Nghiên cứu sự đa dạng về trình tự ADN giống gen mã hóa enzym giới hạn giống haui ở các chủng loài microcystis aeruginosa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ ADN GIỐNG GEN MÃ HÓA ENZYM GIỚI HẠN GIỐNG HAUI Ở CÁC CHỦNG LOÀI MICROCYSTIS AERUGINOSA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học NGƢỜI HƢỚNG DẪN HOA HỌC : PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ TS LÊ THỊ KIM TUYẾN Hà Nội-2016 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH VẼ vi DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzym giới hạn 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Lịch sử enzym giới hạn 1.1.3 Phân loại enzym giới hạn 1.2 Enzym giới hạn-sửa Ďổi 1.3 Họ HauI 1.3.1 Giới thiệu HauI 1.3.2 Khám phá in silico gen thuộc họ HauI 1.3.3 Giới thiệu gen ORF8180 11 1.3.4 Giới thiệu vùng TRD 13 1.4 Microcystis aeruginosa 15 1.4.1 Sinh thái 16 1.4.2 Các loại Ďộc tố 16 1.4.3 Tầm quan trọng sinh thái 17 1.4.4 Đa dạng di truyền quần thể 17 1.5 Phƣơng pháp phân tích Ďa dạng gen RFLP 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.2.2 Hóa chất môi trƣờng 23 2.2.3 Thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp 24 2.2.1 Chọn lọc in silico gen thuộc họ HauI 24 i 2.2.2 Tách chiết ADN tổng số 25 2.2.3 Khuyếch Ďại gen ORF8180 26 2.2.4 Tách sản phẩm PCR lần gel agarose thực PCR lần 27 2.2.5 Tách dòng gen ORF8180 28 2.2.6 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào E coli 28 2.2.7 Kiểm tra E coli tái tổ hợp PCR 29 2.2.8 Tách plasmid dùng Qiagen miniprep kit 30 2.2.9 Khuyếch Ďại Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD gen ORF8180 30 2.2.10 Phân tích Ďa dạng trình tự Ďoạn mã cho vùng TRD phƣơng pháp RFLP 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Chọn lọc in silico gen thuộc họ HauI 32 3.2 Tách chiết ADN tổng số 33 3.2.1 Tách chiết ADN tổng số phenol 33 3.2.2 Tách chiết ADN tổng số kit Dneasy 35 3.3 Khuyếch Ďại gen ORF8180 36 3.3.1 Thiết kế mồi Ďể khuyếch Ďại gen ORF8180 36 3.3.2 Kết khuyếch Ďại gen ORF8180 PCR 37 3.4 Tách sản phẩm PCR lần gel agarose thực PCR lần 39 3.5 Tách dòng gen ORF8180 39 3.6 Khuyếch Ďại Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD gen ORF8180 41 3.7 Phân tích Ďa dạng trình tự Ďoạn mã cho vùng TRD gen ORF8180 RFLP 42 3.7.1 Phân tích Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD với enzym AluI 43 3.7.2 Phân tích Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD với enzym Hpy188I 44 3.7.3 Phân tích Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD với enzym HpyCh4III 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 56 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Trần Liên Hà, giảng viên môn Vi sinh – Hóa sinh Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, cô động viên khuyến khích, bảo tận tình cho điều kiện tốt để học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn TS Lê Thị Kim Tuyến, phòng Thí nghiệm Sinh học, giảng viên môn y tế công cộng, Trường Đại học Thăng Long, cô bảo tận tình, hướng dẫn chia sẻ kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi bày tỏ lòng biết ơn Viện Đào tạo sau đại học-Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm- Đại học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập giúp hoàn thành khóa học luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên, khích lệ giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần, chỗ dựa vững để vượt qua khó khăn, không ngừng phấn đấu suốt trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Nguyễn Thị Mai Phƣơng iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan Ďây nghiên cứu Các số liệu luận văn thu thập thực trình nghiên cứu cách khoa học xác Kết luận văn chƣa Ďƣợc Ďăng tải tạp chí hay công trình khoa học Tác giả Nguyễn Thị Mai Phương iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid Deoxyribonucleic AdoMet: S-adenosyl-L-methionine Amp : Ampicillin ATP: Adenosine Triphosphate bp: base pair (Ďôi bazơ) Chl : Chloramphenicol EDTA: Ethylene Diamine Tetracetic Acid IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB: Luria Broth PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (sự Ďa hình chiều dài Ďoạn cắt giới hạn) RM: Restriction-Modification (giới hạn-sửa Ďổi) RE: Restriction Enzym (enzym giới hạn) SNP: Single Nucleotide Polymorphism (Ďa hình nucleotide Ďơn) TRD: Target Recognition Domain (vùng nhận trình tự Ďặc hiệu) v DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cấu trúc enzym giới hạn Hình 1.2: Trình tự axit amin HauI lấy từ GenBank 11 Hình 1.3: Trình tự ADN ORF8180 lấy từ GenBank 12 Hình 1.4: Trình tự axit amin ORF8180 lấy từ GenBank 13 Hình 3.1: Motif vùng cắt ADN họ HauI 32 Hình 3.2: Motif vùng bám AdoMet họ HauI 33 Hình 3.3: Motif vùng methyl hóa họ HauI 33 Hình 3.4: Ảnh Ďiện di ADN tổng số mẫu TL, TC, S3, S4 34 Hình 3.5: Ảnh Ďiện di ADN tổng số mẫu ST, BK, CD, ML 35 Hình 3.6: Vị trí thiết kế cặp mồi LF LR Ďể khuyếch Ďại gen ORF8180 36 Hình 3.7: Ảnh Ďiện di sản phẩm PCR gen ORF8180 với cặp mồi LF LR 38 Hình 3.8: Ảnh Ďiện di sản phẩm PCR lần hai gen ORF8180 với cặp mồi LF LR 39 Hình 3.9: Ảnh Ďiện di sản phẩm PCR Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD gen ORF8180 41 Hình 3.10: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD gen ORF8180 42 Hình 3.11: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD enzym giới hạn AluI 43 Hình 3.12: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD enzym giới hạn Hpy188I 44 Hình 3.13: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD enzym giới hạn HpyCH4III 45 Phụ lục hình 1: Kết so sánh trình tự vùng TRD TC với gen chuẩn 56 Phụ lục hình 2: Kết so sánh trình tự vùng TRD TL với gen chuẩn 57 Phụ lục hình 3: Kết so sánh trình tự vùng TRD S3 với BK 58 vi Phụ lục hình 4: Kết so sánh trình tự vùng TRD S3 với gen chuẩn 59 Phụ lục hình 5: Kết so sánh trình tự vùng TRD S4 với gen chuẩn 60 Phụ lục hình 6: Kết so sánh trình tự vùng TRD gen ML2, ML6, ML7, ML_R6 với 61 Phụ lục hình 7: Kết so sánh trình tự vùng TRD ML2 với gen chuẩn 62 Phụ lục hình 8: Kết so sánh trình tự vùng TRD ML1 với ML3 62 Phụ lục hình 9: Kết so sánh trình tự vùng TRD ML1với gen chuẩn 63 Phụ lục hình 10: Kết so sánh trình tự vùng TRD CD với gen chuẩn 64 Phụ lục hình 11: Kết so sánh trình tự vùng TRD ST với gen chuẩn 65 Phụ lục hình 12: Kết chuối trình tự axit amin vùng TRD 14 gen với gen chuẩn phần mềm PROMALS3D 67 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Danh sách gen phân lập Ďƣợc 40 Bảng 3.2: Kích thƣớc Ďoạn ADN sau cắt vùng TRD gen ORF8180 enzym giới hạn 42 Bảng 3.3: So sánh kết phân tích RFLP 14 gen với gen chuẩn 46 Bảng 3.4: Chiều dài ƣớc tính Ďoạn cắt giới hạn vùng TRD 14 gen với enzym HpyCH4III, AluI, Hpy188I 47 Phụ lục bảng 1: Kết so sánh trình tự vùng TRD 14 gen so với gen chuẩn 66 viii MỞ ĐẦU Enzym giới hạn công cụ quan trọng kĩ thuật gen công nghệ ADN tái tổ hợp, giúp thao tác ADN trở nên dễ dàng Sự tìm enzym giới hạn giúp khám phá kho tàng tri thức khổng lồ cấu trúc chế hoạt Ďộng gen prokaryote eukaryote Nhờ có enzym giới hạn, công nghệ gen Ďã Ďạt Ďƣợc thành tựu mang tính Ďịnh, mở nhiều hƣớng nghiên cứu lĩnh vực công nghệ sinh học Đó nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp, sản xuất chế phẩm y-sinh học hữu ích (từ tế bào vi khuẩn, nấm men), tạo giống sinh vật Từ Ďó giải kịp thời vấn Ďề thực tiễn Ďặt công nghệ thực phẩm, y học, công tác chọn tạo giống, xử lý môi trƣờng, khai thác kim loại dầu mỏ Cách Ďây lâu, cấu trúc phân tử enzym giới hạn loại II Ďã Ďƣợc mô tả Cũng nhƣ với protein-enzym khác, ngƣời ta không phát có giống enzym giới hạn có chung chức sinh hóa hay chức tế bào Gần Ďây, nhóm nghiên cứu Morgan Ďã tìm hai họ enzym MmeI HauI có Ďộ giống trình tự axit amin lên tới 40% [34] Hai họ có Ďặc Ďiểm mang hai chức giới hạn sửa Ďổi phân tử Microcystis aeruginosa loại vi tảo mọc nhiều tầng nƣớc mặt ao hồ tù Ďọng Sự bùng nổ vi tảo làm ô nhiễm môi trƣờng gây chết loài thủy sinh Ďộc tố tiết Loài Ďã Ďƣợc giải trình tự ADN tìm thấy gen ORF8180 mã hóa cho enzym giới hạn giả Ďịnh thuộc họ HauI Phân tích mẫu Microcystis aeruginosa lấy thiên nhiên Ďể thấy Ďƣợc Ďa dạng gen giống enzym giới hạn Ďem lại nhiều hiểu biết cho lĩnh vực nghiên cứu khoa học ngành dịch tễ học phát 30 Meisel A., Bickle T.A., Kriiger D.H., Schroeder C (1992) Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage Nature, 355(6359), 467–469 31 Meselson M., Yuan R (1968) DNA Restriction Enzyme from E coli Nature, 217, 1110–1114 32 Morales G., Picazo J.J., Baos E., Candel FJ, Arribi A, Peláez B (2010) Resistance to Linezolid Is Mediated by the cfr Gene in the First Report of an Outbreak of Linezolid-Resistant Staphylococcus aureus Clin Infect Dis, 50(6), 821–825 33 Morgan R.D., Bhatia T.K., Lovasco L., Davis TB (2008) MmeI: a minimal Type II restriction-modification system that only modifies one DNA strand for host protection Nucleic Acids Res, 36(20), 6558–6570 34 Morgan R.D., Luyten Y.A (2009) Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity Nucleic Acids Res, 37(15), 5222–5233 35 Morgan R.D., Dwinell E.A., Bhatia T.K., Lang EM, Luyten YA (2009) The MmeI family: type II restriction–modification enzymes that employ single-strand modification for host protection Nucleic Acids Res, 37(15), 5208–5221 36 Moult J., Hubbard T., Bryant S.H., Fidelis K, Pedersen JT (1997) Critical assessment of methods of protein structure prediction (CASP): Round II Proteins Struct Funct Bioinforma, 29, 2–6 37 Murray N.E (2000) Type I Restriction Systems: Sophisticated Molecular Machines (a Legacy of Bertani and Weigle) Microbiol Mol Biol Rev, 64(2), 412–434 38 Naito T., Kusano K., Kobayashi I (1995) Selfish behavior of restrictionmodification systems Science, 267(5199), 897–899 53 39 Needleman S.B., Wunsch C.D (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins J Mol Biol, 48(3), 443–453 40 Niv M.Y., Ripoll D.R., Vila J.A., Liwo A, Vanamee ES, Aggarwal AK (2007) Topology of Type II REases revisited; structural classes and the common conserved core Nucleic Acids Res, 35(7), 2227–2237 41 Padmavathi P., Veeraiah K (2009) Studies on the influence of Microcystis aeruginosa on the ecology and fish production of carp culture ponds African J Biotech, 8(9), 1911-1918 42 Pei J., Kim B.-H., Grishin N.V (2008) PROMALS3D: a tool for multiple protein sequence and structure alignments Nucleic Acids Res, 36(7), 2295– 2300 43 Pingoud A Jeltsch A (2001) Structure and function of type II restriction endonucleases Nucleic Acids Res, 29(18), 3705–3727 44 Pingoud A., Wilson G.G., Wende W (2014) Type II restriction endonucleases—a historical perspective and more Nucleic Acids Res, 42(12), 7489–7527 45 Roberts R.J (2005) How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology Proc Natl Acad Sci USA, 102(17), 5905–5908 46 Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D (2015) REBASE—a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes Nucleic Acids Res, 43, 298–299 47 Sanger F., Tuppy H (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin: The identification of lower peptides from partial hydrolysates Biochem J, 49(4), 463–481 48 Sanger F., Tuppy H (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin: The investigation of peptides from enzymic hydrolysates Biochem J, 49(4), 481–490 54 49 Schober E., Kurmayer R (2006) Evaluation of different DNA sampling techniques for the application of the real-time PCR method for the quantification of Cyanobacteria in water Lett Appl Microbiol, 42(4), 412– 417 50 Sistla S., Rao D.N (2004) S-Adenosyl-L-methionine–Dependent Restriction Enzymes Crit Rev Biochem Mol Biol, 39(1), 1–19 51 Smith H.O., Wilcox K.W (1970) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: I Purification and general properties J Mol Biol, 51(2), 379–391 52 Somek, Hasim, (2008) A Case Report: Algal Bloom of Microcystis aeruginosa in a Drinking-Water Body, Eğirdir Lake, Turkey A Case Report: Algal Bloom of Microcystis aeruginosa in a Drinking-Water Body, Eğirdir Lake, Turkey Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 8, 177-179 53 Sturrock S.S., Dryden D.T (1997) A prediction of the amino acids and structures involved in DNA recognition by type I DNA restriction and modification enzymes Nucleic Acids Res, 25(17), 3408–3414 54 Villa-Komaroff L., Efstratiadis A., Broome S., omedico P, Tizard R, Naber SP (1978) A bacterial clone synthesizing proinsulin Proc Natl Acad Sci USA, 75(8), 3727–3731 55 Williams R.J (2003) Restriction endonuclease Mol Biotechnol, 23(3), 225–243 56 Wilson A.E., Sarnelle O., Neilan B.A., Salmon TP, Gehringer MM, Hay ME (2005) Genetic Variation of the Bloom-Forming Cyanobacterium Microcystis aeruginosa within and among Lakes: Implications for Harmful Algal Blooms Appl Environ Microbiol, 71(10), 6126–6133 57 Ye X., Wang G., Altschul S.F (2011) An assessment of substitution scores for protein profile–profile comparison Bioinformatics, 27(24), 3356– 3363 58 Yuan R (1981) Structure and Mechanism of Multifunctional Restriction Endonucleases Annu Rev Biochem, 50(1), 285–315 55 PHỤ LỤC Phụ lục hình 1: Kết so sánh trình tự vùng TRD TC với gen chuẩn (Query: TC, Subject: gen chuẩn) 56 Phụ lục hình 2: Kết so sánh trình tự vùng TRD TL với gen chuẩn (Query: TL, Subject: gen chuẩn) 57 Phụ lục hình 3: Kết so sánh trình tự vùng TRD S3 với BK (Query: S3, Subject: BK) 3A)Về trình tự ADN 58 3B) Về trình tự axit amin Phụ lục hình 4: Kết so sánh trình tự vùng TRD S3 với gen chuẩn (Query: S3, Subject: gen chuẩn) 4A) Về trình tự ADN 59 4B) Về trình tự axit amin Phụ lục hình 5: Kết so sánh trình tự vùng TRD S4 với gen chuẩn (Query: S4, Subject: gen chuẩn) 5A)Về trình tự ADN 60 5B)Về trình tự axit amin Phụ lục hình 6: Kết so sánh trình tự vùng TRD ML2, ML6, ML7, ML_R6 với 61 Phụ lục hình 7: Kết so sánh trình tự vùng TRD ML2 với gen chuẩn (Query: ML, Subject: gen chuẩn) Phụ lục hình 8: Kết so sánh trình tự vùng TRD ML1 với ML3 (Query: ML1, Subject: ML3) 62 Phụ lục hình 9: Kết so sánh vùng TRD ML1 với gen chuẩn (Query: ML1, Subject: gen chuẩn) 9A)Về trình tự ADN 9B)Về trình tự axit amin 63 Phụ lục hình 10: Kết so sánh trình tự vùng TRD CD với gen chuẩn (Query: CD, Subject: gen chuẩn) 10A)Về trình tự ADN 10B)về trình tự axit amin 64 Phụ lục hình 11: Kết so sánh trình tự vùng TRD ST với gen chuẩn (Query: ST, Subject: gen chuẩn) 11A)Về trình tự ADN 11B)Về trình tự axit amin 65 Phụ lục bảng 1: Kết so sánh trình tự vùng TRD 14 gen với gen chuẩn Gen chuẩn BK TC TL TS CD S4 S3 ML1 ML2 ML3 ML6 M7 ML_R6 ST K G G G K K K K K K K K K K K: khác, G: giống 66 Phụ lục hình 12: Kết chuỗi trình tự axit amin vùng TRD 14 gen với gen chuẩn phần mềm PROMALS3D 67 ... tài Nghiên cứu đa dạng trình tự ADN giống gen mã hóa enzym giới hạn giống HauI chủng loài Microcystis aeruginosa. ” Mục tiêu Ďề tài: - Phát có mặt gen giống HauI mẫu tự nhiên khác chứa Microcystis. .. Microcystis aeruginosa - Nghiên cứu Ďa dạng trình tự gen giống HauI CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzym giới hạn 1.1.1 Định nghĩa Enzym giới hạn (RE) enzym phân cắt ADN nhận trình tự nucleotide... giải trình tự ADN tìm thấy gen ORF8180 mã hóa cho enzym giới hạn giả Ďịnh thuộc họ HauI Phân tích mẫu Microcystis aeruginosa lấy thiên nhiên Ďể thấy Ďƣợc Ďa dạng gen giống enzym giới hạn Ďem lại