Kỹ thuật chuyển gen và ứng dụng

Chương 4 PHÂN TÍCH DI TRUYỀN SINH VẬT CHUYỂN GEN Mục tiêu - Giải thích được bản chất khái niệm chuyển gen, gen chuyển và sinh vật chuyển gen; - Tiếp cận và nắm được n

Chương 4 PHÂN TÍCH DI TRUYỀN SINH VẬT CHUYỂN GEN

Mục tiêu

- Giải thích được bản chất khái niệm chuyển gen, gen chuyển và sinh vật chuyển gen;

- Tiếp cận và nắm được nguyên lý phân tích sinh vật chuyển gen, cụ thể là: (i) Phân tích

sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp PCR, Southern blot; (ii) Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển thông qua phiên mã bằng phương pháp RT-PCR, Northern blot, Real time RT-PCR; (iii) Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển thông qua sản phẩm dịch

mã bằng phân tích điện di, Western blot, ELISA; (iv) Phân tích sự biểu hiện đặc tính sinh học của gen chuyển

- Giải thích được nguyên lý của kỹ thuật RNAi và phân tích di truyền trong kỹ thuật RNAi Hiểu được những ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus

Phương pháp: Nghe giảng do Giảng viên trình bày

Yêu cầu: Đọc trước tài liệu, ghi chép và hoàn thành bài tập, viết báo cáo nhỏ.

Đánh giá: Điểm chuyên cần, mức độ hoàn thành báo cáo.

Tài liệu học tập

1 Chu Hoàng Mậu (2008) Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống

cây trồng Nxb Đại học Thái Nguyên.

A NỘI DUNG GIẢNG TRÊN LỚP

1 Chuyển gen

1.1 Khái niệm chuyển gen (transgensis)

(i) Chuyển gen là kỹ thuật đưa một đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen (genome) của một

cơ thể đa bào Đoạn DNA ngoại lai (gen chuyển) sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được

di truyền lại cho thế hệ sau

(ii) Gen chuyển phải được hợp nhất vào hệ gen (genome) của tế bào chủ được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế sửa sai DNA của tế bào Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen diễn ra theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng hoặc không tương đồng (iii) Gen chuyển được biểu hiện trong tế bào chủ thông qua phiên mã tạo mRNA, dịch

mã tạo protein;

(iv) Tế bào chủ là tế bào động vật, thực vật tái sinh thành cơ thể chuyển gen, do vậy khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và động vật Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell)

Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gen therapy) Có trường hợp các tế bào mầm không mang DNA ngoại lai Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gen therapy) cũng được sử dụng Các tế bào mầm này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho thế hệ sau

Thuật ngữ GMO (Gentically modified organism) -Sinh vật biến đổi gen, được sử

dụng chủ yếu để chỉ các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm

Ðộng vật, thực vật chuyển gen là động vật, thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA hệ gen của nó Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào sinh sản

Nếu dòng tế bào sinh sản bị biến đổi (chứa gen chuyển), tính trạng do gen chuyển xác định sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp thông qua sinh sản

Nếu chỉ có dòng tế bào sinh dưỡng chứa gen chuyển thì chỉ có cơ thể mang các tế bào sinh dưỡng đó bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho thế hệ sau Như vậy, việc chuyển gen ngoại lai vào động vật, thực vật chỉ thành công khi các gen này di truyền và biểu hiện ở các thế hệ sau

Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động vật, thực vật chuyển gen là đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào động vật, thực vật do con người chủ động tạo ra Các gen ngoại lai này phải được di truyền thông qua dòng tế bào sinh sản và vì vậy mọi tế bào kể các tế bào mầm sinh sản của động vật, thực vật đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi như nhau

(v) Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen (genome) của tế bào chủ được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế sửa sai DNA của tế bào Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome diễn ra theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng và không tương đồng

1.2 Vector chuyển gen

Vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào

sự sao chép của hệ gen tế bào chủ

Vector có các ứng dụng chủ yếu sau đây:

- Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một trình tự DNA xác định

- Tạo sinh vật chuyển gen (chuyển các gen vào tế bào hay cơ thể)

- Sản xuất ARN với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng

- Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng

Đặc tính cần có của một vector:

- Vector có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào vật chủ Độc lập với sự sao chép của bộ gen vật chủ

- Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt

- Vector phải được phát hiện rõ ràng trong vật chủ

- Phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ.

- Vector chỉ tồn tại một vị trí nhận biết cho mỗi enzyme giới hạn Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzyme giới hạn và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác nhờ enzyme ligase

Vector được sử dụng với mục đích tách dòng gen (vector tách dòng), sử dụng với mục đích biểu hiện gen (Vector biểu hiện) và mục đích chuyển gen (vector chuyển gen) Một số loại vector đặc biệt khác dùng trong kỹ thuật chuyển gen như: Ti plasmid; Re plasmid; YACs; BACs; Retrovirus; Baculovirus; Yeast 2 micron plasmid

1.3 Chuyển gen ở thực vật

1.3.1 Vector chuyển gen ở thực vật

Một gen muốn biểu hiện được phải có đầy đủ các thành phần sau: (1) Vùng điều khiển (promotor), (2) Gen cấu trúc mang các codon khởi động (start codon) và codon ngừng (stop codon), (3) Đoạn DNA kết thúc (transcription terminator)

Trong chuyển gen ở thực vật hiện nay người ta thường sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium, nhờ Ti-plasmid Vi khuẩn Agrobacterium gây ra các khối u ở thực vật Agrobacterium tumefaciens và A rhizogens là hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra

bệnh khối u hình chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn, và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh, mà bình thường là cần thiết để xúc tiến

sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro

Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30oC Trong khi hình thành

khối u, T-DNA được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-DNA

ổn định trong genome nhân T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u tạo ra nhiều mARN polyadenyl

1.3.2 Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

Các khâu chính trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật hiện nay:

(1) Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm: Tiến hành phân lập gen và tách

dòng gen để xác định đặc điểm cấu trúc của gen

(2) Thiết kế vector chuyển gen: Lựa chọn vector chuyển gen và phương pháp chuyển

gen thích hợp Tạo vector tái tổ hợp

(3) Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây mô hình và cây chủ chuyển gen.

(4) Biến nạp vector tái tổ hợp mang gen chuyển vào mô cây mô hình Tái sinh cây biến nạp và phân tích cây mô hình chuyển gen

(5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào mô cây đích Tái sinh cây biến nạp Phân tích cây chuyển gen và đánh giá mức độ biểu hiện chức năng sinh học của cây chuyển gen

2 Phân tích sinh vật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải được biểu hiện, và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu hiện được chức năng sinh học

Phân tích sinh vật chuyển gen là quá trình chọn lọc, phân tích sinh vật chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực hiện bằng (1) Hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, (2) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cơ thể chủ; (3) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA, protein; và (4) Phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển

Có thể mô tả khái quát các thí nghiệm phân tích sinh vật chuyển gen ở sơ đồ hình dưới đây:

Sơ đồ phương pháp phân tích sinh vật chuyển gen

(1) Chọn lọc các thể biến nạp trong môi trường nuôi cấy in vitro bằng các chất chọn lọc, ví dụ: chất diệt cỏ, chất kháng sinh

(2) Sử dụng kỹ thuật PCR, Southern blot vào việc phân tích sự có mặt của gen chuyển: i) Cở sở của việc phân tích sự có mặt của gen chuyển: i) Gen chuyển được biến nạp vào

mô tế bào chủ, mô tế bào tái sinh thành cơ thể; ii) gen chuyển hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; ii) PCR xác định được sự có mặt cuiar gen chuyển trong sinh vật chuyển gen; iii) Lai Southern xác định được số bản copy của gen chuyển trong sinh vật chuyển gen;

(3) Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển thông qua phiên mã: i) RT-PCR xác định định tính sự phiên mã của gen chuyển; ii) Lai Northern blot cho phép xác định trực tiếp sự có mặt các phân tử mRNA sản phẩm phiên mã của gen chuyển; iii) Real time RT-PCR đánh giá mức độ phiên mã của gen chuyển

(4) Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển thông qua sản phẩm dịch mã: i) Điện di protein cho phép dự đoán xuất hiện protein tái tổ hợp, sản phẩm của gen chuyển; ii) Lai western cho phép khẳng định sản phẩm dịch mã của gen chuyển

(5) Phân tích sự biểu hiện đặc tính sinh học của gen chuyển: Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển trong điều kiện nhân tạo, thử nghiệm trên vật liệu thí nghiệm;

3 Nguyên lý của kỹ thuật RNAi và phân tích di truyền trong kỹ thuật RNAi

3.1 Nguyên lý của kỹ thuật RNAi

RNAi là cơ chế làm ức chế gen có thể phát hiện thấy ở giới nấm, thực vật và động vật Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện

sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tương đồng với gen đích

RNAi là một quá trình sinh học trong đó các phân tử RNA ức chế biểu hiện gen bằng cách phân hủy các phân tử mRNA Hiện tượng này được quan sát lần đầu tiên vào

năm 1928 trên những cây thuốc lá kháng bệnh đốm vòng do Tobacco ring spot virus gây

ra sau lần lây nhiễm thứ hai Năm 1986 khi nghiên cứu các cây chuyển gen Ecker và Davis nhận thấy có sự biểu hiện ức chế phiên mã nhờ RNA ''chiều đối mã'' (antisense

RNA) Tuy nhiên vào những năm 90 của thế kỷ XX các nhà sinh học phân tử gặp khó

khăn trong việc giải thích kết quả nghiên cứu mãi cho tới khi Fire và Mello khám phá ra

cơ chế can thiệp RNAi - nghiên cứu này giúp họ giành Giải Nobel Y học năm 2006 Fire

và Mello cho rằng RNA mạch kép có thể làm các gen ngừng hoạt động Cơ chế RNAi hữu hiệu đối với gen mà trình tự của nó bổ sung với những vị trí của phân tử RNA đích

i) Con đường ức chế gen bởi RNAi

Ở thực vật có ba con đường ức chế gen bởi RNAi Con đường thứ nhất là sự ức chế gen sau phiên mã (post-transcriptional gen silencing-PTGS) qua trung gian là siRNA (short interfering RNA) Con đường thứ hai là hiện tượng tạo ra các miRNA (micro-RNA) trong điều chỉnh biểu hiện gen của tế bào (Hình 2)

Con đường thứ ba là sự câm gen phiên mã (transcriptional gene silencing - TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, nó bao gồm

sự methyl hóa histone và DNA

Các thành phần quan trọng tham gia vào cơ chế RNAi là những RNA ức chế nhỏ siRNA hay miRNA, các enzyme Dicer, Doshar và Argonaute trong phức hệ RISC

Hình 2 Mô phỏng các con đường làm câm gen thông qua RNAi

AGO: Argonaute); dsRNA: double-stranded RNA; PTGS: posttranscriptional gene silencing; RDR: RNA dependent RNA polymerase; RISC: RNA-induced silencing complex; RITS: RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing; siRNA: short interfering RNA; miRNA: miro-RNA; TGS: transcriptional gene silencing

ii) Sự ức chế gen sau phiên mã thông qua siRNA

siRNA được tạo thành do sự phân cắt các dsRNA bởi Dicer, đây là phần tử mấu chốt của cơ chế làm câm gen của RNAi Cấu trúc nguyên vẹn của phân tử siRNA rất quan trọng cho tính đặc hiệu của quá trình RNAi Hai mạch của sợi kép siRNA khác nhau về độ bền với nhiệt độ cuối cùng, một thuộc tính để nhận biết sợi đơn cần thiết trong siRNA sẽ đi vào phức hệ RISC Sự giãn xoắn của siRNA tạo ra sợi dẫn đầu (guide strand) sẽ đi vào phức hệ RISC và liên kết với mRNA đích đặc hiệu bởi sự bổ sung trình

tự tương đồng Sợi còn lại được gọi là “sợi chờ” (passenger strand) và sẽ bị phân hủy sau đó Do đó sợi dẫn đầu siRNA phải tương tác với một số protein liên quan trong quá trình RNAi từ khi được tạo ra cho đến lúc nhận biết mRNA đích

Đoạn siRNA được tạo thành dài khoảng 21 – 25 nucleotide mang nhóm 5’-PO4 và 3’-OH với 2 nucleotide ở đầu 3’ Sợi sense của mạch kép siRNA dễ bị thay đổi hóa tính hơn là sợi antisense, sự thay đổi diễn ra ở giữa và ở phía đầu 3’ của siRNA có ảnh hưởng chặt chẽ tới tính đặc hiệu của RNAi hơn là những thay đổi ở đầu 5’

Nhiều nghiên cứu cho thấy là sợi đối mã có hoạt động quan trọng trong phức hợp sense và RNA đích Các nucleotide ở đầu 3’ cũng có ý nghĩa trong quá trình xử lý RNAi Khi tăng hoặc giảm số nucleotide đầu 3’ sẽ làm giảm hiệu quả khởi động quá trình Khi tiến hành thử thay thế nhóm 5’-PO4 bằng một nhóm chất lớn hơn như 2’-O-methyl thì kết quả ảnh hưởng nghiêm trọng đến sợi kép siRNA khởi đầu cho chuỗi phản ứng RNAi trong cơ thể Phát hiện này và một số quan sát khác đã làm rõ chức năng quan trọng của nhóm 5’-PO4 Sự có mặt của 5’-PO4 làm ổn định phức hệ RISC và rất quan trọng cho sự xác định bắt cặp chính xác của RISC và phân cắt đúng vị trí trên RNA đích Nếu vắng mặt nhóm 5’-PO4, siRNA sẽ trượt dài theo phức hệ RISC Nhóm 5’-PO4

có thể được tách ra khi quá trình phân cắt đang thực hiện trên RNA đích Một đoạn siRNA sợi kép nếu thiếu cả hai hoặc một nhóm 5’-PO4 sẽ không thể khởi đầu chuỗi

RNAi trong tế bào Sự có mặt của nhóm 3’-OH cũng quan trọng nhưng không thật sự cần thiết bởi sự thay đổi diễn ra ở đầu này không gây ảnh hưởng nhiều đến quá trình RNAi

Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy ra ở tương bào và là con đường quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus Trong trường hợp là virus DNA thực vật, dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối nhau Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tương bào, Dicer - một loại ribonuclease đặc hiệu cho dsRNA lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotid, gọi là siRNA có tiêu hao một phân tử ATP siRNA tạo ra là những sợi đôi có chứa nhóm phosphat ở tận cùng đầu 5’ Sau khi bị cắt ngắn bởi dicer, chuỗi kép siRNA được tách

ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA xảy ra trong phức hệ RISC, trong đó có chứa Argounaute và Helicase Phân tử ATP phân tách siRNA sợi đôi để tạo thuận lợi cho RISC hoạt động, phức hệ RISC sau

đó nhận biết các phân tử phiên mã mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base bổ sung với trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3’ Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNase

iii) Sự ức chế RNA thông qua miRNA

Ngay sau khi phát hiện ra cơ chế RNAi, người ta nhanh chóng nhận ra rằng, cơ chế này đã tồn tại trong tế bào bởi một hệ thống điều hòa biểu hiện gen gọi là micro-RNA (mimicro-RNA)

Sự khác biệt quan trọng giữa miRNA và siRNA trước hết là nguồn gốc của chúng, miRNA bắt nguồn từ các locus hệ gen trong khi siRNA thường bắt nguồn từ mRNA, transposon hoặc virus Thứ hai, miRNA được chế biến từ phiên mã có thể tạo cấu trúc kẹp tóc RNA trong khi siRNA được chế biến từ RNA sợi đôi dài hoặc dạng kẹp tóc kéo dài Thứ ba, sợi đôi miRNA/miRNA* được tạo ra từ tiền phân tử kẹp tóc miRNA, dẫn tới tích luỹ nhiều miRNA khác nhau từ các sợi dsRNA dài này Thứ tư, trình tự miRNA tương đối bảo thủ ở những sinh vật có quan hệ gần gũi, trong khi siRNA nội sinh hiếm khi bảo thủ Những sự khác nhau này là cơ sở thực tế để phân biệt và chú giải những siRNA nội sinh và miRNA mới khám phá

miRNA là một loại RNA nhỏ dài 21-24 nucleotide không mã hóa có chức năng chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã vì cặp bazơ có trình tự bổ sung gần như hoàn toàn với mRNA đích Cơ chế miRNA có nhiều điểm tương đồng với cơ chế siRNA Trong tế bào sinh vật, khi những phân tử miRNA đầu tiên (gọi là pre-miRNAs) được tạo

ra trong nhân qua quá trình phiên mã từ gen, pre-miRNAs được cắt gọt bởi một enzyme

có trong nhân gọi là drosha để tạo thành những sợi pre-miRNAs Các pre-miRNAs sau

đó được di chuyển ra ngoài bào tương và tương tác với enzyme dicer tạo thành miRNA rồi kế tiếp là phức hệ RISC như trình bày ở trên Ở thực vật, miRNA được tạo thành nhờ

dicer và phần lớn chỉ xảy ra ở nhân, và có một protein liên kết dsRNA đặc hiệu là HYL1 miRNA động vật thường liên kết với vùng 3’ không dịch mã (untranslated region, UTR) của mRNA, trong khi miRNA thực vật có gắn kết với trình tự mã hóa và thậm chí vùng 5’ UTR của mRNA Một điều đáng chú ý là, ở thực vật miRNA ức chế biểu hiện mRNA chủ yếu qua sự tiêu hủy mRNA, trong khi đó ở động vật miRNA can thiệp chủ yếu bằng cách ức chế quá trình dịch mã của mRNA Độ tương đồng trong trình tự của miRNA với mRNA trong phức hệ RISC sẽ quyết định mRNA sẽ bị cắt và tiêu hủy làm bất hoạt quá trình dịch mã của mRNA Nếu trình tự của miRNA giống hệt với trình tự của mRNA, mRNA sẽ bị tiêu hủy Nếu trình tự của miRNA tính từ đầu 5' chỉ cần tối thiểu tương đồng với mRNA từ nucleotid vị trí số 2 đến số 8 thì cơ chế miRNA

sẽ kích hoạt, tức là chỉ chặn đứng sự dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA

Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích của chúng bằng cách cắt mRNA trực tiếp

ở vùng mã hoá Một vài miRNA thực vật được chứng minh là mấu chốt trong sự phát triển lá và ra hoa thông qua gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan Khác với nhân tố phiên

mã, miRNA có thể nhắm tới một giới hạn phiên mã rộng Biểu hiện của chúng đã chứng tỏ chúng có vai trò quy định sự phát triển theo hướng đặc hiệu mô hoặc phản ứng với một giới hạn áp lực môi trường Các kiểu biểu hiện khác nhau và sự phong phú tiềm năng gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA có thể điều khiển nhiều quá trình lý sinh và phát triển, có thể giữ vai trò trực tiếp trong sự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ở thực vật

Hình 1.5 Con đường ức chế gen của siRNA và miRNA

Methyl hoá DNA

Con đường làm câm gen thứ ba ở thực vật có liên quan tới sự methyl hoá DNA và sự ức chế phiên mã Bằng chứng đầu tiên cho dạng câm gen này là khám phá trên thực vật mà gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hoá DNA tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu Gần đây, những phát hiện này đã được mở rộng bằng việc quan sát

sự methyl hoá DNA thông qua siRNA trên thực vật được liên kết với biến đổi histone

3.2 Phân tích di truyền trong chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi

- Phân tích di truyền trong chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi được thực hiện cơ

bản tương tự như ở kỹ thuật chuyển gen

- Chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi được ứng dụng trong tạo cây chuyển gen kháng virus

- Theo cơ chế RNAi, mRNA không dịch mã mã tham gia phân hủy RNA ngoại lai hoặc

ức chế dịch mã, cho nên không thể áp dụng phân tích mức độ phiên mã bằng Real time RT-PCR và phân tích sản phẩm dịch mã bằng Western blot

- Nét đặc trưng trong phân tích di truyền trong chuyển gen kháng virus theo cơ chế RNAi là xác định hàm lượng virus trong cây chuyển gen và đánh giá tính kháng virus giữa dòng cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen

B NỘI DUNG TỰ ĐỌC VÀ VIẾT TIỂU LUẬN

1 Ví dụ về phân tích cây chuyển gen (Tóm tắt làm rõ cách tiếp cận phân tích sinh vật chuyển gen)

Quá trình tạo cây chuyển gen đòi hỏi một phương tiện hiệu quả để xác định và lựa chọn các tế bào và mô chuyển gen và không phụ thuộc vào hệ thống chuyển gen được sử dụng Gen chỉ thị chọn lọc có thể sử dụng gen kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc diệt cỏ sẽ cho phép chọn được các vật liệu biến đổi gen Kháng sinh hygromycin

đã được sử dụng thành công như một nhân tố chọn lọc và trở thành kháng sinh tiêu chuẩn cho việc chọn lọc các mô chuyển gen ở đậu tương, đặc biệt là các mô phát sinh phôi và các tế bào của nách lá mầm đậu tương Điều này đã chứng minh hygromycin giúp loại bỏ những mô không mang gen chuyển và làm giảm thời gian nuôi cấy

Biện pháp tăng hiệu quả chuyển gen ở cây đậu tương qua nách lá mầm được thực hiện bằng cách sử dụng mức tối ưu glufosinate, đồng thời một hệ thống mới cũng được phát triển để chọn lọc tế bào mô phân sinh biến đổi gen từ phôi trục đạt được khả năng kháng thuốc diệt cỏ imidazolinone bằng cách đưa vào một gen đột biến của cây

Arabidopsis (csr1-2) Rao và đtg (2009) đã phát triển thành công một hệ thống chọn phôi soma bằng cách sử dụng gen E coli dap A, mà sản phẩm của gen này có khả năng

kháng glufosinate, glyphosate, S-(2 aminetyl)-L-cysteine và imidazolinones

Hệ thống gen gus (gus, gusA và uidA) mã hóa cho β-glucuronidase lần đầu tiên được phân lập từ E coli và ngay sau khi phát hiện, nó nhanh chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho chuyển gen ở thực vật Ngày nay, việc sử dụng gen gus trong

chuyển gen thực vật ngày càng rộng rãi, nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một giống cây mới

Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp có thể tồn tại trong tế bào chủ ở

ba trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạng một thể plasmid độc lập và (3) ổn định như một đoạn DNA của hệ gen tế bào chủ và được nhân lên trong

tế bào chủ Phương pháp sinh học phân tử đã được ứng dụng nhằm xác định sự có mặt,

sự di truyền và sự biểu hiện của gen chuyển trong tế bào chủ Có thể sử dụng PCR để phân tích cây chuyển gen, tuy nhiên phương pháp lai Southern blot xác định số bản sao trong cây chuyển gen là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất Gần đây, một kỹ thuật

thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern blot trong việc phát hiện số bản sao trong cây

chuyển gen là Quantitave real-time PCR (Q-PCR) Q-PCR có thể tiến hành với số lượng

cây cần phân tích nhiều, do dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu chi phí và công sức [92]

Biểu hiện gen là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: (1) Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome Để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR, real-time RT-RT-PCR, thực hiện lai Northern blot Đối với các bệnh do virus ở thực vật người ta có thể sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để đánh giá cây chuyển gen kháng virus thông qua phiên mã để phát hiện và định lượng virus trên cây nhiễm bệnh Để đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lai Western blot, ELISA và các kỹ thuật phát hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme)

2 Ứng dụng của kỹ thuật chuyển gen trong tạo vaccine thực vật

2.1 Lợi ích và mặt trái của sinh vật chuyển gen

Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây mang một hoặc nhiều gen được chủ động biến nạp vào tế bào chủ bằng các phương pháp khác nhau Việc ứng dụng tạo cây chuyển gen mang lại những lợi ích rõ rệt, đó là tăng sản lượng, giảm chi phí sản xuất, tăng lợi nhuận nông nghiệp và cải thiện môi trường Lợi ích của những cây trồng chuyển gen hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng: lúa gạo giàu vitamin A và sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột, vaccine thực vật, những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu tương và cải dầu Tuy vậy, bên cạnh những ưu điểm cũng có những vấn đề tiềm ẩn trong việc phát triển kỹ thuật chuyển gen Đó là: (i) Mối nguy hiểm trong việc đưa vào tế bào chủ những gen lạ và protein lạ (ii) Khả năng tạo cây mang gen biến nạp trong cây trồng (iii) Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen (iv) Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế

có thể làm mất cân bằng sinh thái

Kỹ thuật chuyển gen hiện nay đang tồn tại các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tạo cây trồng chuyển gen kháng các vi khuẩn gây bệnh, cây trồng chuyển gen kháng virus gây bệnh, cây trồng chuyển gen kháng côn trùng phá hoại, cây trồng chuyển gen cải tiến các protein hạt, cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực, thực vật biến đổi gen để sản xuất các acid béo thiết yếu, cây trồng chuyển gen làm sạch đất ô nhiễm, làm thức ăn chăn nuôi Dưới đây giới thiệu hai hướng nghiên cứu ứng dụng hiện nay đang được quan tâm, đó là chuyển gen tạo vaccine thực vật và ứng dụng công nghệ RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virut

2.2 Vaccine thực vật (Vaccine ăn được, vaccine qua đường miệng)

Miễn dịch là khả năng tự vệ của cơ thể bằng sự thích ứng bảo vệ tự nhiên, cũng như khả năng chủ động

năng chủ động của cơ thể chống lại bất kỳ một vật lạ xâm nhập vào cơ thể một vật lạ Khoa học nghiên cứu về miễn dịch nói chung được gọi là Miễn dịch học (Immunology) Nếu