chuyển gen. Quá trình hình thành tính trạng mới trong tự nhiên phải diễn ra hàng trăm năm, triệu năm, thậm chí hàng tỷ năm, còn quá trình hình thành tính trạng mới nhờ công nghệ chuyển gen chỉ diễn ra trong vài năm, nhờ tính ưu việt này mà chúng ta có thể rút ngắn được quá trình chọn tạo giống cây trồng mới, bổ sung các tính trạng ưu việt mới, đáp ứng tốt nhất mục tiêu chọn giống và phục vụ sản xuất
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN RAU QUẢ TÌM HIỂU VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN VÍ DỤ CƠ CHẾ CHUYỂN GEN, ƯU NHƯỢC ĐIỂM GVHD: Đỗ Mai Nguyên Phương Nhóm: Thứ , Tiết - Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN RAU QUẢ GVHD: Đỗ Mai Nguyên Phương Nhóm: Thứ , Tiết - Danh sách thành viên: Nguyễn Phạm Cẩm Tiên Nguyễn Thị Minh Chi Huỳnh Ngọc Trọng Bùi Thị Thu Sen Nguyễn Tấn Lực 2005140609 2005140039 2005140677 2005140474 2022140294 Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 M ỤC L ỤC I Tổng quan lịch sử phát triển Tổng quan Cây trồng chuyển gen biến đổi vật chất di truyền, tiếp nhận thêm gen mới, kết xuất tính trạng tác động môi trường Quá trình biến đổi vật chất di truyền (thêm gen mới) nhờ vào công nghệ chuyển gen, so sánh trình với trình đột biến tự nhiên chất hai trình một, trình tiến hóa sinh vật phải trông chờ vào trình biến đổi vật chất di truyền, đột biến đóng vai trò quan trọng Dưới tác động nhân tố gây đột biến, vật chất di truyền biến đổi theo hai hướng: thêm đoạn hay bớt đoạn Như vậy, trình thêm đoạn nhờ chuyển gen tương tự trình thêm đoạn ADN đột biến tự nhiên Tuy nhiên, hai trình có nhiều điểm khác nhau: Nếu trình chọn lọc tự nhiên giữ lại biến dị có lợi cho trình tiến hóa loài, kỹ thuật chuyển gen trồng giữ lại tính trạng định hướng trước, có lợi kinh tế, không đóng góp cho trình tiến hóa loài Đây điểm khác biệt đột biến tự nhiên "đột biến" nhờ kỹ thuật chuyển gen Sản phẩm đột biến tự nhiên tính trạng có lợi cho tiến hóa, sản phẩm trình chuyển gen tính trạng có lợi cho người, ưu điểm bật công nghệ chuyển gen Quá trình hình thành tính trạng tự nhiên phải diễn hàng trăm năm, triệu năm, chí hàng tỷ năm, trình hình thành tính trạng nhờ công nghệ chuyển gen diễn vài năm, nhờ tính ưu việt mà rút ngắn trình chọn tạo giống trồng mới, bổ sung tính trạng ưu việt mới, đáp ứng tốt mục tiêu chọn giống phục vụ sản xuất Lịch sử Cây trồng chuyển đổi gen tạo lần vào năm 1982, việc sử dụng loại thuốc chống kháng sinh Những khu vực trồng thử nghiệm thuốc có khả chống thuốc diệt cỏ Pháp Hoa Kỳ vào năm 1986 Năm 1987, Plant Genetic Systems (Ghent, Bỉ), thành lập Marc Van Montagu and Jeff Schell, công ty phát triển trồng thiết kế gen di truyền (thuốc lá) có khả chống chịu côn trùng cách biểu gen mã hóa protein diệt côn trùng từ vi khuẩn Bacillusthuringiensis (Bt).Trung Quốc quốc gia chấp thuận công nghiệp chuyển đổi gen với thuốc kháng vi rút giới thiệu lần đầu vào năm 1992, rút khỏi thị trường Trung Quốc vào năm 1997 Cây trồng biến đổi gen phê chuẩn bán Mỹ vào năm 1994 cà chua FlavrSavr, có thời gian bảo quản lâu loại cà chua thông thường Năm 1994, Liên minh châu Âu phê chuẩn thuốc có khả chống thuốc diệt cỏ bromoxynil Năm 1995, khoai tây Bt phê duyệt an toàn Cơ quan Bảo vệ môi trường, trở thành nông sản kháng sâu phê duyệt Hoa Kỳ Hình 1: Gạo vàng, loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm Các loại trồng chuyển đổi gen sau chấp thuận giao dịch Mỹ vào năm 1995: cải dầu với thành phần dầu chuyển đổi (Calgene), ngô bắp có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil (Calgene), kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Monsanto), bí kháng vi rút (Asgrow), cà chua chín chậm (DNAP, Zeneca / Peto, Monsanto) Tính đến năm 1996 có tổng cộng 35 phê chuẩn cấp cho loại công nghiệp chuyển đổi gen loại hoa cẩm chướng, với điểm khác quốc gia cộng thêm EU Năm 2000, lần nhà khoa học biến đổi gen thực phẩm để gia tăng giá trị dinh dưỡng việc sản xuất hạt gạo vàng II Nội dung Khái niệm Thực phẩm biến đổi gen thuật ngữ ám thực phẩm thu từ sinh vật biến đổi gen công nghệ sinh học Với công cụ công nghệ sinh học cách thức đó, làm thay đổi hay nhiều gen có chủ định với trồng vật nuôi, từ giống trồng vật nuôi tạo cho ta thực phẩm để sử dụng Những thực phẩm có cách thức gọi thực phẩm biến đổi gen Thực phẩm biến đổi gen không bao gồm thực phẩm thu từ mùa màng sau xử lý công nghệ sinh học Chẳng hạn, ta xử lý gen ngô trước gieo trồng bắp ngô thu từ ngô thực phẩm biến đổi gen Nhưng ta thu hoạch bắp ngô từ mùa vụ xử lýHình công sinhbihọc 2: nghệ Bắp ngô ến đthì ổi bắp gen ngô không gọi thực phẩm biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) loại trồng lai tạo cách sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học đại, hay gọi kỹ thuật di truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển gene chọn lọc để tạo trồng mang tính trạng mong muốn Về mặt chất, giống lai từ trước đến (hay gọi giống truyền thống) kết trình cải biến di truyền Điểm khác biệt giống lai truyền thống giống chuyển gen gen (DNA) chọn lọc cách xác dựa khoa học công nghệ đại chuyển vào giống trồng để đem lại tính trạng mong muốn cách có kiểm soát Ví dụ Gạo thường (trái) gạo biến đổi gen có nhiều vitamin A nên có màu vàng đậm (phải) Nguồn: goldenrice.org Hình 3: Gạo thường (trái) gạo biến đổi gien Hình 4: Dầu đậu tương biến đổi gen có thành phần acid béo giống dầu ô liu Nguồn: pioneer.com Ngoài chức làm thức ăn cho người, phần lớn khoai tây dùng vào mục đích khác làm thức ăn cho gia súc, cung cấp nguyên liệu thô dạng tinh bột chế biến rượu Hiện nay, khoảng 10% số khoai tây cửa hàng bán thực phẩm Mỹ khoai tây biến đổi gene Khoai tây biến đổi gen xuất sản phẩm chế biến có chứa khoai tây (Ảnh: Atli Arnarson) Hình 5: Khoai tây biến đổi gen Đậu tương loại bị chỉnh sửa gen nhiều số tất loại trồng, nhằm làm tăng sức đề kháng với côn trùng nấm, làm phong phú thêm loại vitamin, hàm lượng chất béo protein Năm 2007, nửa số đậu tương giới trồng biến đổi gene (Ảnh: Danielle Menke) Hình 6: Đậu tương biến đổi gen Ở phía tây Canada, khoảng 80% cải dầu trồng biến đổi gene Chúng có khả chống lại số loại thuốc diệt cỏ định Điều giúp người nông dân kiểm soát cỏ dại dễ dàng hơn, sử dụng lượng thuốc trừ sâu hơn, làm tăng suất trồng (Ảnh: Alamy) Hình 7: Cây cải dầu Tính trạng Cây trồng Chống chịu stress phi sinh Ngô, mía đường học Tăng suất hạt Đậu tương Kháng bệnh Đậu, đu đủ, mận, khoai tây, bí, ơt ngọt, cà chua Alfalfa, cải dầu, cẩm chướng, bông, lanh, ngô, rau Kháng thuốc diệt cỏ diếp xoăn, khoai tây, đậu tương, thuốc lá, lúa, lúa mì, củ cải đường Kháng côn trùng Alfalfa, cải dầu, cẩm chướng, bông, lanh, ngô, rau riếp xoăn, khoai tây, đậu tương, thuốc lá, lúa, lúa mì, củ cải đường Alfalfa, táo, cải dầu, cẩm chướng, ngô, chanh, Nâng cao chất lượng petunia, khoai tây, hoa hồng, lúa, đậu tương, thuốc lá, cà chua Kiểm soát thụ phấn Cải dầu, rau diếp xoăn, ngô Bảng: Các tính trạng chuyển gen thương mại hóa Ứng dụng Cây trồng chuyển gen kháng nấm gây bệnh Nấm bệnh tác nhân gây hại trồng nặng, nước nhiệt đới có độ ẩm cao Các enzyme làm thoái hóa thành phần vỏ tế bào nấm chitin β-1,3 glucan loại ý Khi chuyển gen chitinase vào thuốc tăng hoạt tính kháng nấm gây hại Sự biểu đồng thời hai gen chitinase glucanase thuốc làm cho có tính kháng nấm gây hại cao có gen độc lập Tương tự, cà chua cho tính kháng nấm Fusarium cao hẳn sau chuyển hai gen nói Protein ức chế ribosome (ribosomal inhibition protein-RIP) biểu tính kháng nấm tốt Cây thuốc cho tính kháng nấm cao, chuyển giao đồng thời gen RIP chitinase Cây trồng chuyển gen kháng vi khuẩn gây bệnh Đối với bệnh vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống công nghệ gen bắt đầu Về có ba hướng : • Dùng gen mã hóa enzyme làm thoái hóa thành tế bào vi khuẩn Chẳng hạn, gen lysozyme từ nguồn tế bào động vật từ thực khuẩn thể T4 (bacteriophage T4) đưa vào thuốc khoai tây Các gen biểu hoạt tính lysozyme mạnh tế bào có khả phòng trừ • vi khuẩn Erwina carotovora tốt Gen mã hóa : α-thionin-cystein chuyển giao sang thuốc • phòng ngừa vi khuẩn Pseudomonas syringae Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố vi khuẩn hướng có nhiều hứa hẹn Gen chủ yếu gen sản xuất loại enzyme phân hủy độc tố vi khuẩn, vô hiệu hóa tác hại chúng Cây trồng chuyển gen kháng virus gây bệnh Các virus gây thiệt hại đáng kể hầu hết trồng lương thực cho sợi phạm vi giới Phương pháp chủ yếu để khắc phục tình trạng khai thác tính kháng xuất phát từ tác nhân gây bệnh Chẳng hạn, sử dụng trình tự có nguồn gốc từ virus biểu chuyển gen để cung cấp tính kháng virus thực vật Hướng dựa sở nghiên cứu gây nhiễm (inoculation) hay xâm nhiễm (infection) thực vật, khởi đầu với chủng virus nhẹ tạo phản ứng bảo vệ chống lại gây nhiễm với loại virus virus liên quan gần gũi Cây trồng chuyển gen kháng côn trùng phá hoại Sử dụng hóa chất để phòng trừ sâu bọ côn trùng vừa đắt tiền vừa tác động xấu đến môi trường Các trồng bông, ngô khoai tây chuyển gen sản xuất thương mại biểu độc tố Bacillus thuringensis (Bt) để tạo tính kháng côn trùng loại nhai-nghiền (chewing insects) Vi khuẩn B thuringensis tổng hợp protein δ-endotoxin tinh thể mã hóa gen Cry Khi côn trùng ăn vào bụng, prototoxins bị đứt gãy dày kiềm côn trùng để tạo thành độc tố hoạt động Các liên kết tạo receptor đặc trưng tế bào biểu mô ruột làm thành lỗ chân lông cuối gây chết côn trùng Cây trồng chuyển gen cải tiến protein hạt 10 Để nhận biết tế bào vi khuẩn nhận AND tái tổ hợp nhà khoa học thường sửa dụng thể truyền gen đánh dấu chuẩn gen đánh dáu nhờ ta dễ dàng nhận biết đ ược s ự có mặt AND tái tổ hợp tế bào gen đánh dấu chuẩn có th ể gen kháng kháng sinh Bằng kỹ thuật định nhận biết sản phẩm đánh dấu Phân lập dòng tế bào chứa gen đánh dấu Hình 14: Phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp Ưu điểm nhược điểm kỹ thuật chuyển gen Có tranh luận lớn xảy vấn đề thực phẩm biến đổi gen (GMO) Đối với số người, ý tưởng thực phẩm biến đổi gen ý tưởng tốt công nghệ cho phép có khả chịu hạn chống lại sức phá hoại sâu bệnh, cho phép nhiều người có bữa ăn đầy đủ đặn Một số nghiên cứu chí cho thấy giới sản xuất 17% nhu cầu cần thiết để cung cấp cho bữa người Những người khác nhìn vào loại thực phẩm biến đổi gen tiền đề nguy hiểm Theo thử nghiệm, GMO tiềm tàng nguy gây hại đường ruột, nhiều người muốn tránh loại thực phẩm biến đổi gen nghiên cứu động vật thay đổi cấu trúc tế bào nội bộ, phát triển 20 khối u bất thường, chết bất ngờ xảy Vậy xác ưu nhược điểm loại thực phẩm biến đổi gen? (2) Nhược điểm thực phẩm biến đổi gen Đối với kinh tế: a Các loại thực phẩm biến đổi gen nhiều thời gian công sức chăm sóc để phát triển, có nghĩa giá trị kinh tế thực phát triển loại thực phẩm biến đổi gen so sánh với loại thực phẩm không biến đổi gen Đối với sức khỏe người: Theo nhà khoa học, trồng biến đổi gen tăng nguy gây gây dị ứng thực phẩm người (VD: Nếu mắc dị ứng với đậu nành biến đổi gen, sau gia súc ăn đậu nành người có xác suất cao bị dị ứng với thịt động vật.), làm nhờn kháng sinh, tạo độc tố gây độc lâu dài cho thể Đây tranh luận chủ yếu vấn đề tháo gỡ chứng tỏ sản phẩm protein có từ chuyển đổi gen chất gây dị ứng Hình 15: Bắp biến đổi gen Gen kháng sinh chuyển vào thể vi sinh vật ruột người động vật ăn thành phẩm biến đổi gen Điều dẫn tới việc tạo vi sinh vật gây bệnh có khả kháng thuốc Đối với môi trường: Cây trồng biến đổi gen mang yếu tố chọn lọc (chịu lạnh, hạn, mặn hay kháng sâu bệnh…) phát triển tràn lan quần thể thực vật Điều làm cân hệ sinh thái làm giảm tính đa dạng sinh học loài chuyển gen 21 Cây trồng biến đổi gen mang gen kháng thuốc diệt cỏ thụ phấn với dại loài hay có họ hàng gần gũi, làm lây lan gen kháng thuốc diệt cỏ quần thể thực vật Việc gieo trồng trồng biến đổi gen kháng sâu bệnh diện rộng, ví dụ, kháng sâu đục thân, làm phát sinh loại sâu đục thân kháng loại trồng biến đổi gen Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học Bt cho phép phòng trừ hiệu sâu bệnh, sau 30 năm sử dụng, số loại sâu bệnh trở nên nhờn thuốc vài nơi Ngoài ra, phận nhà khoa học lo ngại đến khả chuyển gen từ trồng vào vi khuẩn đất Tuy nhiên, khả xảy điều vô nhỏ Hiện nay, chuyên gia CNSH cố gắng giảm thiểu rủi ro nêu theo dõi cẩn thận thử nghiệm trồng biến đổi gen phòng thí nghiệm, đồng ruộng trước đưa thị trường thương mại Nếu thiết kế sử dụng phương pháp quản lý nguy trồng biến đổi gen môi trường cách hiệu Ngoài ra, theo nhiều chuyên gia, trồng đại trà thực phẩm biến đổi gene số lợi ích kinh tế bị nguy hại, người nông dân bị ép giá lệ thuộc vào công ty cung ứng giống, môi trường nông nghiệp bị biến đổi, công ty xuyên quốc gia lĩnh vực sử dụng giống biến đổi gen, khiến cho nông dân ngày phụ thuộc vào họ để đạt mục tiêu lợi nhuận b Ưu điểm thực phẩm biến đổi gen Dưới lợi ích thực phẩm biến đổi gen: 22 Hinh Hình 17: 16: Hình ảnh số rau biến đổi gen Chất lượng tổng thể hương vị tốt Thông qua việc biến đổi loại thực phẩm, hương vị tăng cường Ớt cay trở nên Ngô trở nên ngào Hương vị trở nên ngon miệng Lợi ích dinh dưỡng khác Các loại thực phẩm biến đổi gen có vitamin khoáng chất bổ sung thông qua sửa đổi di truyền để cung cấp lợi ích dinh dưỡng lớn cho người ăn chúng Điều đặc biệt phổ biến nước điều kiện thuận lợi nguồn thực phẩm Việc giảm sử dụng hóa chất Là lợi ích ban đầu rõ ràng cho người nông dân sử dụng trồng kháng thuốc trừ cỏ trồng kháng sâu bệnh Cây trồng CNSH giảm 474 triệu kg thuốc trừ sâu (tương đương 9%) giai đoạn 1996 - 2011, tương ứng với tổng lượng hoạt chất trừ sâu Liên minh châu Âu năm với vụ trồng trọt Điều tương ứng với việc giảm tác động lên môi trường 18,1% nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng diện tích trồng trồng công nghệ sinh học Lợi ích thu nhập canh tác Trong tổng lợi ích thu nhập canh tác, 49% (tương đương với 48 tỷ USD) có nhờ suất thu hoạch cao giảm sâu hại, áp lực cỏ dại hệ gen cải thiện, lại nhờ việc giảm thiểu chi phí canh tác Phần lớn (51%) thu nhập từ canh tác năm 2011 đến trực tiếp với người nông dân quốc gia phát triển, 90% nhóm nông 23 hộ nhỏ nghèo Tổng cộng từ năm 1996 - 2011, khoảng 50% tổng lợi ích thu đến với nông dân quốc gia phát triển Cây trồng công nghệ sinh học Cây trồng công nghệ sinh học có khả chống chịu với thuốc trừ cỏ không làm giảm việc dùng thuốc diệt cỏ mà làm cho đất nước hơn, thúc đẩy việc áp dụng phương pháp canh tác không làm đất để giảm thiểu xói mòn đất tượng thải carbon làm biến đổi khí hậu vào khí Thực vật biến đổi gen có khả chống chịu loại bệnh tốt Sự biến đổi gen loại vắc xin cho thực vật hay động vật, việc chủng ngừa mã hóa vào gen di truyền thay tiêm vắc xin Theo tính toán Hội đồng Khoa Học Nông nghiệp Công nghệ (CAST) cho công nghệ bắp đậu nành có hàm lượng acid phytic thấp giúp giảm nitơ tiết phospho heo gia cầm tương ứng 40% 60% Hệ thống tiêu hóa bò cải thiện làm giảm tiết nitơ lên đến 34%, giảm tiết phosphor đến 50% Cây trồng công nghệ sinh học góp phần giảm hiệu ứng nhà kính từ trình canh tác nhờ việc giảm lượng lượng sử dụng, tăng lượng cacbon lưu trữ đất nhờ giảm việc làm đất Điều tương ứng với việc năm 2011, 23 tỷ kg cacbon dioxit ngăn ngừa không bị thải vào môi trường (lượng khí thải giảm thiểu tương đương với việc "chặn" thành công 10,2 triệu xe ô tô lưu thông đường năm) Tất nước phát triển hưởng lợi từ công nghệ sinh học thông qua việc nhập hàng hóa rẻ hơn, mức độ độc tố mycotoxin thấp suất trồng cao để trồng nước Các nước phát triển trồng công nghệ sinh học hưởng lợi từ việc giảm sử dụng hóa chất, suất cao nông nghiệp mang tính cạnh tranh hơn, xuất sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen mang nguồn thu ổn định giải vấn đề việc làm cho phận lớn người dân nước Người 24 nông dân quốc gia phát triển đối tượng thụ hưởng lợi ích lợi ngày gia tăng Môi trường bảo vệ tốt nhờ việc nông dân ngày áp dụng phương pháp canh tác ảnh hưởng đến lớp đất phủ, quản lý cỏ dại cách sử dụng thuốc diệt cỏ lành tính giảm thiểu lượng thuốc trừ sâu sử dụng nhờ ứng dụng trồng biến đổi gen kháng sâu hại Việc giảm phun thuốc trừ sâu chuyển đổi sang phương thức canh tác "không làm đất" ngày đóng vai trò tích cực giảm hiệu ứng nhà kính gây canh tác nông nghiệp III Các kỹ thuật chuyển gen Việt Nam giới Phương pháp vi tiêm Nguyên tắc phương pháp vi tiêm lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần tế bào nguyên vẹn cách học kính hiển vi Phương pháp cho phép đưa gen vào vị trí mong muốn tế bào với hiệu tương đối cao.Tuy nhiên đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm làm tổn thương đến tế bào phôi tác nhân học gây tiến hành vi tiêm (3) Ðể biến nạp gen vào tế bào phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm kim giữ Kim tạo từ ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi wolfram mảnh nhờ hệ thống thiết bị làm kim Hệ thống gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim máy gia cố kim 25 Hình 18: Phương pháp vi tiêm Vi tiêm tiến hành hệ thống thiết bị vi tiêm Hệ thống gồm có hai phận kính hiển vi máy vi thao tác Hình 19: Các máy làm kim (Hãng Narishige) Máy gia cố kim Microforge Máy mài kim Máy kéo kim tự động Pipette Puller Kính hiển vi dùng cho mục đích kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên) Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá tế bào khoảng từ 40-60 lần Máy vi thao tác gồm phần giống hệt bố trí hai bên kính hiển vi, dùng để điều chỉnh kim tiêm, dùng cho kim giữ Tính máy cho phép điều chỉnh kim theo không gian chiều Kim tiêm kim giữ lắp vào máy vi thao tác nối với syringe qua ống chất dẻo nạp đầy dầu parafin Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển xen vào vector plasmid tạo dòng E.coli Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid 26 tái tổ hợp phát môi trường nuôi cấy có thuốc kháng sinh plasmid mang gen kháng thuốc đặc hiệu Các vi khuẩn sống sót sinh trưởng môi trường dinh dưỡng thích hợp plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển chép tế bào vi khuẩn phân chia Sau đó, hàng triệu plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển tách chiết từ tế bào vi khuẩn đoạn gen chuyển tách từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế Ðể tinh sạch, gen chuyển điện di gel agarose Hoà tan gen chuyển dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE ) tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế Nồng độ dung dịch DNA sử dụng cho vi tiêm thường 1-5 µg/ml Trước chuyển vào phôi, gen chuyển kiểm tra biểu tế bào nuôi cấy chuyển nhiễm (transfection) Hình 20: Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige) Kính hiển vi soi ngược Máy vi điều chỉnh Vi tiêm tiến hành qua bước: nạp gen vào kim tiêm phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường đặt kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ lực hút syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân phồng to trở nên sáng dừng lại kéo nhanh kim tiêm Trứng tiền nhân sau tiêm di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước tiêm trứng tiền nhân Mỗi nhóm trứng tiền nhân hoàn thành chuyển sang 27 đĩa môi trường khác để ấp đánh giá mắt vài tiếng Sau tất trứng tiền nhân nhìn thấy rõ ràng chuyển vào ống dẫn trứng nhận Ðối với thực vật phương pháp sử dụng tế bào tiền phôi hợp tử tế bào tiền phôi hạt phấn Chuyển gen trực tiếp vào protoplast Ðể DNA dễ xâm nhập vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Protoplast trì môi trường nuôi cấy tế bào sinh trưởng cách độc lập với môi trường đặc hiệu, vách tế bào tạo thành toàn tái sinh từ tế bào Quá trình chuyển gen thực cách trực tiếp chế vật lý đơn giản, không cần có vector (3) Ðể nâng cao hiệu biến nạp, người ta đã xử lý protoplast với PGE (polyethylene glycol) xung điện Phương pháp chuyển gen có hiệu quả, đặc biệt loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thực Tuy nhiên, việc tạo protoplast tái sinh từ protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng nhiều yếu tố môi trường Với phương pháp này, nhà khoa học chuyển gen thành công vào số loài mầm loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil, 1992) Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun) thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, thiết kế cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật phát triển vào đầu thập niên 1980 nhà thực vật học Ðại học Corrnell với nhà nghiên cứu Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA Súng bắn gen bán thị trường vào năm 1990 Ðạn sử 28 dụng cho loại súng hạt kim loại nặng bao bọc DNA Tên xác đầy đủ súng bắn gen hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) kỹ thuật thường gọi cách đơn giản biolistics (sự kết hợp hai thuật ngữ biology (sinh học) ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nguyên lý chung phương pháp sử dụng áp lực xung khí helium để gai tốc hạt (3) Súng bắn gen bao gồm hai buồng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không DNA ngoại lai gắn vào hạt tungsten có đường kính nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại khác vàng bạc sử dụng không thường xuyên giá đắt) Các hạt đặt đĩa mặt bên súng Sự bùng nổ khí helium 1000psi làm cho đĩa bắn phía trước với tốc độ 1300 food/s, Hinh 21: Ứng dụng kỹ thuật tương đương với tốc độ viên đạn rời xung điện liệu pháp gen khỏi nòng súng Một chắn làm dừng đĩa lại hạt vàng hay tungsten phóng phía tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào phóng thích phân tử DNA (Hình 2.21) Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp biểu gen phân phối Các tế bào biến đổi di truyền sử dụng Hình 22: Sơ đồ nguyên lý hoạt để tạo thực vật bao gồm sửa đổi di truyền mong muốn tất tế động súng bắn gen bào chúng (Voiland, 1999) 29 Mục tiêu súng bắn gen thường callus tế bào thực vật giống sinh trưởng môi trường gel đĩa petri Sau hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel callus bị phá vỡ nhiều Tuy nhiên số tế bào không bị phá vỡ va chạm mạnh tiếp nhận hạt tungsten bao bọc DNA cuối phân tử DNA ngoại lai xâm nhập hợp vào nhiễm sắc thể thực vật Các tế bào từ đĩa petri tập hợp lại chọn lọc tế bào hợp thành công biểu DNA ngoại lai kỹ thuật hóa sinh đại sử dụng gen chọn lọc nối tiếp Northern blots Các tế bào đơn chọn lọc từ callus xử lý với số hormone thực vật auxin, gibberelin tế bào phân chia, biệt hóa thành tế bào mô, quan, tế bào chuyên hóa toàn Cây có nguồn gốc từ tế bào nảy mầm thành công mang đặc tính di truyền Hình 23: Chuyển gen súng bắn gen Phương pháp có ưu điểm thao tác dễ dàng, chuyển gen vào nhiều loại tế bào mô, tế bào biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa gen vào tế bào vị trí mong muốn Do sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Các ứng dụng kỹ thuật bắn gen bao gồm: Tạo thực vật chuyển gen: phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực tạo ngũ cốc chuyển gen Bacillus thuringiensis loài vi khuẩn tổng hợp protein crystal (crys1Ab crys1Ac) có khả giết cách chọn lọc nhóm côn trùng định Gen mã hóa protein crystal gọi gen Bt Gen Bt 30 bắn vào mô sẹo ngũ cốc (Rassmussen, 1994) Trong tế bào sửa chữa tổn thương, DNA ngoại lai xâm nhập vào genome tế bào chủ Vì cho phép tế bào chủ phiên mã giải mã gen Bt Sau lần trình biến nạp hoàn thành người ta tiến hành sàng lọc theo phương pháp truyền thống dựa sở marker chọn lọc xen vào DNA cấu trúc (Brettschneider, 1997) Các marker chọn lọc mang tính kháng (kháng thuốc kháng sinh hay kháng thuốc diệt cỏ) kanamycin một marker phổ biến sử dụng Tiêm chủng vaccine di truyền: gen đưa vào thể súng bắn gen với mục đích gây phản ứng miễn dịch với protein biểu gen chuyển Phương pháp tiêm chủng vaccine an toàn phương pháp khác DNA ngoại lai đưa vào protein ngoại lai (Lin, 2000) Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp bắn gen sử dụng điều trị bệnh ung thư Một gen biểu protein gây độc có promoter đặc hiệu khối u đưa vào tế bào khối u Khi protein biểu tế bào khối u chết Protein gây độc tế bào khối u promoter đặc hiệu cần cho biểu tạo tế bào khối u (Lin, 2000) Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp sử dụng để chống lại ung thư Sử dụng súng bắn gen, protein biểu tế bào khối u làm cho phản ứng miễn dịch tăng lên đưa vào tế bào Phản ứng miễn dịch tăng lên nhắm vào tế bào khối u hiển nhiên gây hiệu mong muốn (Lin,2000) Dược lý di truyền: súng bắn gen sử dụng để đưa gen tổng hợp protein hữu ích hay protein liệu pháp vào thể Ví dụ yếu tố đông máu thể rối loạn đông máu tăng tổng hợp hồng cầu thể thiếu máu Sự biểu kéo dài 31 gen đưa vào vấn đề, nhiều trường hợp thường đòi hỏi phân phối gen phức tạp (Lin, 2000) Súng bắn gen công cụ nghiên cứu: súng bắn gen sử dụng để xen promoter mà dẫn đến biểu gen định Hiệu khuyếch đại protein định phương pháp có giá trị lớn nhà khoa học để nghiên cứu chức protein (Lin, 2000) Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium có khả xâm nhiễm tế bào thực vật cách chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật Khi DNA vi khuẩn hợp với nhiễm sắc thể thực vật, công vào hệ thống tổ chức tế bào cách có hiệu sử dụng để đảm bảo cho sinh sôi quần thể vi khuẩn Thật không may mắn cho nhà trồng ăn gặp phải loài vi khuẩn Bởi thủ phạm gây bệnh khối u hình chóp bệnh lông rễ nhiều loài cảnh ăn (3) Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium có hiệu số loài tất thực vật biến nạp đường Ðặc biệt, lớp mầm bao gồm ngũ cốc giới lúa, lúa mì ngô không biến nạp dễ dàng nhờ A tumefaciens Ðể khai thác sử dụng A tumefaciens vector chuyển gen nhà khoa học loại bỏ gen gây khối u gen mã hoá opine T DNA thay vào marker chọn lọc, trì vùng bờ phải bờ trái T-DNA gen vir Gen chuyển xen vào vùng bờ T-DNA Nó chuyển vào tế bào trở nên hợp với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium kiểm tra xâm nhập bền vững, biểu di truyền gen chuyển 32 đặc biệt Tuy nhiên, vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp loại mô biến nạp, giai đoạn phát triển mô, mức độ khởi đầu vi khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau biến nạp, marker sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng kiểu gen thực vật 33 Hình 24: Tạo thực vật chuyển gen phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium IV Tài liệu tham khảo (1) Xem nội dung đầy đủ tại: http://123doc.org/document/631898-visao-co-the-chuyen-gen-vao-cay-trong-thong-qua-vi-khuan(2) (3) agrobacterium-tumefaciens.htm Quan điểm : https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2y_tr %E1%BB%93ng_bi%E1%BA%BFn_%C4%91%E1%BB %95i_gen Các phương pháp chuyển gen : https://voer.edu.vn/m/cac-phuong-phap-chuyengen/993889db 34 ... niệm Thực phẩm biến đổi gen thuật ngữ ám thực phẩm thu từ sinh vật biến đổi gen công nghệ sinh học Với công cụ công nghệ sinh học cách thức đó, làm thay đổi hay nhiều gen có chủ định với trồng vật. .. trồng chuyển gen biến đổi vật chất di truyền, tiếp nhận thêm gen mới, kết xuất tính trạng tác động môi trường Quá trình biến đổi vật chất di truyền (thêm gen mới) nhờ vào công nghệ chuyển gen, ... giống trồng vật nuôi tạo cho ta thực phẩm để sử dụng Những thực phẩm có cách thức gọi thực phẩm biến đổi gen Thực phẩm biến đổi gen không bao gồm thực phẩm thu từ mùa màng sau xử lý công nghệ sinh