Khảo sát tỷ lệ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong sản phẩm kem có chứa sữa tại trung tâm quatest3 theo tiêu chuẩn 462007qđ BYT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: " KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ CHỨA SỮA TẠI TRUNG TÂM QUATEST3 THEO TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT " KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD:ThS NGUYỄN VĂN MINH ThS TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT SVTH: LÂM VĂN THẮNG MSSV: 1153010771 Khóa: 2011-2015 Bình Dƣơng, ngày 26 tháng 05 năm 2015 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm môn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường Thầy Nguyễn Văn Minh hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em nhiều cho em lời khuyên quý giá để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi đến thầy lời cảm ơn chân thành Em xin cảm ơn chị Trần Thị Ánh Nguyệt tạo điều kiện để em tiếp xúc với môi trường làm việc thực tế, giúp em có nhìn toàn diện ngành Công nghệ sinh học nói chung ngành Kiểm nghiệm vi sinh vật nói riêng, qua thấy phẩm chất có có Kiểm nghiệm viên trung thực cẩn thận, đặc biệt không ngừng học hỏi Em cám ơn chị nhiều Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Ái Lâm, cô Phương Dung, chị Thu Hồng, anh Thanh, chị Diệu Thu, chị Phương, chị Phượng với anh chị bạn làm việc phòng Thử nghiệm vi sinh-GMO, Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng (QUATEST3) nhiệt tình hướng dẫn dành cho em tình cảm quý giá suốt trình em thực tập làm khóa luận tốt nghiệp Con xin gửi lời tri ân đến Cha, Mẹ anh chị, người thân gia đình ủng hộ, nâng đỡ dành cho tình thương sâu sắc Xin cảm ơn tất bạn bè thân yêu lớp DH11SHO3 chia buồn vui hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ suốt năm tháng mái trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh Em xin chân thành cảm ơn tất người Sinh viên LÂM VĂN THẮNG MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I SVTH Lâm Văn Thắng Trang I Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC BIỂU ĐỒ VI DANH MỤC HÌNH ẢNH VII DANH MỤC PHỤ LỤC VIII ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Tồng quan QUATEST 1.1.1 Những nét chung 1.1.2 Nhiệm vụ 1.1.3 Phòng thử nghiệm vi sinh – GMO 1.2 Tổng quan kem 1.2.1 Nguồn gốc: 1.2.2 Thành phần kem 1.2.3 Các vi sinh vật kem 1.3 Đại cương vi sinh vật gây bệnh thường diện kem 1.3.1 Đại cương Coliforms 1.3.2 Đại cương Escherichia coli 1.3.3 Đại cương Staphylococus aureus 11 1.3.4 Đại cương Listeria monocytogenes 14 1.3.5 Đại cương Salmonella 17 1.3.6 Giới thiệu phương pháp PCR 22 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu 31 2.2 Thiết bị - Hóa chất: 31 2.3 Phương pháp kiểm nghiệm: 32 2.3.1 Quy trình chung 32 2.3.2 Mô tả mẫu: 32 2.3.3 Đồng mẫu: 32 SVTH Lâm Văn Thắng Trang II Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 2.3.4 Phân tích mẫu: 32 2.3.5 Lưu trữ, bảo quản mẫu: 33 2.4 Phương pháp phân tích vi sinh vật 33 2.4.1 Định lượng Coliforms thực phẩm phương pháp đếm đĩa theo ISO 4832:2006 33 2.4.2 Định lượng E.coli phương pháp MPN theo FDA 2013 (Chap 4G) 34 2.4.3 Định lượng Staphylococus aureus phương pháp MPN theo AOAC 2013 (987.09 ) 37 2.4.4 Định danh Listeria monocytogenes: TCVN 7700-1:2007, ISO 11290 – : 1996 / Amd.1 : 2004 38 2.4.5 Định tính Salmonella: TCVN 4829:2005 Sửa đổi lần : 2008 (ISO 6579 : 2002/Amd.1 : 2007) 42 2.4.6 Tiến hành định tính Salmonella.spp, Listeria monocytogenes phương pháp PCR song song với phương pháp truyền thống 48 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Kết mô tả mẫu: 54 3.2 Kết đánh giá vi sinh vật mẫu 57 3.2.1 Quy định tiêu kiểm nghiệm 57 3.2.2 Kết đánh giá vi sinh vật mẫu phương pháp truyền thống 58 3.2.3 Kết định tính Salmonella spp Listeria mocytegense mẫu phương pháp PCR 69 3.2.4 Kết nhận xét chung 71 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74 4.1 Kết luận 74 4.2 Đề nghị 74 Tài liệu tham khảo : 75 PHẦN PHỤ LỤC i SVTH Lâm Văn Thắng Trang III Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APHA American Public Health Association AOAC Association of Official Analytical Chemists BYT Bộ Y tế BS British Standards Đ Đạt GMO Genetically Modified Organism GMP Good Manufacturing Pratice IEC International Engineering Consortium ISO International Organization for Standardization KĐ Không đạt KPH Không phát QUATEST Trung tâm kỹ thuật đo luờng chất luợng TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points USFDA United States Food and Drug Administration SVTH Lâm Văn Thắng Trang IV Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật mẫu kem chứa sữa 33 Bảng 2.2 Bảng tóm tắt phản ứng Listeria spp 42 Bảng 2.3 Các phản ứng sinh hóa chủng Salmonella 47 Bảng 2.4 Các phản ứng kháng huyết thử khẳng định 48 Bảng 2.5 Điều kiện để nuôi cấy vi sinh vật 48 Bảng 2.6 Mồi đặc trưng cho loại vi sinh vật 49 Bảng 2.7 Nồng độ thành phần phản ứng PCR phát vi sinh vật: Salmonella spp Listeria monocygenes 50 Bảng 2.8 Chương trình nhiệt máy PCR 51 Bảng 3.1 Kết đánh giá mô tả mẫu 54 Bảng 3.2 Giới hạn vi sinh vật thực phẩm không phép 57 vượt giới hạn quy định bảng đây: 57 Bảng 3.3 Kết định lượng Coliforms mẫu 58 Bảng 3.4 Kết định tính định lượng E.coli mẫu 60 Bảng 3.5 Kết định lượng Staphylococus aureus mẫu 62 Bảng 3.6 Kết định tính Listeria monocytogenes mẫu 64 Bảng 3.7 Kết định tính Salmonella mẫu 66 Bảng 3.8 Kết điện di mẫu Salmonella spp Listeria monocytogenes phân lập từ mẫu kem thạch agarose 69 SVTH Lâm Văn Thắng Trang V Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ 3.1: Kết thu sau đánh giá thử nghiệm tiêu mẫu kem có chứa sữa 72 SVTH Lâm Văn Thắng Trang VI Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Kem giải khát bổ dưỡng (Internet) Hình 1.2: E coli kính hiển vi điện tử ( Internet ) Hình 1.3: Staphylococcus aureus kính hiển vi điện tử (Internet) 11 Hình 1.4: Listeria monocytogenes kính hiển vi (Internet) 14 Hình 1.5 Vi khuẩn Salmonella (Internet) 18 Hình 1.6 Vị trí kháng nguyên Salmonella 21 Hình 1.7 Nguyên tắc PCR nhân DNA đích qua chu kỳ nhiệt 24 Hình 1.8: Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt Peltier 27 Hình 1.9: Hình vẽ minh họa chế hoạt động chống ngoại nhiễm UNG 28 Hình 2.1: Quy trình chung kiểm nghiệm mẫu 32 Hình 2.2 Cấy & đọc kết phản ứng CAMP 41 Hình 3.1 Kết điện di đoạn gen đặc trưng Salmonella gel agarose 2% 71 SVTH Lâm Văn Thắng Trang VII Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH .i Hình Khuần lạc Coliforms môi trường VRBA i Hình Phản ứng IMViC i Hình Môi trường RVS trước sau cấy dịch khuẩn .ii Hình Môi trường XLD trước sau cấy ii Hình Phản ứng sinh hóa môi trường TSI agar iii Hình Phản ứng urease: âm tính (trái), dương tính (phải) iii Hình Môi trường LDC trước(A) sau cấy vi khuẩn (B:dương tính, C âm tính) iii Hình 8: Phản ứng phát β-galactosidase(A: âm tính; B dương tính) iv Hình Phản ứng indol (A:âm tính, B: dương tính) iv Hình 10 Phản ứng VP (A:âm tính, B: dương tính) .iv Hình 11 E.coli môi trường EMB v Hình 12 L monocytogenes môi trường ALOA v Hình 13 Phản ứng coagulase v Hình 14 Khuẩn lạc S aureus môi trường BP v PHỤ LỤC : CÁC HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG ĐƢỢC SỬ DỤNG vi Violet red bile lactose agar (VRBL) vi Brilliant green bile broth (BGB) vi Butterfield's buffer phosphate diluents vi Phẩm nhuộm Gram vii Lauryl tryptose broth ( LST ) vii EC broth viii Tryptone viii Butterfield's phosphate buffered viii L - EMB agar ix 10 MRVP broth ix SVTH Lâm Văn Thắng Trang VIII Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 11 Brain heart infusion broth (BHI broth) ix 12 Baird - Parker agar x 13 Huyết thỏ/ Rabbit plasma xi 14 Trypticase soy broth với 10 15 Nước muối sinh lý/ Physiological salt solution 0.85 % .xi 16 Half Fraser broth xii 17 Fraser broth (ISO 11290-1:1996) xiii 18 Oxford xiii 19 Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) xiii 20 Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (ISO 11290-1:1996) xv 21 Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB) (ISO 11290-1:1996) xvi 22 Molity agar (ISO 11290-1:1996) .xvi 23 Blood agar .xvi 24 10.H2O2 % xvii 25 Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth) xvii 26 Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth) xviii 27 Modified semi-solid Rappaport-Vasiliadis medium (MSRV) xix 28 Xylose - Lysine desoxycholate agar (XLD) xx 29 Hektoen enteric agar (HE) xx 30 Bismuth sulfite agar (BS) (Wilson Blair) xxi 31 Triple sugar iron agar (TSI) .xxi 32 Tryptone xxii 33 MR - VP medium xxii 34 Christensen’s urea agar xxii 35 Nutrient agar xxiii 36 L-Lysine decarboxylation medium xxiii 37 Semi - solid nutrient agar xxiv 38 Nước muối sinh lý xxiv 39 ONPG solution xxiv 40 Reagents xxiv SVTH Lâm Văn Thắng , NaCl sodium pyruvate xi Trang IX Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Agar 18,0 g Nước cất 1,0 L pH : 7,0 250C Tiệt trùng autoclave 1210C / 15 phút 13 Huyết th / Rabbit plasma - Chuẩn bị huyết tương tươi: Dùng ống chích vô trùng lấy máu thỏ chúng đói cho vào ống nghiệm chứa sẵn dung dịch Natri citrate 10 theo tỷ lệ Natri citrate : 100 máu Trộn để chống đông, quay ly tâm 3000 RPM/ 10 phút Gạn phần dịch phía vào ống nghiệm cỡ mm ống 0,5 mL huyết tương Khi dùng pha loãng theo tỷ lệ huyết tương nước cất vô trùng - Trước dùng cần kiểm tra hiệu lực chùng chứng dương Staphylococcus aureus 14 Trypticase soy broth với 10 , NaCl sodium pyruvate Trypticase 17,0 g Phytone 3,0 g NaCl 100,0 g K2HPO4 2,5 g Glucose 2,5 g Sodium pyruvate 10,0 g Nước cất/ distilled water 1,0 L pH : (7,3  0,2) 250C Tiệt trùng 1200C / 15phút 15 Nƣớc muối sinh lý/ Physiological salt solution 0.85 % NaCl 8,5 g Nước cất/ distilled water .1,0 L Tiệt trùng 1200C / 20 phút/ Sterilize at 1200C / 20min *Lƣu ý: Khi sử dụng môi trường, hoá chất thương phẩm có thành phần tương tự, pha chế môi trường hoá chất theo hướng dẫn nhà sản xuất SVTH Lâm Văn Thắng Trang xi Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 16 Half Fraser broth Môi trƣờng bản/basic medium Proteose peptone 5,0 g Peptone from casein 5,0 g Yeast extract 5,0 g Meat extract 5,0 g Sodium chloride 20,0 g Di – sodium hydrogen phosphate 12,0 g Potasium dihydrogen phosphate 1,35 g Aesculin 1,0 g Nước/water 1000,0 mL Hòa tan thành phần nước Tiệt trùng 1210C/15 phút nồi hấp tiệt trùng Chỉnh pH (7,2  0,2) 25 0C sau hấp tiệt trùng Lithium chlorode solution Lithium chloride 3,0 g Nước/water 10,0 mL Hòa tan lithium chloride vào nước, tiệt trùng cách lọc Dissolve lithium chloride in water and sterilize by filtering Solution of sodium salt of nalidixic acid: Sodium salt of nalidixic acid 0,1 g Sodium hydroxide, 0,05 mol/l solution 10,0 mL Hòa tan nalidixic acid salt sodium hydroxide, tiệt trùng cách lọc Acriflavine hydrochloride solution: Acriflavine hydrochloride 0,25 g Nước/water 100,0 mL Hòa tan acriflavine hydrochloride nước, tiệt trùng cách lọc ammonium iron (III) citrate solution Ammonium iron (III) citrate 5,0 g Nước/water 100,0 mL Hòa tan ammonium iron (III) citrate nước, tiệt trùng cách lọc SVTH Lâm Văn Thắng Trang xii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Dissolve ammonium iron (III) citrate in water and sterilize by filtering Môi trƣờng hoàn chỉnh Môi trường 100,0 mL Lithium chloride solution 1,0 mL Solution of sodium salt of nalidixic acid 0,1 mL Hydrochloride solution 0,5 mL Ammonium iron (III) citrate solution 1,0 mL Môi trường hoành chỉnh sử dụng sau pha xong 17 Fraser broth (ISO 11290-1:1996) Chuẩn bị tương tự môi trường half fraser broth môi trường hoàn chỉnh, dung dịch Sodium salt of nalidixic acid cho vào lượng gấp đôi 18 Oxford Colubia blood agar base 39,0 g Esculin 1,0 g Ferrous ammonium citrate 0,5 g Lithin chloride 15,0 g Cycloheximide 0,4 g Colistin sulfate 0,02 g Acriflavin 0,005 g Cefotetan 0,002 g Fosfomycin 0,01 g Nước cất 000,0 mL Đun để hòa tan Columbia blood agar base ,Esculin, Ferrous ammonium citrate, Lithin chloride tan hoàn toàn L nước cất, hấp tiệt trùng 121 0C /15 phút, làm lạnh đến 500C sau bổ sung thành phần lại, trộn đều(Hòa tan thành phần lại vào 10 mL nước cất sau lọc tiệt trùng màng lọc) 19 Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) Môi trƣờng bản/ Enzymatic digest of animal tissues 18,0 g Enzymatic digest of casein 6,0 g SVTH Lâm Văn Thắng Trang xiii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Yeast extract 10,0 g Sodium pyruvate 2,0 g Glucose 2,0 g Magnesium glycerophosphate 1,0 g Magnesium sulfate (anhydrous) 0,5 g Sodium chloride 5,0 g Lithium chloride 10,0 g Disodium hydrogen phosphate (anhydrous) 2,5 g 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glocupyranoside 0,05 g Agar (12 – 18) g Nước cất tiệt trùng (*) 930 mL (*): 925 mL sử dụng dung dịch Amphotericin B (*): 925 mL if use Amphotericin B Hòa tan hoàn toàn thành phần nước nóng Tiệt trùng 1210C/ 15 phút nồi hấp trùng pH (7,2  0,2) sau hấp tiệt trùng Dung dịch nalidixic acid Nalidixic acid sodium salt 0,02 g Sodium hydroxide (0,05 mol/L) 5,0 mL Hòa tan Nalidixic acid sodium salt mL sodium hydroxide trùng phương pháp lọc Dung dịch ceftazidime Ceflazidime 0,02 g Nước cất tiệt trùng 5,0 mL Hòa tan ceflazidime mL nước trùng phương pháp lọc Dung dịch polymyxin B Polymyxin B sulfate 76 700 IU Nước cất tiệt trùng 5,0 mL Hòa tan polymyxin B sulfate mL nước trùng phương pháp lọc SVTH Lâm Văn Thắng Trang xiv Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Antibiotic supplement Dung dịch cycloheximide: Cycloheximide 0,05 g Ethanol 2,5 mL Nước cất tiệt trùng 2,5 mL Hòa tan cycloheximide 2,5 mL ethanol sau thêm 2,5 mL nước trùng phương pháp lọc Dung dịch amphotericin B (thay cho dung dịch cycloheximide): Amphotericin B 0,01 g HCl (1 mol/L) 2,5 mL Dimethylformamide (DMF) 7,5 mL Hòa tan amphotericin B dung dịch HCl/DMF, trùng phương pháp lọc Supplement Hòa tan g L--phosphatidylinositol 50 mL nước lạnh khuấy khoảng 30 phút cho dung dịch đồng Tiệt trùng 1210C / 15 phút làm lạnh tới (48 - 50) 0C Môi trƣờng hoàn chỉnh Môi trường (*) 930,0 mL nalidixic acid solution 5,0 mL Ceftazidime solution 5,0 mL Polymyxin B solution 5,0 mL Cycloheximide solution 5,0 mL or amphotericin B solution 10,0 mL Supplement 50,0 mL (*): 925 mL sử dụng dung dịch amphotericin B Bổ sung dung dịch môi trường đun chảy làm nguội tới 500C, trộn kỹ dung dịch thêm vào pH (7,2  0,2) 25 0C Đổ môi trường hoàn chỉnh vào đĩa Petri 20 Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (ISO 11290-1:1996) SVTH Lâm Văn Thắng Trang xv Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Tryptone soya broth (*) 30,0 g Yeast extract 6,0 g Agar (9,0 – 18,0) g Nước cất tiệt trùng 000,0 mL (*) : Tryptone 17,0 g Soya peptone 3,0 g Sodium chloride 5,0 g Dipotassium phosphate 2,5 g Glucose 2,5 g Hòa tan thành phần nước nóng Phân phối môi trường vào ống nghiệm, tiệt trùng 1210C/ 15 phút, pH (7,3  0,2) 25 0C sau hấp tiệt trùng 21 Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB) (ISO 11290-1:1996) Tryptone soya broth (*) 30,0 g Yeast extract 6,0 g Nước cất tiệt trùng 000,0 mL (*) : Tryptone 17,0 g Soya peptone 3,0 g Sodium chloride 5,0 g Dipotassium phosphate 2,5 g Glucose 2,5 g Hòa tan thành phần nước Phân phối môi trường vào ống nghiệm, tiệt trùng 1210C/ 15 phút , pH (7,3  0,2) 25 0C sau hấp tiệt trùng 22 Molity agar (ISO 11290-1:1996) Casein peptone 20,0 g Meat peptone 6,1 g Agar 3,5 g Nước cất tiệt trùng 000,0 g Hòa tan thành phần nước Phân phối 5mL môi trường vào ống nghiệm, tiệt trùng 1210C/ 15 phút , pH (7,3  0,2) 25 0C sau hấp tiệt trùng 23 Blood agar SVTH Lâm Văn Thắng Trang xvi Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Tryptone 15,0 g Phytone soytone 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15,0 g Nước cất 000,0 mL pH : (7,3  0,2) Đun cho thành phần môi trường tan hoàn toàn, hấp tiệt trùng 121 0C /15 phút, làm lạnh đến 500C, bổ sụng mL máu cừu vào 100 mL môi trường tan chảy, trộn đổ đĩa petri 9.Purple carbohydrate broth Beef extract 0,1 g Peptone 10,0 g NaCl 5,0 g Bromocresol purple 0,015 g Carbohydrat alcol a 10,0 g Nước cất tiệt trùng 1,0 L pH : (6,8  0,2) 250C a : Các loại carbonhydrat cồn sau dùng riêng rẽ: dulcitol, glucose, lactose, mannitol, melibiose, raffinose, salicin, sorbitol, sacarose, xylose Đun nhẹ đến sôi để hòa tan thành phần Phân phối môi trường vào ống nghiệm 13x100 mm Hấp tiệt trùng autoclave 1210C / 15 phút 24 10.H2O2 % 25 Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth) Dung dịch A Enzymatic digest of soya 5,0 g Sodium chloride 8,0 g KH2PO4 1,4 g K2HPO4 0,2 g SVTH Lâm Văn Thắng Trang xvii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Nước cất tiệt trùng 000 mL Hòa tan thành phần nước đun cho tan 700C Dung dịch nên chuẩn bị ngày chuẩn bị pha môi trường RVS Dung dịch B MgCl2.6H2O 400,0 g Nước cất tiệt trùng 000 mL Hòa tan magnesium chloride nước Dung dịch phải giữ bình tối giữ nhiệt độ phòng dụng năm Dung dịch C Malachite green oxalate 0,4 g Nước cất tiệt trùng 100 mL Hòa tan malachite green oxalate nước Dung dịch phải giữ bình tối giữ nhiệt độ phòng dụng tháng Môi trƣờng hoàn chỉnh Dung dịch A 000 mL Dung dịch B 100 mL Dung dịch C 10 mL pH: (5,2  0,2) Phân phối vào ống nghiệm 10 ml môi trường hoàn chỉnh Hấp tiệt trùng 115 0C/ 15 phút Bảo quản môi trường (3 ± 2)0C sử dụng ngày 26 Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth) Môi trƣờng Meat extract 4,3 g Enzymatic digest of casein 8,6 g NaCl 2,6 g CaCO3 38,7 g Na2S2O3.5H2O 47,8 g Ox bile for bacteriological use 4,78 g Brilliant green 9,6 mg Nước cất tiệt trùng/ 000 mL SVTH Lâm Văn Thắng Trang xviii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp pH: (8,2  0,2) Hòa tan thành phần nước cách đun phút, môi trường sử dụng tuần (3 ± 2)0C Dung dịch Iodine-iodide Iodine 20,0 g KI 25,0 g Nước cất tiệt trùng 100 mL Hòa tan hoàn toàn potassium iodide 10 mL nước cất, bổ sung thêm iodine vào thêm nước cho đủ 100mL Không đun Bảo quản dung dịch bình đựng tối nhiệt độ thích hợp Dung dịch/solution novobiocin Novobiocin sodium salt 0,04 g Nước cất tiệt trùng mL Hòa tan novobiocin sodium salt nước cất tiệt trùng cách lọc Bảo quản (3 2)0C sử dụng tuần Môi trƣờng hoàn chỉnh Môi trường 000 mL Dung dịch/solutiuon iodine-iodide 20 mL Dung dịch/ solution novobiocin mL Môi trường hoàn chỉnh sử dụng ngày 27 Modified semi-solid Rappaport-Vasiliadis medium (MSRV) Enymatic digest of animal and plant tissue 4.6 g Acid hydrolysate of casein 4.6 g Sodium chloride (NaCl) 7.3 g Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4) 1.5 g Magnesium chloride anhydrous (MgCl2) 10.9 g Malachite green oxalate 0.04 g Agar 2.7 g Nước/ Water 1000 mL Hòa tan thành phần vào nước Khuấy gia nhiệt Không hấp Làm nguội (47- SVTH Lâm Văn Thắng Trang xix Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 50) 0C Bổ sung mL dung dịch Novobiocin Chuẩn bị dung dịch Novobiocin Novobiocin sodium 0.05 g Nước/water 10 mL Khử trùng cách lọc qua màng có kích thước lỗ lọc 0.22 µm Dung dịch Novobiocin lưu trữ (5 3)0C tuần chia thành phần nhỏ (2 mL) lưu trữ ( -20) 0C năm 28 Xylose - Lysine desoxycholate agar (XLD) Xylose 3,75 g L-Lysine 5,0 g Lactose 7,5 g Sucrose 7,5 g Sodium chloride 5,0 g Yeast extract 3,0 g Phenol red 0,08 g Sodium desoxycholate 2,5 g Sodium thiosulfate 6,8 g Ferric ammonium citrate 0,8 g Agar 15,0 g Nước cất 1,0 L pH : (7,4  0,2) 250C Đun nóng môi trường, khuấy liên tục để tan thành phần, đến khoảng 90oC Để môi trường đến 500C rót vào đĩa petri 29 Hektoen enteric agar (HE) Peptone 12,0 g Yeast extract 3,0 g Lactose 12,0 g Sucrose 12,0 g Salicin 2,0 g Muối mật số 9,0 g SVTH Lâm Văn Thắng Trang xx Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Sodium chloride 5,0 g Sodium thiosulfate 5,0 g Ferric ammonium citrate 1,5 g Acide Fuchsin 0,1 g Brothymol blue 0,065 g Agar 15,0 g Nước cất 1,0 L pH : (7,5  0,2) 250C Môi trường không tiệt tr ng autoclave, đun nóng để tan thành phần, để nguội 500C rót vào đĩa petri 30 Bismuth sulfite agar (BS) (Wilson Blair) Peptone 10,0 g Beef extract 5,0 g Glucose 5,0 g Na2HPO4 4,0 g FeSO4 0,3 g Bi2 (SO3)3 indicator 8,0 g Brilliant green 0,025 g Agar 20,0 g Nước cất 1,0 L pH : (7,6  0,2) 250C Không tiệt trùng autoclave, đun nóng cho tan thành phần Để nguội 500C, rót vào đĩa petri 31 Triple sugar iron agar (TSI) Peptone 20,0 g Meat extract 3,0 g Yeast extract 3,0 g NaCl 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g SVTH Lâm Văn Thắng Trang xxi Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Glucose 1,0 g Iron (III) citrate 0,3 g Na2S2O3 0,3 g Phenol red 0,024 g Agar 9-18g g Nước cất 1,0 L pH : (7,4  0,2) 250C Hòa tan thành phần nước Đun nóng để tan Rót 10mL môi trường vào ống nghiệm Tiệt trùng autoclave 1210C / 15 phút Để nghiêng cho phần cao từ (2.5-5) cm 32 Tryptone Tryptone 10,0 g NaCl 5,0 g DL – Tryptophan 1,0 g Nước cất 000 mL pH: (7,5  0,2) Hòa tan thành phần nước nóng, phân phối mL môi trường vào ống nghiệm Tiệt trùng 1210C/15 phút nồi hấp tiệt trùng 33 MR - VP medium Peptone 7,0 g Glucose 5,0 g K2HPO4 5,0 g Nước cất 1,0 L pH : (6,9  0,2) 250C Hoà tan thành phần nước cất đun cần Phân phối vào ống nghiệm khoảng 3mL môi trường Hấp tiệt trùng autoclave 1210C / 15 phút 34 Christensen’s urea agar Môi trƣờng Peptone 1,0 g NaCl 5,0 g SVTH Lâm Văn Thắng Trang xxii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Dextrose 1,0 g K2HPO4 2,0 g Phenol red ( mL of 1:500 solution) 0,012 g Agar 15,0 g Nước cất 900,0 mL Hòa tan hoàn toàn thành phần môi trường nước, đun nóng cần.Chỉnh pH : (6,8  0,2) Hấp tiệt trùng 1210C /15 phút Dung dịch urea Urea 400,0 g Nước cất 100,0 mL Hoà tan urea nước Tiệt trùng cách lọc Môi trƣờng hoàn chỉnh: Môi trường 950mL Dung dịch urea 50mL Bổ sung dung dịch urea vào môi trường sau làm tan làm nguôi tới (44-47)0C cách vô trùng Phân phôi 10mL môi trường vào ốn, để nghiêng 35 Nutrient agar Meat extract 3,0 g Enzymatic digest of animal tissues/ Peptone 5,0 g Sodium cloride 5,0 g Agar 18,0 g Nước cất 1,0 L pH : (7,0 0,2) 250C Hòa tan thành phần nước cách đun nóng cần thiết Tiệt trùng autoclave 1210C / 15 phút Môi trường sử dụng vòng tuần bảo quản (2-8)0C 36 L-Lysine decarboxylation medium L-Lysine monohydrochloride 5,0g Yeast extract 3,0 g Glucose 1,0 g SVTH Lâm Văn Thắng Trang xxiii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Bromocresol purple 0,015 g Nước cất tiệt trùng 000 mL pH: (6,8  0,2) Hòa tan thành phần nước, phân phối mL môi trường vào ống nghiệm Tiệt trùng 1210C/15 phút nồi hấp tiệt trùng 37 Semi - solid nutrient agar Meat extract 3,0 g Peptone 5,0 g Agar 4,0 – 9,0 g Nước cất 1,0 L pH : (7,0 0,2) 250C Hoà tan thành phần nước, hấp tiệt trùg 1210C / 15 phút 38 Nƣớc muối sinh lý NaCl 8.5 g Nước cất 1,0 L pH : (7,0 0,2) 250C Hoà tan NaCl nước, hấp tiệt trùg 1210C / 15 phút 39 ONPG solution 2-ortho-Nitrophenyl-β-galactopyraoside (ONPG) 0.08g Nước/ water 15mL Hoà ta ONPG nước 500C, để nguội/ 40 Reagents -Thuốc thử Kovacs/reagents 4– Dimethylaminobenzaldehyde g 2-Methylbutan-2-ol 75 mL HCl (ρ=1.18g/mL to 1.19g/ml) 25mL -Dung dịch Creatine + Creatine monohydrate 0,5 g + Nước 100 mL -KOH 40 % SVTH Lâm Văn Thắng Trang xxiv Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp + Potassium hydroxide 40 g + Nước 100 mL - α-naphtol (1-naphtol) + 1-naphtol g + Cồn 96 100 mL - Đĩa giấy O.N.P.G / O.N.P.G dish 41 Kháng huyết thanh: O, H, Vi *Lƣu ý: Khi sử dụng môi trường, hoá chất thương phẩm có thành phần tương tự, pha chế môi trường hoá chất theo hướng dẫn nhà sản xuất SVTH Lâm Văn Thắng Trang xxv ... Salmonella, Listeria Trong phạm vi báo cáo em khảo sát mức độ nhiễm vi sinh vật gây bệnh sản phẩm kem có chứa sữa theo Tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT 1.3 Đại cƣơng vi sinh vật gây bệnh thƣờng diện kem 1.3.1... đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm Xuất phát từ lí trên, thực đề tài: " KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ CHỨA SỮA THEO TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT " SVTH Lâm... bảo quản lâu dài Ngoài bột kem có bổ sung hương liệu phù hợp với vị người (vi. wikipedia.org/wiki /Kem) 1.2.3 Các vi sinh vật kem Các vi sinh vật thường nhiễm sản phẩm kem Enterobacteriace, Coliforms,