Kỹ thuật chuyển gen và ứng dụng

Chương PHÂN TÍCH DI TRUYỀN SINH VẬT CHUYỂN GEN Mục tiêu - Giải thích được bản chất khái niệm chuyển gen, gen chuyển và sinh vật chuyển gen; - Tiếp cận và nắm được nguyên lý phân tích sinh vật chuyển gen, cụ thể là: (i) Phân tích có mặt gen chuyển bằng phương pháp PCR, Southern blot; (ii) Phân tích biểu hiện gen chuyển thông qua phiên mã bằng phương pháp RT-PCR, Northern blot, Real time RT-PCR; (iii) Phân tích biểu hiện gen chuyển thông qua sản phẩm dịch mã bằng phân tích điện di, Western blot, ELISA; (iv) Phân tích biểu hiện đặc tính sinh học gen chuyển - Giải thích được nguyên lý kỹ thuật RNAi và phân tích di truyền kỹ thuật RNAi Hiểu được những ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng virus Phương pháp: Nghe giảng Giảng viên trình bày Yêu cầu: Đọc trước tài liệu, ghi chép và hoàn thành bài tập, viết báo cáo nhỏ Đánh giá: Điểm chuyên cần, mức độ hoàn thành báo cáo Tài liệu học tập Chu Hoàng Mậu (2008) Phương pháp phân tích di truyền hiện đại chọn giống trồng Nxb Đại học Thái Nguyên A NỘI DUNG GIẢNG TRÊN LỚP Chuyển gen 1.1 Khái niệm chuyển gen (transgensis) (i) Chuyển gen là kỹ thuật đưa đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen (genome) thể đa bào Đoạn DNA ngoại lai (gen chuyển) có mặt hầu hết các tế bào và được di truyền lại cho hệ sau (ii) Gen chuyển phải được hợp nhất vào hệ gen (genome) tế bào chủ được thực hiện với tham gia các chế sửa sai DNA tế bào Sự hợp nhất đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen diễn theo chế tái tổ hợp tương đồng không tương đồng (iii) Gen chuyển được biểu hiện tế bào chủ thông qua phiên mã tạo mRNA, dịch mã tạo protein; (iv) Tế bào chủ là tế bào động vật, thực vật tái sinh thành thể chuyển gen, vậy khái niệm chuyển gen được sử dụng cho thực vật và động vật Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) tế bào biến nạp (transformed cell) Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gen therapy) Có trường hợp các tế bào mầm không mang DNA ngoại lai Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gen therapy) được sử dụng Các tế bào mầm này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho hệ sau Thuật ngữ GMO (Gentically modified organism) -Sinh vật biến đổi gen, được sử dụng chủ yếu để các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm Ðộng vật, thực vật chuyển gen là động vật, thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA hệ gen Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả tế bào, kể cả các tế bào sinh sản Nếu dòng tế bào sinh sản bị biến đổi (chứa gen chuyển), tính trạng gen chuyển xác định được truyền cho các hệ thông qua sinh sản Nếu có dòng tế bào sinh dưỡng chứa gen chuyển có thể mang các tế bào sinh dưỡng bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho hệ sau Như vậy, việc chuyển gen ngoại lai vào động vật, thực vật thành công các gen này di truyền và biểu hiện các hệ sau Nguyên tắc bản việc tạo động vật, thực vật chuyển gen là đưa vài gen ngoại lai vào động vật, thực vật người chủ động tạo Các gen ngoại lai này phải được di truyền thông qua dòng tế bào sinh sản và vậy tế bào kể các tế bào mầm sinh sản động vật, thực vật chứa vật chất di truyền được sửa đổi (v) Sự hợp nhất đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen (genome) tế bào chủ được thực hiện với tham gia các chế sửa sai DNA tế bào Sự hợp nhất đoạn DNA ngoại lai vào genome diễn theo chế tái tổ hợp tương đồng và không tương đồng 1.2 Vector chuyển gen Vector là phân tử DNA có khả mang đoạn DNA ngoại lai và xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp có khả tự tái bản không phụ thuộc vào chép hệ gen tế bào chủ Vector có các ứng dụng chủ yếu sau đây: - Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản trình tự DNA xác định - Tạo sinh vật chuyển gen (chuyển các gen vào tế bào hay thể) - Sản xuất ARN với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng - Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng Đặc tính cần có vector: - Vector có khả tự chép tích cực tế bào vật chủ Độc lập với chép gen vật chủ - Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt - Vector phải được phát hiện rõ ràng vật chủ - Phải tồn tế bào chủ qua nhiều hệ - Vector tồn vị trí nhận biết cho enzyme giới hạn Vector có thể được cắt vị trí xác định bằng enzyme giới hạn và được nối với đoạn DNA tương hợp khác nhờ enzyme ligase Vector được sử dụng với mục đích tách dòng gen (vector tách dòng), sử dụng với mục đích biểu hiện gen (Vector biểu hiện) và mục đích chuyển gen (vector chuyển gen) Một số loại vector đặc biệt khác dùng kỹ thuật chuyển gen như: Ti plasmid; Re plasmid; YACs; BACs; Retrovirus; Baculovirus; Yeast micron plasmid 1.3 Chuyển gen thực vật 1.3.1 Vector chuyển gen thực vật Một gen muốn biểu hiện được phải có đầy đủ các thành phần sau: (1) Vùng điều khiển (promotor), (2) Gen cấu trúc mang các codon khởi động (start codon) và codon ngừng (stop codon), (3) Đoạn DNA kết thúc (transcription terminator) Trong chuyển gen thực vật hiện người ta thường sử dụng vi khuẩn Agrobacterium, nhờ Ti-plasmid Vi khuẩn Agrobacterium gây các khối u thực vật Agrobacterium tumefaciens và A rhizogens là hai loài vi khuẩn sống đất gây bệnh khối u hình chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) các vị trí tổn thương thực vật hai lá mầm Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn vắng mặt vi khuẩn, và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô các môi trường thiếu bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh, mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sinh trưởng mô thực vật in vitro Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng o được trì ổn định Agrobacterium nhiệt độ 30 C Trong hình thành khối u, T-DNA được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-DNA ổn định genome nhân T-DNA được phiên mã các tế bào khối u tạo nhiều mARN polyadenyl 1.3.2 Kỹ thuật chuyển gen thực vật Các khâu chính kỹ thuật chuyển gen thực vật hiện nay: (1) Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm: Tiến hành phân lập gen và tách dòng gen để xác định đặc điểm cấu trúc gen (2) Thiết kế vector chuyển gen: Lựa chọn vector chuyển gen và phương pháp chuyển gen thích hợp Tạo vector tái tổ hợp (3) Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen mô hình chủ chuyển gen (4) Biến nạp vector tái tổ hợp mang gen chuyển vào mô mô hình Tái sinh biến nạp phân tích mô hình chuyển gen (5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào mô đích Tái sinh biến nạp Phân tích chuyển gen đánh giá mức độ biểu chức sinh học chuyển gen 2 Phân tích sinh vật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật nói chung được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các hệ sau; (iv) hệ sản phẩm gen chuyển phải được biểu hiện, và (v) sản phẩm gen chuyển biểu hiện được chức sinh học Phân tích sinh vật chuyển gen là quá trình chọn lọc, phân tích sinh vật chuyển gen hệ được thực hiện bằng (1) Hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, (2) Xác định có mặt gen chuyển tế bào thể chủ; (3) Kiểm tra biểu hiện gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA, protein; và (4) Phân tích biểu hiện chức sinh học gen chuyển Có thể mô tả khái quát các thí nghiệm phân tích sinh vật chuyển gen sơ đồ hình đây: Sơ đồ phương pháp phân tích sinh vật chuyển gen (1) Chọn lọc các thể biến nạp môi trường nuôi cấy in vitro bằng các chất chọn lọc, ví dụ: chất diệt cỏ, chất kháng sinh (2) Sử dụng kỹ thuật PCR, Southern blot vào việc phân tích có mặt gen chuyển: i) Cở sở việc phân tích có mặt gen chuyển: i) Gen chuyển được biến nạp vào mô tế bào chủ, mô tế bào tái sinh thành thể; ii) gen chuyển hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; ii) PCR xác định được có mặt cuiar gen chuyển sinh vật chuyển gen; iii) Lai Southern xác định được số bản copy gen chuyển sinh vật chuyển gen; (3) Phân tích biểu hiện gen chuyển thông qua phiên mã: i) RT-PCR xác định định tính phiên mã gen chuyển; ii) Lai Northern blot cho phép xác định trực tiếp có mặt các phân tử mRNA sản phẩm phiên mã gen chuyển; iii) Real time RT-PCR đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển (4) Phân tích biểu hiện gen chuyển thông qua sản phẩm dịch mã: i) Điện di protein cho phép dự đoán xuất hiện protein tái tổ hợp, sản phẩm gen chuyển; ii) Lai western cho phép khẳng định sản phẩm dịch mã gen chuyển (5) Phân tích biểu hiện đặc tính sinh học gen chuyển: Đánh giá biểu hiện chức sinh học gen chuyển điều kiện nhân tạo, thử nghiệm vật liệu thí nghiệm; Nguyên lý kỹ thuật RNAi phân tích di truyền kỹ thuật RNAi 3.1 Nguyên lý của kỹ thuật RNAi RNAi là chế làm ức chế gen có thể phát hiện thấy giới nấm, thực vật và động vật Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện phiên mã cao RNA sense, anti-sense RNA kẹp tóc bổ sung chính mà chứa trình tự tương đồng với gen đích RNAi là quá trình sinh học các phân tử RNA ức chế biểu hiện gen bằng cách phân hủy các phân tử mRNA Hiện tượng này được quan sát lần vào năm 1928 những thuốc lá kháng bệnh đốm vòng Tobacco ring spot virus gây sau lần lây nhiễm thứ hai Năm 1986 nghiên cứu các chuyển gen Ecker và Davis nhận thấy có biểu hiện ức chế phiên mã nhờ RNA ''chiều đối mã'' (antisense RNA) Tuy nhiên vào những năm 90 kỷ XX các nhà sinh học phân tử gặp khó khăn việc giải thích kết quả nghiên cứu Fire và Mello khám phá chế can thiệp RNAi - nghiên cứu này giúp họ giành Giải Nobel Y học năm 2006 Fire và Mello cho rằng RNA mạch kép có thể làm các gen ngừng hoạt động Cơ chế RNAi hữu hiệu gen mà trình tự bổ sung với những vị trí phân tử RNA đích i) Con đường ức chế gen RNAi Ở thực vật có ba đường ức chế gen RNAi Con đường thứ nhất là ức chế gen sau phiên mã (post-transcriptional gen silencing-PTGS) qua trung gian là siRNA (short interfering RNA) Con đường thứ hai là hiện tượng tạo các miRNA (micro-RNA) điều chỉnh biểu hiện gen tế bào (Hình 2) Con đường thứ ba là câm gen phiên mã (transcriptional gene silencing - TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, bao gồm methyl hóa histone và DNA Các thành phần quan trọng tham gia vào chế RNAi là những RNA ức chế nhỏ siRNA hay miRNA, các enzyme Dicer, Doshar và Argonaute phức hệ RISC Hình Mô đường làm câm gen thông qua RNAi AGO: Argonaute); dsRNA: double-stranded RNA; PTGS: posttranscriptional gene silencing; RDR: RNA dependent RNA polymerase; RISC: RNA-induced silencing complex; RITS: RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing; siRNA: short interfering RNA; miRNA: miro-RNA; TGS: transcriptional gene silencing ii) Sự ức chế gen sau phiên mã thông qua siRNA siRNA được tạo thành phân cắt các dsRNA Dicer, là phần tử mấu chốt chế làm câm gen RNAi Cấu trúc nguyên vẹn phân tử siRNA rất quan trọng cho tính đặc hiệu quá trình RNAi Hai mạch sợi kép siRNA khác độ bền với nhiệt độ cuối cùng, thuộc tính để nhận biết sợi đơn cần thiết siRNA vào phức hệ RISC Sự giãn xoắn siRNA tạo sợi dẫn đầu (guide strand) vào phức hệ RISC và liên kết với mRNA đích đặc hiệu bổ sung trình tự tương đồng Sợi lại được gọi là “sợi chờ” (passenger strand) và bị phân hủy sau Do sợi dẫn đầu siRNA phải tương tác với số protein liên quan quá trình RNAi từ được tạo lúc nhận biết mRNA đích Đoạn siRNA được tạo thành dài khoảng 21 – 25 nucleotide mang nhóm 5’-PO4 và 3’-OH với nucleotide đầu 3’ Sợi sense mạch kép siRNA dễ bị thay đổi hóa tính là sợi antisense, thay đổi diễn giữa và phía đầu 3’ siRNA có ảnh hưởng chặt chẽ tới tính đặc hiệu RNAi là những thay đổi đầu 5’ Nhiều nghiên cứu cho thấy là sợi đối mã có hoạt động quan trọng phức hợp sense và RNA đích Các nucleotide đầu 3’ có ý nghĩa quá trình xử lý RNAi Khi tăng giảm số nucleotide đầu 3’ làm giảm hiệu quả khởi động quá trình Khi tiến hành thử thay nhóm 5’-PO bằng nhóm chất lớn 2’-Omethyl kết quả ảnh hưởng nghiêm trọng đến sợi kép siRNA khởi đầu cho chuỗi phản ứng RNAi thể Phát hiện này và số quan sát khác làm rõ chức quan trọng nhóm 5’-PO4 Sự có mặt 5’-PO4 làm ổn định phức hệ RISC và rất quan trọng cho xác định bắt cặp chính xác RISC và phân cắt vị trí RNA đích Nếu vắng mặt nhóm 5’-PO4, siRNA trượt dài theo phức hệ RISC Nhóm 5’-PO4 có thể được tách quá trình phân cắt thực hiện RNA đích Một đoạn siRNA sợi kép thiếu cả hai nhóm 5’-PO không thể khởi đầu chuỗi RNAi tế bào Sự có mặt nhóm 3’-OH quan trọng không thật cần thiết thay đổi diễn đầu này không gây ảnh hưởng nhiều đến quá trình RNAi Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy tương bào và là đường quan trọng tế bào thực vật nhiễm virus Trong trường hợp là virus DNA thực vật, dsRNA có thể được tạo nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối Khi có xâm nhập chuỗi xoắn kép RNA vào tương bào, Dicer - loại ribonuclease đặc hiệu cho dsRNA lập tức cắt những chuỗi kép RNA này những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotid, gọi là siRNA có tiêu hao phân tử ATP siRNA tạo là những sợi đôi có chứa nhóm phosphat tận đầu 5’ Sau bị cắt ngắn dicer, chuỗi kép siRNA được tách làm hai chuỗi đơn, và chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (basepairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA xảy phức hệ RISC, có chứa Argounaute và Helicase Phân tử ATP phân tách siRNA sợi đôi để tạo thuận lợi cho RISC hoạt động, phức hệ RISC sau nhận biết các phân tử phiên mã mRNA tế bào có trình tự tương đồng với trình tự đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này có mặt phức hệ RISC Sau nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base bổ sung với trình tự chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt khoảng giữa chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3’ Sau bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ các RNase iii) Sự ức chế RNA thông qua miRNA Ngay sau phát hiện chế RNAi, người ta nhanh chóng nhận rằng, chế này tồn tế bào hệ thống điều hòa biểu hiện gen gọi là microRNA (miRNA) Sự khác biệt quan trọng giữa miRNA và siRNA trước hết là nguồn gốc chúng, miRNA bắt nguồn từ các locus hệ gen siRNA thường bắt nguồn từ mRNA, transposon virus Thứ hai, miRNA được chế biến từ phiên mã có thể tạo cấu trúc kẹp tóc RNA siRNA được chế biến từ RNA sợi đôi dài dạng kẹp tóc kéo dài Thứ ba, sợi đôi miRNA/miRNA* được tạo từ tiền phân tử kẹp tóc miRNA, dẫn tới tích luỹ nhiều miRNA khác từ các sợi dsRNA dài này Thứ tư, trình tự miRNA tương đối bảo thủ những sinh vật có quan hệ gần gũi, siRNA nội sinh bảo thủ Những khác này là sở thực tế để phân biệt và giải những siRNA nội sinh và miRNA khám phá miRNA là loại RNA nhỏ dài 21-24 nucleotide không mã hóa có chức chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã cặp bazơ có trình tự bổ sung gần hoàn toàn với mRNA đích Cơ chế miRNA có nhiều điểm tương đồng với chế siRNA Trong tế bào sinh vật, những phân tử miRNA (gọi là pre-miRNAs) được tạo nhân qua quá trình phiên mã từ gen, pre-miRNAs được cắt gọt enzyme có nhân gọi là drosha để tạo thành những sợi pre-miRNAs Các pre-miRNAs sau được di chuyển ngoài bào tương và tương tác với enzyme dicer tạo thành miRNA là phức hệ RISC trình bày Ở thực vật, miRNA được tạo thành nhờ dicer và phần lớn xảy nhân, và có protein liên kết dsRNA đặc hiệu là HYL1 miRNA động vật thường liên kết với vùng 3’ không dịch mã (untranslated region, UTR) mRNA, miRNA thực vật có gắn kết với trình tự mã hóa và thậm chí vùng 5’ UTR mRNA Một điều đáng ý là, thực vật miRNA ức chế biểu hiện mRNA chủ yếu qua tiêu hủy mRNA, động vật miRNA can thiệp chủ yếu bằng cách ức chế quá trình dịch mã mRNA Độ tương đồng trình tự miRNA với mRNA phức hệ RISC định mRNA bị cắt và tiêu hủy làm bất hoạt quá trình dịch mã mRNA Nếu trình tự miRNA giống hệt với trình tự mRNA, mRNA bị tiêu hủy Nếu trình tự miRNA tính từ đầu 5' cần tối thiểu tương đồng với mRNA từ nucleotid vị trí số đến số chế miRNA kích hoạt, tức là chặn đứng dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích chúng bằng cách cắt mRNA trực tiếp vùng mã hoá Một vài miRNA thực vật được chứng minh là mấu chốt phát triển lá và hoa thông qua gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan Khác với nhân tố phiên mã, miRNA có thể nhắm tới giới hạn phiên mã rộng Biểu hiện chúng chứng tỏ chúng có vai trò quy định phát triển theo hướng đặc hiệu mô phản ứng với giới hạn áp lực môi trường Các kiểu biểu hiện khác và phong phú tiềm gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA có thể điều khiển nhiều quá trình lý sinh và phát triển, có thể giữ vai trò trực tiếp di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác thực vật Hình 1.5 Con đường ức chế gen siRNA miRNA Methyl hoá DNA Con đường làm câm gen thứ ba thực vật có liên quan tới methyl hoá DNA và ức chế phiên mã Bằng chứng cho dạng câm gen này là khám phá thực vật mà gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hoá DNA tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu Gần đây, những phát hiện này được mở rộng bằng việc quan sát methyl hoá DNA thông qua siRNA thực vật được liên kết với biến đổi histone 3.2 Phân tích di truyền chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi - Phân tích di truyền chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi được thực hiện bản tương tự kỹ thuật chuyển gen - Chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi được ứng dụng tạo chuyển gen kháng virus - Theo chế RNAi, mRNA không dịch mã mã tham gia phân hủy RNA ngoại lai ức chế dịch mã, không thể áp dụng phân tích mức độ phiên mã bằng Real time RT-PCR và phân tích sản phẩm dịch mã bằng Western blot - Nét đặc trưng phân tích di truyền chuyển gen kháng virus theo chế RNAi là xác định hàm lượng virus chuyển gen và đánh giá tính kháng virus giữa dòng chuyển gen và đối chứng không chuyển gen B NỘI DUNG TỰ ĐỌC VÀ VIẾT TIỂU LUẬN Ví dụ phân tích chuyển gen (Tóm tắt làm rõ cách tiếp cận phân tích sinh vật chuyển gen) Quá trình tạo chuyển gen đòi hỏi phương tiện hiệu quả để xác định và lựa chọn các tế bào và mô chuyển gen và không phụ thuộc vào hệ thống chuyển gen được sử dụng Gen thị chọn lọc có thể sử dụng gen kháng kháng sinh kháng thuốc diệt cỏ cho phép chọn được các vật liệu biến đổi gen Kháng sinh hygromycin được sử dụng thành công nhân tố chọn lọc và trở thành kháng sinh tiêu chuẩn cho việc chọn lọc các mô chuyển gen đậu tương, đặc biệt là các mô phát sinh phôi và các tế bào nách lá mầm đậu tương Điều này chứng minh hygromycin giúp loại bỏ những mô không mang gen chuyển và làm giảm thời gian nuôi cấy Biện pháp tăng hiệu quả chuyển gen đậu tương qua nách lá mầm được thực hiện bằng cách sử dụng mức tối ưu glufosinate, đồng thời hệ thống được phát triển để chọn lọc tế bào mô phân sinh biến đổi gen từ phôi trục đạt được khả kháng thuốc diệt cỏ imidazolinone bằng cách đưa vào gen đột biến Arabidopsis (csr1-2) Rao và đtg (2009) phát triển thành công hệ thống chọn phôi soma bằng cách sử dụng gen E coli dap A, mà sản phẩm gen này có khả kháng glufosinate, glyphosate, S-(2 aminetyl)-L-cysteine và imidazolinones Hệ thống gen gus (gus, gusA và uidA) mã hóa cho β-glucuronidase lần được phân lập từ E coli và sau phát hiện, nhanh chóng được phát triển thành hệ thống thị cho chuyển gen thực vật Ngày nay, việc sử dụng gen gus chuyển gen thực vật ngày càng rộng rãi, nhất là những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào giống Trên nguyên tắc gen ngoại lai được biến nạp có thể tồn tế bào chủ ba trạng thái: (1) Tạm thời dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dạng thể plasmid độc lập và (3) ổn định đoạn DNA hệ gen tế bào chủ và được nhân lên tế bào chủ Phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng nhằm xác định có mặt, di truyền và biểu hiện gen chuyển tế bào chủ Có thể sử dụng PCR để phân tích chuyển gen, nhiên phương pháp lai Southern blot xác định số bản chuyển gen là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất Gần đây, kỹ thuật thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern blot việc phát hiện số bản chuyển gen là Quantitave real-time PCR (Q-PCR) Q-PCR có thể tiến hành với số lượng cần phân tích nhiều, dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu chi phí và công sức [92] Biểu hiện gen là quá trình hoạt động gen để tạo sản phẩm cuối là protein Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: (1) Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua máy ribosome Để xác định có mặt sản phẩm phiên mã có thể sử dụng kỹ thuật RTPCR, real-time RT-PCR, thực hiện lai Northern blot Đối với các bệnh virus thực vật người ta có thể sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để đánh giá chuyển gen kháng virus thông qua phiên mã để phát hiện và định lượng virus nhiễm bệnh Để đánh giá có mặt protein gen chuyển tạo có thể thực hiện số kỹ thuật khác kỹ thuật lai Western blot, ELISA và các kỹ thuật phát hiện hoạt động protein (hoặc enzyme) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen tạo vaccine thực vật 2.1 Lợi ích và mặt trái của sinh vật chuyển gen Cây chuyển gen (transgenic plant) là mang nhiều gen được chủ động biến nạp vào tế bào chủ bằng các phương pháp khác Việc ứng dụng tạo chuyển gen mang lại những lợi ích rõ rệt, là tăng sản lượng, giảm chi phí sản xuất, tăng lợi nhuận nông nghiệp và cải thiện môi trường Lợi ích những trồng chuyển gen hướng trực tiếp vào người tiêu dùng: lúa gạo giàu vitamin A và sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột, vaccine thực vật, những giống ngô có thể trồng được điều kiện nghèo dinh dưỡng, dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu tương và cải dầu Tuy vậy, bên cạnh những ưu điểm có những vấn đề tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật chuyển gen Đó là: (i) Mối nguy hiểm việc đưa vào tế bào chủ những gen lạ và protein lạ (ii) Khả tạo mang gen biến nạp trồng (iii) Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với các chất độc tiết từ chuyển gen (iv) Nguy những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, có thể làm mất cân bằng sinh thái Kỹ thuật chuyển gen hiện tồn các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tạo trồng chuyển gen kháng các vi khuẩn gây bệnh, trồng chuyển gen kháng virus gây bệnh, trồng chuyển gen kháng côn trùng phá hoại, trồng chuyển gen cải tiến các protein hạt, trồng chuyển gen mang tính bất dục đực, thực vật biến đổi gen để sản xuất các acid béo thiết yếu, trồng chuyển gen làm đất ô nhiễm, làm thức ăn chăn nuôi Dưới giới thiệu hai hướng nghiên cứu ứng dụng hiện được quan tâm, là chuyển gen tạo vaccine thực vật và ứng dụng công nghệ RNAi nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virut 2.2 Vaccine thực vật (Vaccine ăn được, vaccine qua đường miệng) Miễn dịch là khả tự vệ thể bằng thích ứng bảo vệ tự nhiên, khả chủ động thể chống lại bất kỳ vật lạ xâm nhập vào thể Khoa học nghiên cứu miễn dịch nói chung được gọi là Miễn dịch học (Immunology) Nếu nghiên cứu chế tác động phân tử và ảnh hưởng yếu tố di truyền (hệ gen) lên miễn dịch, gọi là miễn dịch học phân tử (molecular immunology) Miễn dịch học là lĩnh vực khoa học đa dạng và rộng lớn, bao gồm: (1) Nghiên cứu các quy luật và chế bảo vệ thể quá trình sống (2) Nghiên cứu tác động hệ thần kinh trung ương việc điều hòa miễn dịch (3) Nghiên cứu các khả đáp ứng miễn dịch, dịch các yếu tố miễn dịch thể đáp ứng theo các loại hình: miễn dịch dịch thể, thể miễn dịch qua trung gian tế bào và miễn dịch thực bào bào Miễn dịch học nghiên cứu ứng dụng các quy luật các phản ứng huyết học, học phản ứng dị ứng học, học phản ứng hoá miễn dịch học, miễn dịch học phân tử, tử phóng xạ miễn dịch học, học di truyền miễn dịch học v.v… để chẩn đoán, phòng chống bệnh và bảo vệ thể thể Miễn dịch học liên quan chặt chẽ với các ngành khoa học khác như: hoá học, học hoá sinh học, sinh lý học, tế bào học, vật lý học, huyết học, phóng xạ học, vi sinh vật học, sinh học phân tử và lượng tử… tử Miễn dịch bao gồm miễn dịch tự nhiên (còn gọi là miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch chủng loại hay miễn dịch có tính chất di truyền) và miễn dịch thu được Miễn dịch tự nhiên là loại có sẵn chủng loại mang tính chất di truyền từ hệ này sang hệ khác, sinh sinh vật được thừa hưởng Trong thực tế, có nhiều bệnh truyền nhiễm động vật mà người không mắc (ví dụ: người không mắc bệnh dịch tả vịt hay không mắc bệnh dịch tả lợn); có nhiều bệnh truyền nhiễm người mà động vật không mắc (ví dụ: động vật không mắc bệnh thương hàn hay bệnh sởi người); có nhiều bệnh mà lứa tuổi này mắc, lứa tuổi khác không mắc (ví dụ: trẻ em dễ bị mắc bệnh bại liệt người lớn không mắc) Miễn dịch thu được là loại miễn dịch không phải tự nhiên mà có, mà là thu được quá trình sống người động vật Miễn dịch này phát sinh những kích thích đặc hiệu (vi sinh vật gây bệnh, những sản phẩm độc chúng) mà qua khỏi tiêm vaccine hay kháng huyết v.v… Miễn dịch này có tính chất đặc dị, tức là thể động vật miễn dịch vi sinh vật gây bệnh nhất định tính cảm thụ vi sinh vật gây bệnh khác Miễn dịch thu được chia làm loại: miễn dịch thu được chủ động và miễn dịch thu được bị động Tiêm chủng là biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn ngừa các bệnh truyền nhiễm Mỗi năm có tỷ liều vaccine được sản xuất và phân phối Nguồn thu từ vaccine tăng gần lần vòng 20 năm qua, đạt 5,4 tỷ USD năm 2000 Như vậy, nhu cầu vaccine để phòng chống các bệnh người hiện là rất lớn, mặt khác, hiện tượng kháng kháng sinh các chủng vi khuẩn, gia tăng đáng báo động các vi sinh vật và tái xuất hiện khiến cho nhu cầu vaccine là ưu tiên số Từ những năm 1990, xuất hiện thuật ngữ "oral vaccine" (vaccine đường miệng) để loại vaccine không cần giữ lạnh, vaccine ăn được có nguồn gốc thực vật (plant edible vaccine) thuộc nhóm này Vaccine ăn được có hoạt tính tương tự vaccine thông thường, khác là vaccine này được thực vật sản xuất những phần ăn được lá, củ, quả và hạt Nỗ lực sản xuất vaccine từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990 Sau đó, nhiều thành công khác vaccine thực vật được công bố nhiều loài khác thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây Số lượng các nghiên cứu vaccine ăn được gia tăng chứng tỏ tính ưu việt thực vật hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dễ dàng không cần giữ lạnh Thuật ngữ "plant edible vaccine" thường xuyên được nhắc đến nhiều hội thảo quốc tế công nghệ sinh học thực vật những năm gần vaccine hệ Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn Vaccine ăn được là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Có thể phân biệt vaccine thuốc và vaccine ăn được sau: (i)Vaccine là thuốc chế phẩm có chứa tác nhân các thành phần tác nhân gây bệnh có khả kích thích đáp ứng miễn dịch để bảo vệ thể tránh khỏi gây bệnh tác nhân (ii) Vaccine ăn được là sản phẩm gây đáp ứng miễn dịch để bảo vệ thể tránh được gây bệnh Vaccine có thể đưa vào thể qua đường tiêm, đường miệng và dạng sol khí Ngoài ra, vaccine ăn được là vaccine tiểu phần bao gồm nhiều chuỗi polypeptide protein kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh Vaccine ăn được là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Vaccine ăn được nguồn gốc thực vật có hoạt tính tương tự vaccine thông thường Khác với vaccine thường là vaccine ăn được thực vật sản xuất những phần ăn được lá, củ, quả và hạt Người ta chọn lọc những gen mã hoá cho các thành phần này, đưa vào vector, dựa vào hệ thống di truyền thực vật để khuếch đại gen và biểu hiện thành các kháng nguyên protein mong muốn Cụm từ "ăn được" đề cập đến chấp nhận thể, tức là vaccine này bền vững dịch tiêu hoá, qua đường tiêu hoá mà không bị phân huỷ Các thực vật ăn được có thể dùng để sản xuất kháng nguyên này là khoai tây, cà chua, chuối, rau diếp, gạo, lúa mì, đậu tương và ngô Để sản xuất vaccine ăn được người ta ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và công việc là thiết kế vector chuyển gen Điểm quan trọng nhất thiết kế vector biểu hiện là promoter, phải là promoter khoẻ, có ái lực mạnh với RNA - polymerase vật chủ và hoạt động promoter được điều hoà cách dễ dàng Trong sản xuất vaccine ăn được, người ta thiết kế vector gồm hai gen: gen mã hoá cho kháng nguyên virus và gen kháng sinh Chuyển gen vào nhân là phương pháp chuyển gen ổn định gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể thực vật được ứng dụng phổ biến sản xuất protein đầy đủ chức Quy trình sản xuất vaccine thực vật gồm bước sau: Thiết kế vector chứa gen quan tâm Chuyển vector vào vi khuẩn Agrobacterium Chuyển gen quan tâm vào tế bào thực vật Phân tích biểu hiện gen Kiểm tra khả miễn dịch động vật Tinh và sản xuất Vaccine ăn được có số đặc điểm chủ yếu sau: (1) Vaccin thực vật được chính mô và thành tế bào thực vật bao bọc, hạn chế được phá hủy và ổn định, bền vững thể; (2) Dễ sử dụng, đưa vào thể theo đường tiêu hóa; Vaccin này có thể ăn tươi (quả, lá) nấu chín (hạt, củ); (3) Dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng chuyển gen có khả sản xuất kháng nguyên, giá thành thấp; (4) Tính ổn định cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và kinh tế cao; (5) Độ an toàn cao, ít bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh động vật và người; (6) Có thể không cần tinh các loại vacxin khác Thành tựu ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng virus Bệnh virus thực vật thường gây hại nghiêm trọng đến suất, chất lượng trồng và rất khó phòng trị Virus gây bệnh thực vật rất đa dạng chủng loại, chủ yếu là virus RNA (SMV, BYMV, Tobaco mosaic virus - TMV, ), và cả loại virus DNA (Tomato yellow leaf curl virus - TYLCV, Cauliflower mosaic virus - CMV) Các virus này thường có phổ gây bệnh rộng, có loài gây hại tới 900 loài thực vật khác với những biểu hiện bệnh phức tạp, khó nhận biết [26] Biện pháp sử dụng hiện để phòng các bệnh virus trồng là sử dụng giống kháng bệnh Phương pháp chọn giống truyền thống có số thành công việc đánh giá, tuyển chọn các giống trồng kháng virus cung cấp cho sản xuất, số lượng giống kháng bệnh virus rất ít và hiệu quả kháng bệnh không cao Với biện pháp sử dụng nguồn gen chính virus gây bệnh và chuyển vào trồng, các nhà khoa học thành công việc tạo trồng chuyển gen kháng virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã - RNAi RNAi là hiện tượng phổ biến xảy sinh vật nhân thực và đóng vai trò quan trọng nhiều quá trình sinh học điều hoà phát triển, tái cấu trúc nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus Gần đây, RNAi được xem là kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh virus gây thực vật Năm 2004, Baulcombe công bố chế hoạt động siRNA và coi là chế quan trọng việc kháng lại virus thực vật Nguyễn Thị Hải Yến (2012) sử dụng kỹ thuật RNAi bước đầu thành công việc tạo cà chua chuyển gen kháng virus khảm vàng lá cà chua Các bước chính ứng dụng kỹ thuật RNAi để tạo chuyển gen bao gồm: (1) Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) Biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi vào thông qua vi khuẩn A tumefaciens làm bất hoạt các mRNA virus gây bệnh, (3) Sàng lọc các chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus các chuyển gen Để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi kỹ thuật chuyển gen kháng virus, công việc là việc thu thập và kiểm tra mẫu nhiễm virus từ các vùng sinh thái khác Kiểm tra có mặt virus từ các mẫu thu được bằng phương pháp sinh học phân tử Bước tiến hành phân lập gen số vùng gen khác hệ gen virus sở thu thập thông tin genome virus, đặc biệt những thông tin gen CP và số gen hệ gen virus, thiết kế các cặp mồi để nhân gen CP và số gen khác, tách dòng và xác định trình tự nucleotide gen đích Trên sở phân tích so sánh trình tự gen các dòng virus, chọn vùng bảo thủ để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi để chuyển vào đối tượng thực vật Phân tích chuyển gen và đánh giá tính kháng các dòng chuyển gen, tuyển chọn dòng chuyển gen kháng bệnh virus gây bệnh Ngoài ứng dụng tạo chuyển gen kháng virus, kỹ thuật RNAi có thể giúp cho việc nghiên cứu chức gen hệ gen thực vật Điều này mở triển vọng sử dụng các thư viện siRNA để nhận biết và phân tích biểu hiện hàng loạt các gen liên quan đến các bệnh thực vật Thư viện các nhân tố RNAi có thể được xem là công cụ hữu hiệu để phân tích chức hệ gen trồng Xây dựng thư viện RNAi tất cả các bệnh virus đối tượng trồng cụ thể góp phần phục vụ cho việc sàng lọc các biểu hiện bệnh virus Ứng dụng công nghệ RNAi việc tạo chuyển gen kháng virus là lĩnh vực rất mẻ và được cả giới quan tâm Việc tạo chuyển gen kháng virus mở triển vọng tạo thực phẩm và an toàn cho môi trường Tính hiệu quả kỹ thuật RNAi việc tạo trồng chuyển gen mã hoá protein virus (CP, Rep ) có khả kháng lại chính virus được chứng minh bằng thực tế Nhiều giống trồng kháng virus được tạo bằng kỹ thuật này Trong những nghiên cứu đó, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào và được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) chuyển gen từ kích thích chế RNAi hoạt động có xâm nhập virus vào Người ta nhận thấy rằng, vùng đệm hpRNA được lặp lại với trình tự intron (ihpRNA) kết quả ihpRNA tạo câm gen là cao nhất Năm 2007, Shinichiro và đtg công bố kết quả tạo được số dòng thuốc lá chuyển gen CP cấu trúc ihpRNA có khả kháng virus cao đến hệ T2 (12/14 số kiểm tra) và những siRNA được phát hiện những dòng chuyển gen này Nhìn chung, hầu hết các chuyển gen làm chậm tích lũy virus làm giảm nhẹ các triệu chứng bệnh Cũng vào năm này, Bonfim và đtg tạo được dòng đậu tương chuyển gen kháng virus Bean golden mosaic virus với tính kháng lên đến 93% Furutani và đtg (2007) thành công tạo đậu tương biến đổi gen kháng SMV bằng kỹ thuật RNAi Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus được bắt đầu Sự kết hợp kỹ thuật chuyển gen và RNAi là biện pháp công nghệ sinh học có hiệu quả việc cải thiện và tăng cường khả kháng virus trồng Việc phân lập các gen thành phần virus làm vật liệu cho thiết kế vector chuyển gen để chuyển vào thực vật tạo chuyển gen kháng virus Việt Nam là rất cần thiết Chu Hoàng Hà và đtg (2004) phân tích tính đa dạng sở so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam Tiếp đến là nghiên cứu đa dạng trình tự gen CP virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, virus gây bệnh đốm đu đủ, virus Y khoai tây Nhóm nghiên cứu Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà thuộc Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là những đơn vị đầu và thành công việc ứng dụng công nghệ RNAi để tạo trồng kháng virus và số dòng chuyển gen kháng virus được tạo bằng kỹ thuật này Thành công có thể kể đến là thuốc lá chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus (CMV) và Tobacco mosaic virus (TMV) Những dòng thuốc lá chuyển đoạn gen ghép nối mang đồng thời gen CP CMVvà TMV cho thấy hiệu quả kháng lên tới 60% hai chủng virus này Các biểu hiện khả kháng cao sau lần lây nhiễm đồng thời hai chủng virus cho thấy khả kháng bệnh được trì cho hệ sau Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng bệnh virus, các tác giả phát triển thành công cấu trúc RNAi, tạo được vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen K326 mang cấu trúc RNAi có khả kháng virus Cucumber mosaic virus cao Tiếp đến là nghiên cứu đu đủ kháng bệnh đốm vòng Papaya ringspot virus Kết quả ban đầu cho thấy, số 45 dòng đu đủ chuyển gen được chọn tạo, có 34/45 dòng có khả kháng hoàn toàn với virus đốm vòng Dù trồng môi trường nhiễm bệnh các đu đủ chuyển gen phát triển mạnh, cho quả đều, đẹp, suất cao Nguyễn Thị Hải Yến và đtg (2009, 2011) thiết kế cấu trúc RNAi và tạo được dòng cà chua kháng Tomato yellow leaf curl Vietnam virus bằng kỹ thuật RNAi Tuy nhiên, các nhóm tác giả cho thấy, tỷ lệ kháng bệnh các dòng chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được lựa chọn để thiết kế vector chuyển gen Cấu trúc vector chứa nhiều gen quan trọng Tomato yellow leaf curl Vietnam virus có khả kháng cao cấu trúc vector chứa đơn gen virus [24], [25], [26] Điều này phụ thuộc vào số gen virus có khả ức chế đường hoạt động RNAi Ngoài số loại trồng khác được tiến hành nghiên cứu chuyển gen để tạo dòng kháng bệnh virus đậu tương, cam, quýt, dưa hấu… CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP Hoàn thành tiểu luận nhỏ sau đây: Làm rõ khái niệm chuyển gen và cách tiếp cận phân tích sinh vật chuyển gen Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen tạo vaccine thực vật Ứng dụng kỹ thuật RNAi nghiên cứu tạo chuyển gen khang virus ... phân lập gen số vùng gen khác hệ gen virus sở thu thập thông tin genome virus, đặc biệt những thông tin gen CP và số gen hệ gen virus, thiết kế các cặp mồi để nhân gen CP và số gen khác,... người ta thiết kế vector gồm hai gen: gen mã hoá cho kháng nguyên virus và gen kháng sinh Chuyển gen vào nhân là phương pháp chuyển gen ổn định gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể... định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm: Tiến hành phân lập gen và tách dòng gen để xác định đặc điểm cấu trúc gen (2) Thiết kế vector chuyển gen: Lựa chọn vector chuyển gen và