Phân lập và tuyển chọn chủng sinh vật tổng hợp enzyme endocellulase ứng dụng trong khâu nghiền bột giấy

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô tận tình giảng dạy khóa học vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Tô Kim Anh TS Phạm Tuấn Anh hai thầy cô tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện cho trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực Phẩm Đại học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện nhiều cho trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Hoàng Nam, ThS Lê Tuân, KS Nguyễn Khoa Đăng giúp đỡ ủng hộ thời gian nghiên cứu phòng thí nghiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân gia đình điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên toàn thể bạn bè cộng tác giúp đỡ thời gian thực luận văn thạc sỹ Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2013 Học viên Phạm Khánh Dung i Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất số liệu nghiên cứu đề tài hoàn toàn trung thực Các thí nghiệm đƣợc tiến hành cách nghiêm túc trình nghiên cứu, chép từ tài liệu khoa học Học viên Phạm Khánh Dung ii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC BIỂU ĐỒ xi ĐẶT VẤN ĐỀ xiii CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .1 1.1 Công nghệ sản xuất giấy 1.1.1 Sơ lƣợc ngành công ngiệp giấy 1.1.2 Nguyên liệu sản xuất giấy .1 1.1.2.1 Cellulose 1.1.2.2 Hemicellulose 1.1.2.3 Lignin .7 1.1.3 Quy trình sản xuất bột giấy .9 1.1.4 Quy trình nghiền bột giấy .11 1.2 Hệ enzyme ứng dụng nghiền giấy[9] 12 1.2.1 Hệ enzyme thủy phân cellulose 13 1.2.2 Hệ enzyme phân hủy hemicelluloses 15 1.3 Enzyme Endo-β-1,4-glucanases 18 1.3.1 Nguồn gốc .18 1.3.2 Cấu tạo 19 1.3.3 Tính chất hóa lý 20 1.3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 20 1.3.3.2 Ảnh hƣởng pH 20 1.3.3.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 20 1.3.3.4 Ảnh hƣởng dung môi hữu 21 1.3.4 Cơ chế xúc tác Endo-β-1,4-glucanases 21 iii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 1.3.5 Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp endoβ-1,4-glucanase 22 1.4 1.3.5.1 Nguồn carbon 22 1.3.5.2 Nguồn nitrogen 23 1.3.5.3 Nhiệt độ nuôi cấy 23 1.3.5.4 pH môi trƣờng nuôi cấy 23 Ứng dụng enzyme sản xuất nghiền .23 1.4.1 Giảm lƣợng cần thiết cho trình nghiền 24 1.4.2 Giảm thời gian nghiền 24 1.4.3 Làm thay đổi số thuộc tính xơ sợi, bột giấy giấy .24 1.5 Nâng cao khả tổng hợp enzym nhờ đột biến 25 1.5.1 Tác động tia tử ngoại 26 1.5.2 Các tác nhân gây đột biến hóa chất 28 1.6 Tình hình nghiên cứu nƣớc 29 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .31 2.1 Vật liệu-hóa chất 31 2.1.1 Nguyên vật liệu .31 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 31 2.2 2.1.2.1 Dụng cụ 31 2.1.2.2 Hóa chất môi trƣờng 32 Phƣơng pháp 35 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập 35 2.2.1.1 Nguyên tắc .35 2.2.1.2 Môi trƣờng .35 2.2.1.3 Cách tiến hành 35 2.2.2 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào buồng đếm hồng cầu 35 2.2.3 Phƣơng pháp định tính hoạt tính enzyme thông qua xác định vòng thủy phân [3]36 2.2.3.1 Nguyên tắc .36 2.2.3.2 Cách tiến hành 37 iv Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 2.2.4 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử thuốc thử DNS [36] 37 2.2.4.1 Nguyên tắc .37 2.2.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 37 2.2.4.3 Xác định hoạt độ enzyme endoglucanase 38 a Nguyên tắc: 39 b Tiến hành 39 2.2.5 Định tên vi sinh vật .40 2.2.5.1 Định tên hình thái 40 2.2.5.2 Định tên sinh học phân tử 40 2.2.6 Phƣơng pháp khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp enzyme endo-glucanase .42 2.2.6.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất 42 2.2.6.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH môi trƣờng 42 2.2.6.3 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 43 2.2.6.4 Khảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng nitơ .43 a Ảnh hƣởng nitơ hữu 43 b Ảnh hƣởng nitơ vô 43 2.2.7 Phƣơng pháp đột biến chủng nấm mốc 44 2.2.7.1 Nguyên tắc .44 2.2.7.2 Tiến hành 44 2.2.8 Tuyển chọn chủng đột biến thu đƣợc 45 2.2.8.1 Nguyên tắc .45 2.2.8.2 Phƣơng pháp 45 a Tuyển chọn sơ dựa vào vòng thủy phân với thuốc thử lugol 45 b Tuyển chọn dựa vào hoạt độ enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ chủng đột biến .45 2.2.9 biến Khảo sát đặc tính enzyme thu đƣợc từ chủng tự nhiên chủng đột 46 2.2.9.1 Khảo sát độ bền nhiệt độ bền pH enzyme endo-glucanase 46 v Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 2.2.9.2 Khảo sát nhiệt độ tối ƣu pH tối ƣu enzyme endo-glucanase 46 Tủa cồn 70 độ 47 2.2.10 2.2.10.1 Nguyên tắc .47 2.2.10.2 Tiến hành 47 2.2.11 Tủa muối amoni sulfate (NH4)2SO4 47 2.2.11.1 Nguyên tắc .47 2.2.11.2 Tiến hành 48 2.2.12 Lọc dòng ngang (Cross-Flow Filtration) 48 2.2.12.1 Nguyên tắc .48 2.2.12.2 Tiến hành 49 Sấy đông khô .49 2.2.13 2.2.13.1 Nguyên tắc .49 2.2.13.2 Tiến hành 50 2.2.14 Bảo quản lỏng 51 2.2.15 Điện protein gel polyacrylamide 51 2.2.15.1 Điện di biến tính ( SDS-PAGE) .51 a Nguyên tắc 51 b Chuẩn bị 52 a Tiến hành 53 2.2.15.2 Điện di không biến tính ( Zymogram) 54 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Kết phân lập 57 3.2 Kết tuyển chọn 58 3.2.1 Kết tuyển thông qua xác định vòng thủy phân 58 3.2.2 Kết tuyển chọn thong qua xác định hoạt độ enzyme endoglucanase phƣơng pháp DNS 60 3.2.3 Định tên chủng 61 3.2.3.1 Định tên hình thái 61 3.2.3.2 Định tên sinh học phân tử .62 vi Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp enzyme chủng R22-20 63 3.3.1 Ảnh hƣởng nồng độ chất 63 3.3.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng .64 3.3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 65 3.4 Nâng cao khả tổng hợp enzyme chủng tự nhiên nhờ đột biến .65 3.5 Tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng đột biến UV13 67 3.5.1 Ảnh hƣởng nồng độ nitơ hữu 67 3.5.2 Ảnh hƣởng nồng độ nitơ vô .68 3.5.3 nuôi Hoạt độ enzyme endo-glucanase chủng đột biến UV13 theo ngày 69 3.6 Đặc tính enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ chủng đột biến .70 3.6.1 Nhiệt độ tối ƣu 70 3.6.2 pH tối ƣu .71 3.6.3 Bền nhiệt độ 72 3.6.4 Bền pH 74 3.7 Điện di 75 3.8 Thu enzyme kỹ thuật 75 3.9 Bảo quản enzyme .77 KẾT LUẬN 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 vii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1: Thành phần cấu trúc lignocellulose 2 Hình 1.2: Công thức hóa học cellulose Hình 1.3: Mô hình Fringed fibrillar mô hình chuỗi gập 4 Hình 1.4: Công thức hóa học hemicellulose Hình 1.5: Các đơn vị lignin Hình 1.6: Các liên kết lignin polysaccarid Hình 1.7: Tác dụng enzyme cellulose 14 Hình 1.8: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến trình phân 16 giải xylan Ac: nhóm acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-OMe-GlcA: α-4-O-methylglucuronic acid (B) Thủy phân xylooligosaccharide enzyme β-xylosidase Hình 1.9: Cấu trúc không gian endoglucanase 19 10 Hình 1.10: Cơ chế xúc tác enzyme endo-glucanase 22 11 Hình 1.11: Ảnh hƣởng tia UV 27 12 Hình 3.1 : Hình ảnh số chủng phân lập từ rơm 58 13 Hình 3.2 : Hình ảnh kết tuyển chọn nhỏ lugol 59 14 Hình 3.3: Khuẩn lạc của: Aspergillus fumigatus Fresenius 62 viii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 15 Hình 3.4: Đầu sinh bào tử trần Aspergillus fumigatus 62 Fresenius (X1000) 16 Hình 3.5: Hình ảnh lựa chọn sơ môi trƣờng CMC tỷ 66 lệ vòng thủy phân ix Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1 Thành phần số loại nguyên liệu lignocelluloses Bảng 1.2: Các enzyme phân hủy cellulose 13 Bảng 3.1 : Số chủng phân lập từ rơm 57 Bảng 3.2: Tổng hợp tỷ lệ vòng thủy phân chủng đột biến 65 Trang so với chủng gốc x Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 3.5 2.91 3.0 2.74 2.55 2.5 2.10 1.87 2.0 U/ml 2.40 1.54 1.5 1.08 1.06 1.0 0.5 0.0 0.5 1.5 2.5 % pepton Biểu đồ 3.7: Ảnh hưởng Nitơ hữu Dựa vào biểu độ nhận thấy rõ khác biệt hoạt độ enzyme endoglucanase nồng độ pepton thay đổi Khi nồng độ pepton < 1%, hoạt độ enzyme tăng dần đạt cao nồng độ pepton 1% ( hoạt độ 2.91 U/ml) Khi tiếp tục tăng nồng độ pepton, hoạt độ enzyme chiều hƣớng tăng mà giảm dần ( hoạt độ enzyme môi trƣờng nuôi có 2% pepton 72% so với có 1% pepton ) Sau trình khảo sát hàm lƣợng pepton tối ƣu chọn hàm lƣợng pepton 1% thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme endo-glucanase 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ nitơ vô Trong thành phân môi trƣờng MT3 chứa muối amoni sulfat thành phần nitơ vô Khi khảo sát ảnh hƣởng nồng độ nitơ vô tiến hành hai loại muối muối amoni sulfat muối natri nitrat nhằm tăng dải khảo sát xác định ảnh hƣởng muối amoni lên chủng thu đƣợc Thành phần phần trăm muối đƣợc trình bày nhƣ mục 2.2.6.4 68 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Ảnh hƣởng nồng độ Nito vô 4.0 3.4 3.5 3.0 3.0 U/ml 2.5 3.1 3.2 3.2 0.10% 3.0 3.0 3.1 2.4 0.15% 2.0 0.50% 2.0 1.5 1% 1.0 1.50% 0.5 0.0 NaNO3 (NH4)2SO4 Biểu đồ 3.8: Ảnh hưởng nồng độ nitơ vô Với muối amoni sulfat ( (NH4)2SO4 ) hoạt độ enzyme nồng độ cao tăng so với nồng độ ban đầu ( 0.1%) Tuy nhiên lại khác biệt hoạt độ enzyme nồng độ Với muối natri nitrat ( NaNO3), hoạt độ enzyme endo-glucanase tăng đạt cực đại nồng độ 1% So sánh với hoạt độ cao sử dụng muối (NH4)2SO4 cho kết cao sau khảo sát chọn muối NaNO3 môi trƣờng nuôi với nồng độ 1% (Các kết so sánh thời điểm có lặp lại) 3.5.3 Hoạt độ enzyme endo-glucanase chủng đột biến UV13 theo ngày nuôi Tƣơng tự nhƣ chủng tự nhiên R22-20, với chủng đột biến tiến hành xác định lại thời gian tổng hợp enzyme endo-glucanase tối ƣu Kết nhƣ biểu đồ 3.8 69 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 3.5 U/ml 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Ngày Biểu đồ 3.9: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hoạt độ enzyme endo-glucanase chủng đột biến UV13 Theo biểu đồ cho thấy với chủng đột biến thời gian sinh tổng hợp enzyme cao sau ngày nuôi khác với chủng ban đầu R22-20 ( sinh tổng hợp enzyme cao sau ngày nuôi) 3.6 Đặc tính enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ chủng đột biến 3.6.1 Nhiệt độ tối ưu Phản ứng enzyme đƣợc tiến hành nhiệt độ khác từ 30 đến 80oC Kết thu đƣợc theo biểu đồ 3.10 70 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 120 Hoạt độ tƣơng đối % 100 100.00 86.96 80 71.83 64.78 60 42.66 40 20.73 20 0 20 40 60 80 100 Nhiệt độ (oC) Biểu đồ 3.10: Nhiệt độ tối ưu endo-glucanase từ chủng UV13 Biểu đồ cho thấy enzyme endo-glucanase chủng UV13 tối ƣu 70oC tƣơng tự nhƣ chủng tự nhiên R22-20 [39] 3.6.2 pH tối ưu Phản ứng enzyme thực CMC 1.25% đệm có pH khác từ đến cho kết pH cho hoạt độ enzyme cao Kết tƣợng tự nhƣ chủng tự nhiên R22-20 [39] 71 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 120 100.00 Hoạt độ tƣơng đối % 100 88.76 79.08 80 61.24 60 40 45.64 25.04 20 pH Biểu đồ 3.11: pH tối ưu endo-glucanase từ chủng UV13 3.6.3 Bền nhiệt độ Enzyme endo-glucanase từ chủng đột biến UV13 đƣợc ủ nhiệt độ khác từ 50 – 80oC ( 300 phút) Sau 1h xác định hoạt độ enzyme lại điều kiện thí nghiệm chuẩn 72 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 120 Hoạt độ tƣơng đối % 100 100 93.5 86.5 80 60 80.7 74.2 80.8 78.8 50oC 73.4 67.2 72.7 55.4 60oC 70oC 41.2 40 80oC 32.8 20 19.2 25.4 16.7 17.2 24.5 0.0 0.0 Thời gian( h) Biểu đồ 3.12: Khả bền nhiệt độ khác endo-glucanase từ chủng UV13 Tại nhiệt độ 50oC 60oC, hoạt độ endo-glucanase bền sau ủ trì đƣợc 67% hoạt độ enzyme Sau h hoạt độ enzyme giảm dƣới 14% dƣới 7% tƣơng ứng 50oC 60oC Trong nghiên cứu GrigorevskiLima cộng sự, với điều kiện tƣơng tự, enzyme endo-glucacse từ chủng A.fumigatus có hoạt độ enzyme cao 65oC Tại nhiệt độ ủ cao ( 70oC 80oC) enzyme giảm mạnh Sau 1h ủ, hoạt độ enzyme 55.4% 19.2% 24.5% sau ủ tƣơng ứng 70oC 80oC Riêng 80oC sau 4h hoạt độ enzyme không Dựa vào kết thu đƣợc tính toán thời gian bán hủy cho thấy thời gian bán hủy enzyme từ chủng đột biến đƣợc cải thiện so với chủng tự nhiên Thời gian bán hủy 693, 173 50 phút 60oC, 70oC 80oC tƣơng ứng, cao so với chủng R22-20 với thời gian bán hủy 301, 11 29 phút Nhƣ enzyme đƣợc từ chủng đột biến bền nhiệt độ chủng tự nhiên Trong số nghiên cứu có ghi chép thời gian bán hủy enzyme từ A.fumigatus cho kết T1/2 248 phút 60oC [44] Của enzyme từ chủng A.niger 167, 88.66 69 73 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học phút 50oC, 60oC 65oC tƣơng ứng [45] Enzyme từ chủng A.oryzae có thời gian bán hủy nagwns 21, phút 50oC, 53oC 56oC tƣơng ứng [30] Từ so sánh cho thấy enzyme endo-glucanase từ chủng UV có tính bền nhiệt cao Đây đặc tính đáng lƣu ý enzyme sử dụng vào sản xuất giấy trình chủ yếu đƣợc thực 60oC 3.6.4 Bền pH 110 100 Hoạt độ tƣơng đối % 100 pH3 94.8 pH4 90 90.0 80 pH5 76.6 pH6 70 pH7 64.5 60 pH8 50 Thời gian( h) Biểu đồ 3.13: Khả bền pH khác endo-glucanase từ chủng UV13 Dựa vào biểu đồ 3.13, enzyme endo-glucanase từ chủng UV13 bền pH Ở pH hoạt độ enzyme vân 73 77% sau 5h ( 300 phút) ủ Sau ủ 1h, hầu hết pH, hoạt độ enzyme dƣới 10% pH 8.4% pH 5.2%) Đặc tính bền pH đặc tính quan trọng cho enzyme ứng dụng trọng sản xuất giấy trình đƣợc tiến hành pH trung tính 74 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học So sánh với chủng tự nhiên cho thấy chủng R22-20 bền pH nhiên dải pH khác endo-glucacanase từ chủng UV13 cho khả bền Bền pH thời điểm sau 5h ủ 90 Hoạt độ tƣơng đối % 80 70 67.9 69.0 72.7 67.2 76.6 77.27 64.5 60 50 40 45.24 45.24 UV13 51.76 50 50 R22-20 30 20 10 pH Biểu đồ 3.14: Độ bền pH enzyme endo-glucanase từ chủng UV13 R22-20 (tại thời điểm sau 5h ủ) Sau trình nghiên cứu đặc tính enzyme endo-glucanase enzyme từ chủng đột biến UV13 có nhiệt độ pH tối ƣu tƣơng tự nhƣ chủng tự nhiên nhừng bền nhiệt Các đặc tính bền nhiệt bền pH cho thấy enzyme từ chủng UV13 enzyme thích hợp cho ngành công nghiệp giấy 3.7 Điện di 3.8 Thu enzyme kỹ thuật Thực phƣơng pháp khác để thu chế phẩm enzyme kỹ thuật nhằm xác định phƣơng pháp phù hợp với enzyme nghiên cứu Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng bao gồm tủa ethanol, tủa muối amoni, lọc dòng ngang sấy đông khô Kết thu thể biểu đồ sau: 75 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 60 46.58 50 39.6 50.26 50.82 40.31 Hiệu suất % 40 30 20 10 A B Tủa Tủa ethanol 70 độ muối amoni sulfat 70% C D E Tủa muối amoni sulfat 80% Tủa muối amoni sulfat 90% Lọc dòng ngang Biểu đồ 3.15: Hiệu suất thu hồi enzyme phương pháp khác Kết cho thấy việc tủa enzyme ethanol hiệu ( hoạt độ enzyme 39.6%) nên phƣơng pháp đƣợc loại bỏ Phƣơng pháp tủa muối amoni sulfate cho hiệu cao tăng dần ta tăng nồng độ muối sử dụng đạt 50.82% hiệu suất nồng độ muối bão hòa 90% Tuy nồng độ muối cao cần thêm trình loại muối sau trình tủa Vì so sánh với kết sau lọc dòng ngang cho hiệu suất thu hồi enzyme 50.26% sai khác ( hay sai khác nghĩa) so với tủa muối 90% cho ta lựa chọn phƣơng pháp lọc dòng ngang hiệu cho enzyme nghiên cứu Sau trình lọc dòng ngang ta tiến hành sấy mẫu tạo chế phẩm enzyme dạng khô Trong nghiên cứu đề tài với chủng gốc enzyme endo-glycanase từ chủng gốc R22-20 với phƣơng pháp sấy phun sấy đông khô cho hiệu sấy phun thấp (26%) thấp so với sấy đông khô ( hiệu suất lên đến 70%) 76 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học nghiên cứu tiến hành nghiên cứu phƣơng pháp sấy đông khô mẫu enzyme Tiến hành sấy đông khô dịch enzyme cô qua lọc dòng ngang với chất mang Magnesi Stearat chất bôi trơn thƣờng sử dụng trình sấy để giảm tƣợng dính thiết bị tăng hiệu suất thu hồi Lƣợng Magnesi Stearat sử dụng đƣợc khảo sát nồng độ khác 0.5% 1% 1.5% 2% kèm mẫu đối chứng không bổ sung Magnesi Stearat 90 80 82.16 81.77 72.11 86.36 71.6 Hiệu suất (%) 70 60 50 40 30 20 10 E E+0.5%MS E+1.0%MS E+1.5%MS E+2.0%MS Biểu đồ 3.16: Hiệu suất sấy đông khô enzyme với chất mang Magnesi Stearat Dựa vào kết biểu đồ 3.16 cho thấy mẫu sau sấy đông khô cho hiệu suất 70% hàm lƣợng chất mang thích hợp 1.5% Magnesi stearat – hiệu suất đạt 86.36% 3.9 Bảo quản enzyme Tiến hành bảo quản enzyme hai trạng thái lỏng rắn Kết sau thời gian đƣợc ghi chép tiếp tục nghiên cứu, khảo sát 77 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học KẾT LUẬN Đã phân lập đƣợc 74 chủng tuyển chọn đƣợc 20 chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp endoglucanase từ rơm Tuyển chọn đƣợc chủng R22-20 có khả sinh tổng hợp endoglucanase cao với hoạt độ enzyme thu đƣợc ban đầu 0.82 U/ml sau ngày nuôi 30oC Đinh tên chủng R22-20 chủng Aspergillus fumigatus Đặt tên chủng Aspergillus fumigatus R22-20 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme endo-glucanase chủng R22-20 đột biến tia UV thu đƣợc chủng UV13 có hoạt độ tăng 1.9 lần so với chủng gốc ( hoạt độ 1.687 U/ml so với hoạt độ 0.863 U/ml thời điểm so sánh) Tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng đột biến UV với thành phần môi trƣờng 2% CMC, 1% NaNO3, 1% pepton, pH ngày 30oC Enzyme từ chủng đột biến UV13 bền pH7, nhiệt độ cao phù hợp sử dụng công nghiệp giấy Chế phẩm enzyme kỹ thuật thu đƣợc sau lọc sơ bộ, lọc dòng ngang với màng 10kDa, sấy đông khô với 1.5% Magnesi Stearat cho hiệu suất trình 45.42% Bảo quản enzyme dạng lỏng với 1% PMSF, 1% EDTA, 0.05% NaN3, 30% Glucerine bảo quản enzyme dạng khô sau sấy đông khô cho hiệu tốt 78 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Phạm Thị Trân Châu and Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzyme ứng dụng NXB Giáo dục Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, and Lê Gia Huy (1999), "Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ƣu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải" Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc: p 790797 Nguyễn Lân Dũng, et al (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập Hà Nội: Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Hữu Huân (2009), "Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo-β1,4-glucanase" Sinh học thực nghiệm master: p 90 Trịnh Đình Khá (2006), "Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose đánh giá tính chất lý hóa cellulase" Công nghệ Sinh học master Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, and Nguyễn Duy Long (2003), "Khả Năng sinh tổng hợp đạc điểm cellulase Aspergillus niger RNNL 363" Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội: p 304-407 Nguyễn Đức Lƣợng (2001), Công nghệ enzyme Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trần Đình Toại, et al (2008), "Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ Actinomyces để xử lý phế thải nông nghiệp" Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học Công nghiệp thực phẩm: p 901-903 Hồ Sĩ Tráng (2007), Cơ sở hóa học gỗ xenluloza tập Vol NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Văn Tuân (2009), "Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase" Sinh học thực nghiệm master: p 97 10 Tài liệu Tiếng Anh 11 12 13 M.A.M Abo-State, et al (2010), "Enhanced Production of Cellulase(S) By Aspergillus spp Isolated from Agriculture Wastes by Solid State Fermentation" American-Eurasian Journal Agriculture & Environment Science 8(4): p 402-410 Pratima Bajpai, et al (2006), "Using of enzymes for reduction in refining energy – laboratory studies" Tappi journal 5(11): p 25-31 Petr Baldrian and Vendula Valaskova (2008), "Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi " FEMS Microbiology Review 32(3): p 501-521 79 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Sudarshana Bandyopadhyay, Moumita Karmakar, and Rina Rani Ray (2012), "Increase in Endoglucanase Productivity and Mycelial Stability of Rhizopus oryzae by Classical Mutagenesis" British Biotechnol J 2(2): p 60-72 Edward A Bayer, et al (1998), "Cellulose, cellulases and cellulosomes" Curr Opin Struct Biol 8(5): p 548-557 Beter L Bergquist, et al (1999), "Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria" FEMS Microbiol Ecol 28: p 99110 G Buschle-Diller, C Fanter, and F Loth (1999), "Structural changes in hemp fibers as a result of enzymatic hydrolysis with mixed enzyme systems" Textile Research Journal 69(4): p 244-251 B Cantarel, et al (2009), "The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics" Nucleic Acids Res 37: p 233-238 Paulchamy Chellapandi and Abha Apurvabhai Jani (2009), "Enhanced Endoglucanase Production by Soil Isolates of Fusarium sp and Aspergillus sp through Submerged Fermentation Process" Turk J Biochem 34(4): p 209-214 Min Du, Xin Ping Li, and Wu Guang Li (2011), "Influences of Bleached Softwood Pulp Pretreated with Endo-Cellulase on Fiber Surface Properties and Aggregation Structure" Advanced Materials Research 391-392: p 692696 Campillo E (1999), "Multiple endo-1,4-β-D-glucanase (cellulase) genes in Arabidopsis" Curr Top Dev Biol 46: p 39-61 Charles E.Wyman (1996), "Handbook on Bioethanol: Product and Utilization" Taylor&Francis: p 119-285 Coral G, et al (2002), "Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type Strain" Turkey Journal Biology 26: p 209213 Henriksson G, et al (1999), "Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase" Eur J Biochem 259: p 88-95 O Garcia, A.L Tores, and J.F Colom (2002), "Effect of cellulase-assisted refining on the properties of dried and never-dried eucalyptus pulp" Cellulose 9: p 115-125 Vu Van Hanh, Pham Tuan Anh, and Keun Kim (2011), "Improvement of Fungal Cellulase Production by Mutation and Optimization of Solid State Fermentation" Mycobiology 39(1): p 20-25 Vu Van Hanh, Pham Tuan Anh, and Keun Kim (2009), "Fungal Strain Improvement for Cellulase Production Using Repeated and Sequential Mutagenesis" Mycobiology 37(4): p 267-271 Gao J, et al (2008), "Purification and characterization of a novel endo - β 1,4- glucanases from thermoacidophilic Aspergillus terreus" Biotechnol Lett 30: p 323-327 80 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Henning J, et al (2005), "Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis" Enzyme Microb Technol 36: p 4248 M.R Javed, et al (2009), "Catalytic and thermodynamic characterization of endoglucanase (CMCase) from Aspergillus oryzae cmc-1" Applied Biochemistry and Biotechnology 157(3): p 483-497 Muhammad Mohsin Javed, Ikram-ul-haq, and Irfana Mariyam (2011), "Multistep mutagenesis for the over-expression of cellulase in humicola insolens" Pakistan Journal of Botany 43(1): p 669-677 Johanna Buchert, et al (1994), "Application of xylanases in the pulp and paper industry" Bioresource Technology 1: p 65-72 Aphichart Karnchanatat, et al (2008), "A novel thermostable endoglucanase from the wood-decaying fungusDaldinia eschscholzii (Ehrenb.:Fr.) Rehm" Enzyme and Microbial Technology 42: p 404-413 Jun Liu and Hui Ren Hu (2011), "Treatment of NBKP with Cellulase to Reduce the Refining Energy Consumption in Production of Grease Proof Paper" Advanced Materials Research 236-238: p 1379-1384 G Miller (1959), "Measurement of carboxymethyl cellulase activity" Analytical Biochemistry 1(2): p 127-132 Bhat MK and Bhat S (1997), "Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications" Biotechnol Adv 15: p 583-620 Dahot MU and Noomrio MH (1996), "Microbial production of cellulases by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source" J Islamic Acad Sci 9(4): p 119-124 Kitamoto N, et al (1996), "Molecular cloning, purification and characterization of two Endo-β-1,4-glucanases from Aspergillus oryzae KBN616" Appl Micribiol Biotechnol 46: p 538-544 Pham Hoang Nam, et al (2012), "Thermostable fungal endo-glucanase from R22-20 for cellulose intercleavage" The 5th AUN/SEED-Net Regional Conference on New/Renewable Energy: p 327-333 T Oksanen, et al (1997), "The effecct of Trchoderma reesei cellulase and hemicellulase on the technical properties of never-driecd bleached kraft pulp" Blackie Academic and Professional 4: p 329-339 Hetti Palonen (2004), "Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose" VTT Biotechnology: p 11-39 J Pe´rez (2002), "Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicelluloses and lignin: an overview" Int Microbiol 5: p 53-63 Macarrón R, et al (1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei" Biochem J 289: p 867-873 A.A.N Saqib, et al (2010), "Thermostability of crude endoglucanase from Aspergillus fumigatus grown under solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF)" Process Biochemistry 45(5): p 641-646 81 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 45 46 47 48 49 50 51 K.S Siddiqui, et al (1997), "Thermostabilization of carbonxymethylcellulase from Aspergillus niger by carbonxyl group modification" Biotechnology Letters 19(4): p 325-329 Kang SW, et al (1999), "Overproduction of beta-glucosidase by Aspergillus niger mutant from lignolcellulosic biomass" Biotechnol Lett 21: p 647650 Wood TM (1992), "Fungal cellulases" Biochem Soci Technol 20: p 45-53 Wood TM (1985), "Properties of cellulolytic enzyme systems" Biochemistry Social Technology 13: p 407-510 Betts W.B., et al (1991), "Biosynthesis and Structure of lignocellulose" In Betts (eds) Biodegradation: Natural and Synthetic Materials SpringerVerlag, Berlin, Germany: p 139-155 Orville Wyss, Wilson S Stone, and J Bennett Clark (1947), "The production of Mutations in Staphylococcus aureus by Chemical Treatment of the Substrate" J Bacteriol 54(6): p 767-772 B Xu, J Janson, and D Sellos (2001), "Cloning and sequencing of a molluscan endo-β-1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus edulis" Eur J Biochem 268: p 3718-3727 Tài liệu trang web 52 53 54 55 http://baobihopnhat.com http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose http://en.wikipedia.org/wiki/Lignin http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html 82 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B ... nghiên cứu enzyme endo-glucanase với đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng sinh vật tổng hợp enzyme endocellulase ứng dụng khâu nghiền bột giấy” Nội dung nghiên cứu: - Phân lập chủng vi sinh vật từ... sản xuất bột giấy .9 1.1.4 Quy trình nghiền bột giấy .11 1.2 Hệ enzyme ứng dụng nghiền giấy[9] 12 1.2.1 Hệ enzyme thủy phân cellulose 13 1.2.2 Hệ enzyme phân hủy... - Tuyển chọn chủng vi sinh vật cho hoạt độ enzyme endo-glucanase cao - Định tên chủng - Nâng cao khả sinh enzyme endo-glucanase chủng tự nhiên phƣơng pháp đột biến tia UV - Tối ƣu điều kiện sinh