LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC
KHAO SAT THANH PHAN HOA HOC CAO
ETYL ACETAT CAY RAU MA LA SEN
Hydrocotyle bonarienasis L HQ NGO (APIACEAE)
CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN
Ths Ton Nữ Liên Hương Phan Thị Trinh MSSV: 2064027
Ngành: Cơng Nghệ Hóa Học-Khóa 32
Trang 2Cần Thơ ngày tháng năm 2010
PHIẾU ĐÈ NGHỊ ĐÈ TÀI TÓT NGHIỆP CHO SINH VIÊN NAM HOC: 2010 - 2011
1 Họ và tên của cán bộ hướng dẫn
Ths Tôn Nữ Liên Hương MCB: 1410
2 Tén dé tai: Khao sat thành phần hóa học trên cao Etyl acetat cây rau má la sen (Hydrocotyl bonariensis L.), hg Ngo (Apiaceae)
3 Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm Hữu cơ Bộ Mơn Hóa học - Khoa
Khoa học tự nhiên - Trường Đại Học Cân Thơ
4 Số lượng sinh viên thực hiện: 01 sinh viên
53 Họ và tên sinh viên: Phan Thi Trinh MSSV: 206407 Lớp: Cơng Nghệ Hóa Học Khóa: 32
6 Mục đích của đề tài
Khảo sát thành phan hóa học trên cao etyl acetat cây hydrocotyl bonariensis họ ngò
7 Các nội dung chính và giới hạn của đề tài
e Điều chế cao tổng bằng phương pháp ngâm dầm, điều chế các cao có tính
phân cực tăng dần bằng kĩ thuật trích ly rắn lỏng sắc kí cột nhanh e© Sắc kí cột các phân đoạn cao để tinh chế các hợp chất
© Đo phơ xác định cấu trúc của hợp chất tỉnh chế được
8 Các yêu cầu hỗ trợ cho việc thực hiện đề tài
Các hóa chat dé thực hiện
9, Kinh phí dự trù cho việc thực hiện đề tài: 250.000 đồng
DUYỆT CỦA CB TẠI CƠ SỞ DUYET CUA CBHD
Ths Tôn Nữ Liên Hương
DUYET CUA BO MON
DUYET CUA HOI DONG THI & XET TOT NGHIEP
Trang 3ale
Đề có nhiều điều kiện phan đầu hoàn thành luận văn, trước hết em xin gửi lời
cảm ơn trân trọng nhất đến toàn thể quý thầy cô trong trường, trong khoa đặc biệt quý thầy cô trong Bộ môn Cơng nghệ hóa học khoa Công nghệ Quý thây cô đã
truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu trong những năm học tập rèn luyện tại trường và cả trên đường đời sau này
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc trân trọng nhất đến cô Tôn Nữ Liên Hương
không chỉ tận tình hướng dẫn, chỉ bảo những kiến thức chuyên sâu trong nghiên cứu
và ứng dụng, mà còn tạo điều kiện động viên dìu dat em buéc qua giai doan kho
khăn nhất để hoàn thành luận văn của mình Cô là cầu nỗi cho em hiểu biết thêm về lĩnh vực Hợp chất thiên nhiên và nhiều kinh nghiệm cuộc sống
Em xin gửi lời ghi ơn đến quý thầy cô Bộ môn Công nghệ hóa học - Khoa
Cơng nghệ đã tạo điều kiện truyền đạt những kiến thức chuyên ngành
Tôi xin cảm ơn tất cả các bạn trong lớp Cơng nghệ hóa học K32 đã động
viên giúp đỡ tơi trong q trình học tập rèn luyện Đặc biệt các anh chị và các bạn
trong nhóm thực hiện luận văn đã hỗ trợ rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài
Con xin khắc ghi công ơn trời biển của cha mẹ đã cho con đến trường, cho con hậu phương vững chắc để vững bước trên con đường tiếp cận tri thức khoa học Con xin hứa sẽ phan đấu nhiều hơn nữa để đạt được nhiều thành công hơn nữa trong tương lại
Xin chân thành cảm ơn! Phan Thị Trinh
Trang 4NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1 Cán bộ hướng dẫn: Ths Tôn Nữ Liên Hương
2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học trên cao etyl acetat cây rau má lá sen (Hydrocotyle bonariensis L.), ho Ngo (Apiaceae)
3 Sinh vién thyc hién: Phan Thi Trinh MSSV: 2064027
Lớp Cơng nghệ Hóa học —- Khóa 32
4 Nội dung nhận xét:
a Nhận xét về hình thức LVTN:
b Nhận xét về nội dung của LVTN:
+ - Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Cán bộ hướng dẫn
Tôn Nữ Liên Hương
Trang 5NHAN XET DANH GIA CUA CAN BO CHAM PHAN BIEN 1 Cán bộ chấm phản biện:
2 Dé tai: Khao sat thành phần hóa học trên cao etyl acetat cây rau má lá sen (Hydrocotyle bonariensis L.), họ Ngò (Apiaceae)
3 Sinh viên thực hiện: Phan Thị Trinh MSSV: 2064027 Lớp Cơng nghệ Hóa học — Khóa 32
4 Nội dung nhận xét:
a Nhận xét về hình thức của LVTN:
b Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chỉ tiết đầy đủ): > Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng
nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
Cán bộ chấm phản biện
Trang 6ale
Xuất phát từ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và nhu cầu của con người, các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp làm giảm tác dụng miễn dịch và nhiều tác dụng phụ khác, nên xu hướng hiện nay là tìm các hoạt chất thiên nhiên từ nguồn thảo mộc có tác dụng như thuốc tổng hợp nhưng ít độc và dễ dung nạp, nhất là đối VỚI Nguoi cao tuổi và người có bệnh mạn tính Dé ứng dụng tốt hơn hoạt chất thiên nhiên thì việc tìm hiểu về thành phần hóa học là cần thiết Ngoài việc nghiên cứu biết rõ tổng thể từng nhóm chất thì việc làm rõ thành phần cũng như nhận danh cụ thể từng hợp chất là nhu cầu rất quan trọng Đó cũng chính là nhiệm vụ của ngành
Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Thuộc khu vực nhiệt đới nên Việt Nam có nguồn thực vật rất phong phú và đa dạng và được con người sử dụng để làm thức ăn, chữa bệnh Trong đó cây rau má là
loài cây rất thân thuộc, chúng hiện diện ở khắp nơi tử vùng hải đảo, ven biển đến
vùng núi Theo Trung y, rau má có tính hàn (lạnh), tân (cay), khổ (đăng) Khi ăn ở dạng tươi như một loại rau, người ta cho rằng nó giúp cho việc duy trì sự trẻ trung Nước sắc từ lá rau má được coi là có tác dụng hạ huyết áp Loại nước sắc này cũng được coi là một loại thuốc bố đưỡng để có sức khỏe tốt (tăng trí nhớ, thị lực) Loại thuốc đắp từ lá cũng được dùng để điều trị những chỗ đau, hạ sốt Nó cịn được dùng trong điều trị các chứng phù, viêm thanh quản, tĩnh mạch, phế quản, các bệnh tri, phong, eczema hay vay nến, giải ngộ độc săn và lợi tiêu Tuy nhiên rau má lá sen là loài mới phát hiện gân đây, chưa có nghiên cứu hóa học nào
Nhằm góp một phần nhỏ vào nghiên cứu khoa học, chúng em chọn đề tài “Khảo sát thành phan héa hoc cao etyl acetat cay rau mé lá sen hydrocotyl bonariensis L thuộc họ ngò (Apiaceae)” đê thực hiện
Trang 7PHIEU DE NGHỊ ĐẼ TÀI TỐT NGHIỆP CHO SINH VIÊN -:: i
|) OFA 0) ằ sa ằs ằ ii
NHAN XET DANH GIA CUA CAN BO HUONG DAN -. - 5: Hi NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHÂM PHẢN BIỆN iv LỜI MỞ ĐẦU - S111 1E S13 S0 E1 111111 11T TT HH1 1111111111111 V
MUC LUC ::(( ad VI
DANH MỤC HÌNH ẢNH ¿c5 E11 E1 2 E11111 11 111.111 xrke ix DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ PHỤ LỤC + ¿5 +5 +E+E‡EvEvEzrrkerrrssee x DANH MUC NHUNG TU VIET TU oo.cccccccccsesessesesssssscsesessssssssssssssssssssnevsees xi
CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN VỀ THỰC VẬTT - - 2 k3 E2 E#E#EsEExEvxsxei 1
1.1 Sơ luoc vé chi Hydrocotyle ccccsessssesssvsssevsssessssscsnevevsvevacscavacsenevevacaevevavsens 1 1.2 Giới thiệu về rau má lá sen #ydrocofyle bonariensis LL sex sex si 3 1.2.1 Tên gọi và phân loạI .- - < + + 1 Y9 1g kh 3 1.2.2 Đặc điểm, xuất xứ và phân ĐỒ ¿+ + SE SxkEEEEEEEkrkrkrkrkevee 3 1.2.3 Thành phần hóa hỌc . ¿6E E31 E3 EE SE E111 E3 1x rkrerkrs 4 CHƯƠNG 2 GIỚI THIỆU Về STEROID GLYCOSID - 2 5:55: 5
“8 ¡0 ằ.ằ ằ ỐốÚỐốố.ố 5
“69 7 2.2.1 Khái niệm vỀ ÌyCOSi 5c tà SEEx ST kg ret 7 2.2.2 Phân loại øÏyCOSIC - - S3 HH vn ng 8 2.2.3 Lý tính của ØÏYCOSId - LH TH vn 9 2.2.4 Steroid ØÏyCOSI 0111 HH nà nọ km ng hy 9 2.2.4.1 GlycosId trợ fim - c1 S191 SH nh tk kg kh vn 9 2.2.4.2 S4DOTIH Quà 10 2.2.5 Quy trình tách chiết glycosid ra khỏi cây .- . - 5 ccs xxx vsvsevo 10 2.2.6 Phương pháp thủy giải øÏYCOSI nh he, 12
Trang 82.2.6.3 Thủy phân bằng dung dịch kiểm 6 5 s2 ve 13 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1 Dụng CỤ ch ng TH ng ng nọ ng TK nh 14
3.2 Hóa Chất 1n TT 711111111711 1171111 1711111111111 TErrrrkr 14 3.3 Phương pháp sắc kí tk x13 TT TT TT TH TH ng Hưng 14 3.3.1 Phương pháp sắc kí cột + 2S St cv rkrzrrrers 14 3.3.1.1 Chuẩn bị cột sắc kí . cà tt vvgrrrxrrrkrkrrrees 14 3.3.1.2 Giải ly sắc kí cột pha thường . ¿- ¿s2 rErveekreea 16 3.3.1.3 Theo dõi quá trình giải ly cột sắc kí s52 cs sex sssrcez 16 3.3.2 Sắc kí lớp mỎïB . - s2 vn 3T TT H3 HH Ty co 17 3.3.2.1 Nguyên tẮC Lành HT ng T111 111 TH TH kh 17 3.3.2.2 Giải ly bản mỏng 5c 1t tt terrkrkrserrrrrrsrsrred 18 3.4 Phương pháp chuẩn bị ŒaO . - - - Gà 119 3S 11T TH ng ngàn ky 19
S A0) ái 0N 19
3.4.1.1 Dung môi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây 19
3.4.1.2 Lựa chọn dung môi để chiết tách - sc tt vs ssessa 20
3.4.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng đung môi để chiết tách hợp chất
¬ 20
3.4.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây - 5-5 cc cscec: 21 3.4.2.1 Kỹ thuật chiết rắn lỏng ¿- St tt EzErEsrrkrrererersree 21 a Kỹ thuật chiết ngắm kiỆt - 2 +5 22t x vs rxg 21 b Kỹ thuật chiết ngâm đầm ¿- ¿5 + S* + EEsrsrererrreei 22 c.Kỹ thuật chiết bằng máy Soxlet - s2 S2 23
3.4.2.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng s1 3 xxx vrvrkrkrkrxea 24
3.5 Phương pháp xác định cấu trúC -¿-¿- + tà cx SE ST gryrh 27 CHƯƠNG 4 THỰC NGHIỆM - 2-2 S2 S233 ‡EEEEvEEEEErkrketrerrrrererrrrd 28
Trang 94.1.2 Điều chế cao metanol tỔng - ¿- + + s11 3E v13 1E vn cho 29 4.1.3 Điều Ché ca0 PE c.cccscsccscssescsscssesessccscsacsccsccacsecacsevssvacsessavsccaeaveceaees 30 4.1.4 Didu ché ca0 DCoiieccecscssscscssssessscsssssescscsssvsvsvsssessevecsssssssssvevsssssssseans 30 4.1.5 Điều chế cao Ea ch nh 11T HH1 71111117111 111111 30 4.1.6 Điều chế cao ÌMe Là 1 1T HE E1 T17 11g11 HH ng yng 30
4.2 Sắc kí CỘT CaO E4Ố .- ccQ c ng ng nh ng ng ph 32
4.2.1 Khảo sát phần đoạn Ea3.3 - ng ng ng ng re 33 4.2.2 Biện luận cấu trúc của Ea8 ng ng nen rra 36 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, - - 2 - 5+ 2 2x zxzxsrsrszed 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 121211111115 9EEE12271111111311 111111 47
:10009 1 ằ 49
DE CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP .- - 5 2E EE+EEvEzEEErksrrred 59
Trang 10ale
Hinh 1.1 Mét sé cay thudc chi Hydrocotyle c.cccscesesssvsssssessseecsssesevsvsees Trang 2 Hinh 1.2 La va hoa Hydrocotyle DONGrIensis ccccceececececcccccccnesseceeeeseeenenaees 3 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết glycosid ra khỏi cây - - s5 11 Hình 3.4 Triển khai SKLMM ¿ ¿ 222 ề EEEEESEEEEEtErrrrkrrrrrrrrkrrred 18 Hình 3.5 Cách tính giá trị R¿ - ¿2c + tk 2v 2E xe rrrrerrrike 19 Hình 3.6 Kỹ thuật chiết ngâm đầm ¿- - 2+3 x2EEEeErkrrkrsrsred 22
Hình 3.7 Kỹ thuật chiết bằng máy SoxhIet 2 2t S33 vs ket 23
Hình 3.8 Bình lóng ¿- ¿SE 9EE 1k E211 BE E1 11x kg ru 24 Hình 3.9 Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các cao ¿- ¿5-5 scscsssce¿ 26 Hình 4.10 Sắc kí cột nhanh - +: + 223 9EEEEESEEEEEEEEEErEtErkrrrrrrrrrrrkrrred 29
Hình 4.11 Sơ đồ điều chế cao bằng phương pháp trích ly rắn lỏng sắc kí cột nhanh
sacsvevevssssvavesescsvsvssessavsvevsvsssaavsssssesessstevsvsssssssassvesavsisecassssssevsssacacacscsvssessevevasseveen 31 Hình 4.12 SKLM cao Ea được giải ly trong Ea:Me = 9:] 32 Hình 4.13 SKLM kết quả xử lý Ea3.12 -¿- c5 St ekketrrxkersrred 35 Hình 4.14 SKLM hợp chất Ea8 - :- cà nề E SE HE rkrrrrrkg 35 Hình 4.15 SKLM Ea8 với 3 hệ dung môi khác nhau 5 5-2 35 Hình 4.16 Tinh thể của hợp chất Ea8 ¿+ - SE ềE*EEkvkkksrrrrrrree 35 Hình 4.17 Cấu trúc hỗn hợp hợp chất Ea8 - s5 s3 cveeerserserrsee 45
Trang 11alle
Bang 1: Kết quả khảo sát cao Ea2 sàn HH HH1 hư 33 Bảng 2: Kết quả xử lý phân đoạn Ea3.3 -:- - cà sxgkkrkrsrred 34 Bảng 3: Kết quả phố “C-NMR spinasterol glycosid -. ¿55 ccscscs2 37
Bảng 4: So sánh số liệu phố của spinasterol glycosid với tài liệu [13] và [14] 39 Bảng 5: Kết quả phố ”C-NMR stigmasterol glycosid . ¿-¿-5: 555: 41
Bảng 6: So sánh số liệu phố của stigmasterol glycosid với tài liệu [15] và [19] 43 Phụ lục 1: Phố 'H-NMR của hợp chất Ea8 .- s1 vvvvesrrsszrersred 49 Phụ lục 2: '“C-NMR của hợp chất Ea8 - - s1 2n kg grrkrrkd 53 Phụ lục 3: Phổ DEPT của hợp chất Ea8 ¿- ¿5-5 S2 vcekrErkrkrsred 56
Trang 12DC Ea Bu SKLM NMR
Eter dầu hỏa Diclorometan Etyl acetat Metanol n-Butanol
Sắc ký bản mỏng
Nuclear Magnetic Resonance
Retention factor
Trang 131.1 So luge vé chi Hydrocotyle ™!
Chi Hydrocotyle, tập hợp hơn 30 lồi, có đặc điểm chung là cây thảo, sống nhiều năm, vùng phân bố rộng Ở Việt Nam, người dân quen gọi là rau má và có hơn mười lồi Hydrocofyle asiatica, Hydrocotyle chevalieri (Chern) Tard, Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib, Hydrocotyle nepalensis Hook, Hydrocotyle petelotii Tard, Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss, Hydrocotyle siamica Craib, Hydrocotyle sibthorpioides Lamk, Hydrocotyle tonkinensis Tard, Hydrocotyle wilfordii Maxim
Những loài cây thuộc chi Hydrocotyle rat dé séng 6 cdc ving đất âm, có
bóng râm, khí hậu mát mẻ, có thê sống cả trong môi trường nước và đặc biệt có lồi sống được trong môi trường đất căn, ngay cả nước mặn chúng cũng có khả năng
sinh sống và phát triển (những loài này có ở Hà Tiên, Ninh Thuận ) Trong đó, Hydrocotyle asiatica L va Hydrocotyle sibthorpioides (rau ma 14 nho) là hai loài thường gặp nhất và rất quen thuộc với người dân Việt Nam
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện thêm vài loài mới xuất hiện Dược sĩ Phan Đức Bình, phó biên tập của Tạp chí thuốc và sức khỏe Thành phố Hồ Chí Minh đã định danh hai lồi rau má có hình dạng khác biệt so với rau má thường là lá giỗng lá sen, phát hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, đó 1a Hydrocotyle bonariensis L va Hydrocotyle vulgaris L thường quen gọi là rau má Thái, rau má
Nhật Do đó tiến hành khảo sát thành phan hoa hoc trén cay Hydrocotyle
Trang 14Hydrocotyle americana L Hydrocotyle umbellata L
Hydrocotyle: : trnoro: Hết aE fod
Hydrocotyle bonariensis L
Hình 1.1 Một số cây thuộc chi Hydrocotyle
Trang 151.2 Giới thiệu về rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis L
rs S my đức: Ne oo
Hình 1.2, La va hoa
Hydrocotyle bonariensis
1.2.1 Tén goi va phan loai
Tén khoa hoc: Hydrocotyle bonariensis L
Tên khác: Penywort, large leaf penywort paraguita, rau ma 14 sen Phân loại: Gidi: Thực vật Ngành: Magnoliophyta Lop: Magnoliopsida Thi: Apiales Ho: Apiaceae Chi: Hydrocotyle Loai: Bonariensis
1.2.2 Đặc điểm, xuất xứ và phân bố
Hydrocotyle bonariensis L là loại cây sống dễ trong nước, nơi âm ướt, đất cát,
và cả môi trường khô Cây thuộc loại cỏ lưu niên nhẫn, dạng thân rễ mọc bò, tại mỗi đốt có nhiều rễ và cho ra I1 - 2 lá vươn thăng lên từ cọng lá Lá mỏng, hình lọng,
phiến trịn, rộng, có thùy cạn, mép lá khía tai bèo, cuống lá mọc ở giữa Hoa nhỏ, năm cánh, có màu trắng hoặc vàng kem, tán hoa đường kính 1 — 6 cm gồm nhiều tia
Trang 16tụ tạo thành vòng tròn, cây ra hoa từ mùa xuân đến đầu mùa thu Quả hình bầu dục, dày 0,5 — 2 cm, rộng 2,5 - 3 mm, đáy và đỉnh có khía sống lưng và phần bên gân
nỗi rõ Xuất xứ từ Nam Mỹ, gần đây phát hiện mọc hoang ở Việt Nam
1.2.3 Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về cây Hydrocotyle bonariensis L chi moi tap trung vé dic điểm sinh thái của cây Trong báo cáo về sinh hóa có ghi nhận về khả năng hấp thụ muối NaCI của lá cây này ở những vùng đất mặn có ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyl và làm thay đổi hàm lượng protein trong lá So với cây Foeniculum vulgare L thi cdy Hydrocotyle bonariensis L nhan NaCl nhiều hơn Chưa có sự nghiên cứu nào về thành phần hóa học trên lồi cây này (ngồi nhóm nghiên cứu của cô Th.s Tôn Nữ Liên Hương)
Trang 172.1 Steroid I1 BI
Steroid là những hợp chất thiên nhiên có chung đặc điểm cấu tạo phân tử có chứa hệ vòng cyclopentanoperhyphenantren hoặc trong trường hợp rất hiếm là sự biến đổi của hệ vòng đó Phép phân tích tia X cho thấy các phân tử steroid dài và
mỏng, điều phù hợp với cầu hình vịng B và C ở vị trí trans với nhau, cịn A/B, C/D
có thể cis hoặc trans Tất cả các steroid bão hòa thuộc 2 loại là cholestan và
coprostan Khung cholestan là sự kết hợp A/B trans, B/C trans, C/D trans, dugc goi là allo Khung coprostan là sự kết hợp A/B cis, cdc vong khac 1A trans goi 1a normal
Steroid có nhiều trong thiên nhiên như: các sterol, các nội tiết tổ (hormon) như
nội tiết tố sinh dục, axít mật, hormon tuyến thượng thận, các glycosid, đặc biệt là
glycosid trợ tim, các sapogenm,
Sterol là những alcol có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, có cấu trúc từ 27- 29 nguyên tử cacbon và một nhóm thế alkyl mạch nhánh ở C¡;¿ Sterol phân bố rất rộng, thường có mặt song song với alkaloid hoặc saponinsterol Chúng được tìm thấy trong động vật có xương sống, khơng xương sống và sau đó được tìm thấy
trong thực vật Nhóm sterol động vật (zoosterol): cholesterol, cholestan-3B-ol, coprostan-B-ol, desosterol, coprostanol, cerebrosterol, lathosterol
Nhóm sterol của động vật biển không xương sống: spongesteol, clionasterol,
24-methylencholesterol, fucosterol
Nhóm sterol thực vật (phytosterol): sitosterol (có các đồng phân ơ, ÿ), stigmasterol, ơ-spinasterol, brassicasterol Các sterol thực vật có trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu, dưới dạng tự do, ester hoặc ở dạng glycosid
Trang 18Các hormon trong cơ thể người, và trong các động vật khác cũng đã được nghiên cứu Sinh tố D cũng là một hợp chất steroid
Các steroid có tác dụng đặc biệt đối với cơ tim thường tồn tại dưới dạng glycosid, trong tự nhiên gọi là các glycosid trợ tim
Các sapogenin steroid phân lập chủ yếu từ sự thủy phân glycosid thực vật còn gọi là saponin
Các sterol trong thiên nhiên
NO HO HO Cholesterol SpInasterol COOH NN HO HO
Stigmasterol Acid lithocolit
N OH
OH
HO
HO
Ergosterol Estriol
Trang 19Khả năng hấp thụ của phytosterol là 2-5% so với cholesterol là 60%, nhưng có
cấu trúc tương tự nhau nên phytosterol ức chế hấp thụ cholesterol ở ruột và làm giảm nồng độ của chất béo này trong máu Do đó phytosterol có tác đụng chỗng xơ vữa động mạch, chống viêm, chống sự oxy hóa Ngồi ra phytosterol cịn có tác dụng chuyển hóa cholesterol nên giảm nguy cơ với bệnh tim, mạch vành, kiềm hãm sự phát triển của tế bào ung thư, kháng nắm [16], [17]
2.2 Glycozit [14h (7H
2.2.1 Khai niém vé glycosid
Glycozit là dạng phố biến của nhiều hợp chất tự nhiên, chất tạo thành do sự ngưng tụ giữa một phần là đường và một phần không phải là đường, được gọi là “heterosid” Phần đường, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin Phần đường
và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nỗi acetal vì vậy phân tử glycosid
dễ bị phân huỷ khi có nước đưới ảnh hưởng của các enzim (men) có chứa trong cây Phần aglycon của glycosid rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất thiên
nhiên như: monoterpen, sesquIterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid,
quinonoid, polyphenol
Phần đường trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, øalactose Tác dụng của các glycosid lên cơ thể phụ thuộc vào phần aglycon và phần đường làm tăng hoặc giảm tác dụng của chúng
CH;OH CH;OH
H O H O
OHO OH + HOAr(R) ——> 0H H OAr(R)
OH OH
H OH H OH
Trang 20Một số glycozit ` O O ; Solasodin Spirostan OH H O HO HO 9 OH H H Sitosterol glucopyranozit 2.2.2 Phan loai glycosid
Phân loại glycosid dựa theo phần đường và phần aglycon
Phân loại theo tên của đường: tùy theo nhóm glycon mà glycozIt có tên gọi tương
ứng nhu glucozit, rhamnozit, galactozit, rutozit
Phân loại theo mạch đường: phần glycon gồm một hoặc nhiều đơn vị đường nối với
nhau theo di hoặc trisaccarid Nếu aglycon có 2 nhóm OH trở lên thì có diglycozit hay bidesmozit (đesrnos có nghĩa là mạch)
Phân loại theo dây nối aglycon-đường: phân đường và phần không đường của các glycozit thường nối với nhau bằng các cầu nối: Ó-glycozit, $-glycozit, N-glycozit, C-glycozit Một số trường hợp phần đường và không đường liên kết với nhau bằng dây nối ester, loại này được gọi là pseudoglycozit
Phân loại theo cấu trúc của aglycon: Hệ thống phân loại thường đùng hiện nay là phân loại theo cấu trúc của phần không đường Dựa vào cấu trúc của phần không đường người ta chia thành các nhóm chất như: steroid glycozit, terpenoid glycozit,
polyphenol glycozit, alkaloid glycozit,
Trang 212.2.3 Ly tinh cua glycozit
Kết tỉnh, dạng vơ định hình hoặc lỏng sánh Đa số không màu (trừ anthraglycozit có màu đỏ, flavonoid có màu vàng), có vị đẳng Aglycon thân dầu nên ít tan trong nước O dang glycozit dé tan hơn, nhờ phần đường, nên tan được
trong dịch tế bào
2.2.4 Steroid glycozit
Steroid glycozit g6m phan aglycon 1a steroid va phần đường, gồm 2 nhóm chính là
glycosid tro tim va saponin
2.2.4.1 Glycozit tre tim
Glycozit tro tim 14 một nhóm glycozZIt có cau tric steroid, cé tac dung dac hiéu
đối với bệnh tim nhưng với liều cao chúng là các chất gây độc Tác dung của glycozit tìm làm tăng sức co bóp của cơ tim cả ở người lành lẫn người bệnh, làm
tăng trương lực cơ tim, làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng, giãn do
vậy làm tăng trương lực cơ tim, giảm thể tích và kích thước tim Nhịp tim chậm lại
do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nút
Xoang, giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất, tính kích thích của cơ tâm
nhĩ cũng giảm Ngược lại, glycozit tro tim làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất, gây lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu natri ở ống lượn gần
Sự hấp thu glycozit qua dạ dày, ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm -OH của aglycon Một điển hình cụ thể như sau digitoxin có I nhóm -OH dễ hấp thu qua đường tiêu hóa, tích luỹ trong cơ thể Cịn ouabain có 5 nhóm -OH, khó hấp thu qua đường tiêu hóa nên tiêm tĩnh mạch được thải trừ nhanh Đa số glycozit tim có vịng A/B là c¡s, A/B ít gặp hơn Người ta ghi nhận là nếu vòng A/B có cầu tạo /rans thì hoạt tính giảm hơn so với cấu tạo cis
O O O O S OH À OH CH OH Duong-O Duong-O OH
Glycozit tim Ouabain
Trang 22H3C H.C H3C “Vo Oo are Ho oN ° OH OH OH Digitoxin 2.2.4.2 Saponin
Saponin 14 mot glycosid phan bố kha rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng là khi hòa vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung
dịch và tạo nhiều bọt, có tính phá huyết vì làm vỡ hồng cầu Saponin thường ở dạng
vơ định hình, có vị đắng, khó tinh chế có điểm nóng chảy thường cao hơn 200°C trở
lên và có thể cao hơn 300°C Saponin bi tua boi chi, hydroxid barium, có thé loi
dung tinh chat nay dé cé lap saponin
` O
`
Spirostan Diosgenin
2.2.5 Quy trinh tach chiét glycozit ra khéi cAy
Cấu trúc hóa học của glycozit rất đa dạng nên tính chất phân cực của mỗi phân tử thay đổi tùy theo cầu trúc của aglycon và số phân tử đường gắn aglycon, vì thế khơng thể có một phương pháp chung nào cho tất cả các glycozit Các glycozit có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong ete dầu hỏa, hexan, benzen nhưng tan được trong cloroform, dietyl ete (các monoglycozit), tan tốt trong alcol, nước Người ta thường chiết glycozit bằng nước nóng, etanol, metanol hoặc hỗn hợp
alcol-nước 50-90%
Trước tiên bột cây được loại béo bằng hexan hoặc ete dầu, bột cây còn lại được chiết tiếp bằng alcol 50-100% (etanol, metanol) Dung dịch alcol được thêm
Trang 23một ít nước và được loại tap bằng dung dịch acetate chì 20% Cũng có thê loại tạp
bằng Pb(OH);, AI(OH)z;, Fe(OH)a Lọc bỏ tủa Dung dịch nước trong này được
cho thêm dung dịch nước bão hòa Na;SO¿ để tủa acetate chì Lọc lay phan nƯỚớc
trong Dung dịch nước này được làm khan với Na;SOx hoặc MgSO¿, rồi đuôi dung
môi sẽ thu được cao
Bột cây
Tận chiết với eter dâu hỏa đê loại béo - lận chiết với hôn hợp etanol hoặc methanol-nước
Eter dầu hỏa Dung dịch nước alcol
(chứa chất béo, clorophyl, các -Dung dịch nước acetal chì 2-5%
chất có mau, ) -Lọc, rửa tủa với nước cat Dung dịch nước Trầm hiện
-Dung dich Na;SO,
-Lọc, rửa tủa với nước cat
Dung dịch nước Trầm hiện PbSO,
|_ -Tận chiết lỏng lỏng với C
Dung dịch nước
| -Tận chiết lỏng lỏng với Ea
Dung dịch nước
| -Tận chiết lỏng lỏng với ø-butanol
Dung Dung dich n- Dung dich Dung
dịch nước butanol Ea dịch C
-Làm khan, thu -Làm khan, thu -Làm khan, thu hoi dung môi hồi dung môi hôi dung môi
Polyglycosid Polyglycosid monoglycosid
Vv Glycosid toan phan
Hinh 2.3 So d6 quy trinh tach chiét glycozit ra khỏi cây
Trang 242.2.6 Phuong phap thuy giai glycozit
Rất khó xác định cấu trúc của glycozit bằng phương pháp phố nghiệm, đối với
hợp chất glycozit có nhiều phân tử đường gắn vào aglycon, vì các proton -CH-OH hoặc cacbon —-CH-OH của các phần tử đường cho các mũi cộng hưởng với độ dịch chuyên hóa học cùng tập trung vào một vùng, người ta thường thủy phân glycozit
để khảo sát riêng từng phần aglycon và phần đường
Có thể thủy phân glycozit bằng enzym hoặc bằng dung dịch acid Việc thủy
phân bằng dung dịch acid tương đối phức tạp: tùy thuộc vào nồng độ của dung dịch
acid, nhiệt độ, thời gian thủy phân sao cho có thể thủy phân triệt để mà đồng thời
đảm bảo thời gian bảo toàn được cấu trúc aglycon không bị phá hủy hay biến đổi
Do cấu trúc của glycozit đa dạng: số phân tử đường của mỗi glycozit khác nhau, các nối hóa trị giữa đường- đường cũng như giữa aglycon- đường không giống nhau vì thế khơng thể có một điều kiện chung nào cho các glycozit, phải xét từng trường hợp cụ thể
Trong nghiên cứu, trước khi tiễn hành thủy phân một lượng lớn glycozit (cần phải có phố NMR toàn thể glycozit để đự đoán trước cau tric của hợp chất) cần phải có bước nghiên cứu thăm dò với những lượng mẫu nhỏ Bắt đầu với nồng độ acid thấp và thời gian thủy phân ngắn và sẽ nâng dân lên cho đến khi đạt các thông số tối ưu cho phản ứng thủy phân trên hợp chất cần khảo sát
Theo dõi quá trình thủy phân bằng SKLM Khi thực hiện SKLM phải chấm
đồng thời trên cùng một bản: dung dịch đang thủy phân (khảo sát phản ứng theo thời gian), mẫu glycozit ban đầu và chất chuẩn aglycon, nếu có
2.2.6.1 Thủy phân bang men (enzym)
Thông thường men thủy phân có sẵn trong cây tươi, đủ dé tự thủy phân glycozit Để
thực hiện thủy phân glycozit, người ta thường sử dụng enzym là B-glucosidase
(enzym lẫy từ con sên #elix pomafia), cách tiến hành như sau: mẫu glycozit (10mg), dung dich dém acid acetic- acetat natri pH = 4-5 (2ml), enzym ÿ- ølucosidase (10mg), nước cất (1ml) Ủ yên ở nhiệt độ phòng khoang 28°C trong 1-2 ngày Theo quá trình thủy phân bằng SKLM Sau khi thủy phân hoàn tất, thêm vào 5ml nước cất chiết lỏng-lỏng với đietyl ete Lớp dietyl ete này được làm khan nước và được đuôi dung môi ở áp suất thấp cho đến khô thu được aglycon Phần nước còn lại được làm đậm đặc để phân tích đường
Trang 252.2.6.2 Thiy phan bang dung dich acid (HCI, H>SO )
Để cắt đứt nỗi của phần đường gắn vào aglycon qua nhóm —OH của aglycon, thu được aglycon và đường Nếu phân aglycon bền vững với acid, có thể sử dụng các dung dịch acid mạnh như dung dịch Š5-18% HCI, dung dịch 5-70% H;SÖ¿, với thời gian 5-6 giờ ở nhiệt độ 100°C Nếu phần aglycon dễ bị biến đổi với acid, cần sử dụng điều kiện nhẹ nhàng với CHazCOOH 50% với thời gian 5-6 giờ, ở nhiệt độ
70°C hoặc tốt nhất là thủy phân bằng enzym
Thủy phân bằng dung dich Kiliani: dung dich acid gồm (HCI đậm đặc:
CH;COOH: H;O = 10:35:55) Với điều kiện thủy phân: 4mg hợp chat glycozit/ 1ml dung dịch acid Đun hoàn lưu trong một giờ, ở nhiệt độ 100°C Thêm vào một lượng nước gấp đôi, đuôi dung môi ở áp suất thấp cho đến khô Thực hiện như thế 2 lần để đuôi hết acid acetic Căn còn lại được hòa vào một ít nước, thực hiện việc chiết lỏng — lỏng với cloroform thu lấy phần aglycon Phần còn lại được sử dụng đẻ phân tích đường
Thủy phân theo phương pháp được để nghị bởi Mizou Mizou: cho mẫu glycosid (10mg) vao dung dich HCI 10% trong metanol 50% (5ml) Dun hoàn lưu c4ch thuy trong 2-5 gid Dudi metanol Thêm một ít nước và chiết lỏng — lỏng với
etyl acetat Phần etyl acetat được làm khan với NazSO¿ và đuổi dung môi ở áp suất
thấp thu được aglycon Phần nước còn lại được trung hòa bằng cách cho thêm Na;COa hoặc BaCO; cho đến khi pH trung tính Lọc, dung dịch qua lọc được cô đặc
đề phân tích đương
2.2.6.3 Thủy phân bằng dung dịch kiểm
Dé cat đứt các nỗi ester hoặc nối của đường với aglycon ngang qua nhóm chức ester của aglycon, thu được aglycon-COOH và đường Cho mẫu glycozit (10mg) vào dung dịch 5% NaOH (10ml) Đun hoàn lưu trong 2-5 giờ Thêm 5ml nước cất và acid hóa với HCI 1N đến pH = 6 Chiết lỏng — lỏng với butanol, phần butanol được làm khan nước với Na;SOx và đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được aglycon - COOH Lớp nước được cô đặc đề phân tích đường
Trang 263.1 Dung cu
May say
Máy cô quay chân khơng Bình lóng Cột sắc kí - Cột lớn: Đường kính 5 cm, dài 80 cm - Cột nhỏ: Đường kính 3 cm, dài 48 cm - Cột nhỏ: Đường kính 2,5 cm, dài 40 cm - Cột nhỏ: Đường kính 1 cm, dai 29,5 cm Máy soi UV Bếp điện
Becher, erlen, phéu, giấy lọc, lọ bị,
3.2 Hóa chất
Dung mơi eter dầu hỏa, diclorometan, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất
Acid H;S5O¿ pha thuốc hiện hình trong metanol 20%
Silica gel 60 Scharlau 40-63 um và bản mong sac ki trang silica gel 60 Fosa
3.3 Phương pháp sac ki")!
3.3.1 Phương pháp sắc kí cột
Sắc ký cột là một trong những kỹ thuật rất quan trọng Trong nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, sắc ký cột thường được sử dụng để tách riêng các hợp chất từ
một hỗn hợp Chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cô định được nhôi trong các
ống hình trụ gọi là “cột” Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự
tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố
Trang 27là cột hấp phụ Chất hấp phụ thường được sử dụng là silica gel, oxyt nhôm, CaCOa, than hoạt tính, polyamid, pha động là các dung môi hữu cơ với nhiều tý lệ khác nhau, việc tìm hệ dung môi dựa vào SKLM Thông thường người ta nap silica gel vào cột dưới dạng sệt (nạp ướt) do silica gel có khả năng trương nở khi bị solvat hóa
Cac vi tri hoạt động trên bé mat cua hat silica gel 14 nhom silanol, mỗi nhóm
cách nhau 5amstrong Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel chỉ cần thêm hoặc loại bớt nước Khi silica gel hấp phụ nước, các phân tử nước sẽ che khuất những vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel làm hạt giảm hoạt tính, muốn tăng hoạt tính trở lại của silica gel chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước
Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol -OH, day là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc kí Do đó các hợp chất hữu cơ phân cực (có mang nhóm chức -OH, NH;, -
COOH, ) bị giữ chặt trong cột và bị giải ly ra muộn hơn so với những chất kém
phân cực như alcan, terpen (là những chất khơng có những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị giữ lại sẽ ra muộn hơn
3.3.1.1 Chuẩn bị cột sắc kí
Rửa cột thật sạch, trắng với nước cất và sây khô rồi cho bông gòn vào đáy cột, kẹp cột thắng đứng trên giá sắt Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ giữa chất hấp phụ và mẫu thay đôi thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,
Trọng lượng chất phân tích
Cho chất hấp phụ vào cột: Tỷ lệ =
Trọng lượng chất hấp phụ
Trong một becher đã chứa sẵn dung môi (loại bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho
chất hấp thu vào becher, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuay nhe
đều Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến
bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng
Nhờ một phễu lọc có đi dai dat trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ
khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher sạch ở bên dưới cột, dung môi này được rót trả lại lên đầu cột
Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa đùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột
Trang 28Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để cột được
nạp chặt hơn, cho đến khi thay chat hap thu trong cột có dạng đồng nhất
Trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, luôn
luôn phải có dung mơi phủ trên phần đầu cột
Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp phụ ở đầu cột phải nằm ngang Nếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ phần dung mơi sát mặt thống làm xáo trộn một phần
chất hấp phụ ở trên đầu cột, để yên, chất hấp phụ lắng xuống từ từ tạo nên một mặt
thoáng bằng phẳng, dé dam bảo việc tách các chất được đồng đều Để cột ôn định
trong một khoảng thời gian, sau đó mới tiến hành nạp mẫu vào đầu cột
Trước khi nạp mẫu vào cột cần trộn một ít chất hấp phụ và say khô để mẫu chất phân bố đều Hòa mẫu chất đã tiền hấp phụ với một lượng tối thiểu dung môi, cho vào đầu cột một cách đều đặn bằng pipeet được rây đều trên thành cột sắc kí Q trình nạp mẫu được xem là kết thúc khi dung môi trên đầu cột sắc kí trong suối 3.3.1.2 Giải ly sắc ki cột pha thường
Giải ly cột với các dung mơi có độ phân cực tăng dần để đuôi các chất ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực tương ứng Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm thêm từ từ mỗi lần vài phân trăm một dung
mơi mới có tính phân cực cao hơn vào dung môi cũ đang sử dụng Nếu tăng tính
phân cực nhanh thì sẽ làm gãy cột Nguyên nhân do chất hấp phụ khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi bị quá nhiệt cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách chất không tốt
Vận tốc chảy của dung môi rửa cột cũng phải điều chỉnh cho phù hợp, không
được quá nhanh vì dung môi không kịp cân bằng với chất hấp phụ, cũng không được quá chậm hoặc cho ngừng lại một thời gian sẽ làm cho chất tan bị khuếch tán ảnh hưởng đến hiệu quả tách
Khi sử dụng dung môi giải ly là Me hoặc nước, hai loại dung mơi này có thể hòa tan một lượng nhỏ silica gel khiến cho dung dịch giải ly hứng được có chứa
một ít silica gel, gây hiêu lầm là hợp chất thu duoc Silica gel dễ dàng hòa tan trong
nước pH<?7
3.3.1.3 Theo dõi quá trình giải ly cột sắc kỉ
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau, đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi
Trang 29cột Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường khơng có màu, nên dung dịch giải ly
cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau
Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự Dung dịch trong những lọ hứng được sẽ được SKLM trên cùng một
bản mỏng Những lọ nào có kết quả SKLM giống nhau sẽ được gom chung lại với
nhau thành một phân đoạn, cô quay đuổi dung môi ở áp suất kém thu được các cao của phân đoạn đó
3.3.2 Sắc kí lớp mỏng 3.3.2.1 Nguyên tắc
Sắc ký lớp mỏng (hay sắc ký bản mỏng) còn gọi là sắc ký phẳng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung
môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ như silica gel G hoặc oxit alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tâm kiếng, tâm nhôm hoặc tâm plastic nhờ sulfat canxi khan, tỉnh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ Trong silica gel thương phẩm, nếu có tiếp vị ngữ “G” nghĩa là silica gel có trộn thêm chất kết dính sulfat calci nửa phân tử nước
[CaSOu(0,5H;O)] Sự hiện diện của 1on calci hầu như không cản trở quả trình sắc
kí, thường trộn với chất kết dính với tỉ lệ 10% Các tắm bản mỏng silica gel tráng
sẵn thường trộn thêm chất phát huỳnh quang, được ghi trên hộp là silica gel 60 Fas¿
Bình sắc ký là một chậu, hũ, lọ bằng thủy tỉnh, hình dạng đa dạng nhưng
có nắp đậy để dung mơi bão hịa, ổn định trong bình Pha tĩnh là một lớp mỏng khoảng 0,25 mm
Mẫu chất phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau, nhờ một ống vi quản sử đụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2- 5%, , được đưa lên lớp pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình sắc ký
Pha động là dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyên cham chậm đọc theo
tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung mơi di chun đi lên cao nhờ vào tính mao quản, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của đung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các tương tác với pha tĩnh và pha động của các thành phần trong mẫu chất Đối với pha tĩnh là silica gel các chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các chất phân cực sẽ
di chuyên chậm
Trang 303.3.2.2 Giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá tri Ry cua mẫu Cần sử dụng bình nhỏ nhất có thể vì như thế bầu khí quyén sé nhỏ nhất Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung mơi vào bình Mực dung môi không được cao hon vi trí chấm mẫu trên bản mỏng
Trước khi cho tắm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung mơi để có
một bầu khí quyên đồng nhất, để q trình bão hịa dung môi được nhanh người ta phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc
Đặt tắm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung môi giải ly khoảng 0,5-1 cm Hệ dung ly phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vết
chính có R; khoảng từ 0,3 đến 0,6 ⁄ ~~ day binh
Binh trién khai sac ky
o-0 2 ASK Co
Cac vét cham mau trên
bản mỏng
Hình 3.4 Triển khai SKLM
Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sử dụng máy soi UV ở các bước sóng 254 và 365 nm
Nhúng bản mỏng trong dung dịch 20% H;SO¿ trong metanol Sau đó hong khơ
ho ban mỏng trên bếp điện ở nhiệt độ khoảng 110°C đến khi các vết hiện rõ
Trang 31
mm Tiền tuyến
A dung môi ae
Ree _—8_ Đoạn đường di chuyển của hợp chất
b © Tb Đoạn đường di chuyên của dung môi
a
T-F- Mức xuất phát
Hình 3.5 Cách tính giá trị R¿
3.4 Phương pháp chuẩn bị cao '°
Trong cây cỏ có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ không phân cực đến phân cực, vì thế muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc kí cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn Do đó thường cần phải chuẩn bị
một loạt cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết tương đối ít
hợp chất, giúp cho q trình cơ lập chất dễ dàng hơn Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giỗng nhau sẽ hòa tan vào nhau”, dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung mơi có tính phân cực trung bình sẽ hịa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực
3.4.1 Dung moi
3.4.1.1 Dung môi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây
Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử (polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, khơng hồ tan trong dung môi hữu cơ Vì thế, việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất có trọng lượng phân tử nhỏ
Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, nhưng đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung mơi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các
Trang 32loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng metanol (có thê chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)
* Nguyên tắc tông quát là lựa chọn dung mơi và quy trình phù hợp đề chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tuỳ thuộc vào đặc tính của chất có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập Các hợp chất tự nhiên có cấu trúc và độ phân cực khác nhau nên chưa có một quy trình tổng quát nào áp dụng cho tất cả các nhóm, mà mỗi nhóm có một số quy trình chiết tách đặc trưng Vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực
tiếp trên cây mới có thể chọn được quy trình phù hợp
Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40°C vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thê làm hư hại các hợp chất kém bên nhiệt
3.4.1.2 Lựa chọn dung môi để chiết tách
Chọn dung mơi phải có tính trung tính, khơng độc, khơng quá dễ cháy, hoà tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung mơi đó có thể được loại
bỏ dễ dàng Cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc đễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như đietyl ete, carbon tetraclorua Trường hợp cần khảo sát đối với một số nhóm chất đặc biệt có thể sử dụng dung môi có điều chỉnh pH (trong trường hợp
chiết alkaloid, flavonoid ) Khi sử dụng các dung môi dễ cháy cần phải thực hiện
ở một nơi có điều kiện phòng cháy chữa cháy tốt và cách ly với các phịng thí
nghiệm khác
3.4.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất
Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai, lọ bằng thủy tinh để tránh lẫn các tạp chất, thường là chất hóa dẻo do chứa trong các thùng nhựa
Cloroform, diclorometan có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid như brucm, strychnin, ephedrine để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCI có thể gầy ra sự phân huỷ, sự khử nước, sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ
Dietyl ete ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy, độc, có thể
gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxid dễ gây nổ Peroxid này rất hoạt tính, có thể oxid hoá các hợp chất có mang nhiều nối đơi liên
hợp (thí dụ như caroteno1d)
Trang 333.4.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm su ngam kiét, sy ngam dam, sw trich voi may chiét Soxhlet Ngoai ra, cịn có thể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (lưu chất siêu tới
hạn), chiết có sự hỗ trợ của vi sóng
3.4.2.1 Kỹ thuật chiết ran long a Kỹ thuật chiết ngắm kiệt
Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì khơng địi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp
Dụng cụ: Gồm một bình ngắm kiệt bằng thủy tỉnh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngẫm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết
Cách tiền hành: Bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Mẫu không
nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu được xay quá mịn sẽ có tính nhay nhựa hoặc có thể trương nở sẽ cản trở dịng chảy Đáy của bình ngẫm kiệt được lót bằng
bơng thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy
tinh, lên gan day binh Day bé mat lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên
bằng những viên bi thủy tỉnh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung mơi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội
Để yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngắm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung mơi tỉnh khiết chảy xuống bình ngắm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngẫm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này
Hiệu quả phương pháp: So sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp
này đồi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu qua lai cao hon va it mat công hơn vì đây là quá trình chiết liên tục, dung mơi trong bình ngắm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tỉnh khiết
Trang 34b Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngắm kiệt nhưng
khơng địi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn
mẫu cây Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tỉnh hoặc bằng thép khơng
gi, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung mơi hữu cơ có thể hịa
tan một ít nhựa, gầy nhằm lẫn là hợp chất có chứa trong cây
Rót dung mơi tỉnh khiết vào bình cho đều xấp bẻ mặt của lớp bột cây Giữ yên
ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho đung môi xuyên thấm vào
câu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết
được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung mơi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây
Giấy lọc Dung môi xấp xấp Phu thủy tỉnh Dung dich ý” chiết qua lọc
Hình 3.6 Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Bột cây Bình thủy tỉnh —> &
Chúng ta có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn,
xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc đề lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung
ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)
Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố
định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến khi đạt mức bão hịa, khơng thể thêm được nhiều hơn nên có ngâm lâu cũng chỉ làm mắt thời gian
Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và
được tiêp tục sử dụng đê chiết các lần sau
Trang 35c _ Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet
Máy có bán sẵn với nhiều kích cỡ khác nhau, từ bình cầu 250 mL đến 15 L
Ống ngưng hơi C
an
ở L Nút mài (2)
Túi vải chứa |
bột cây |
- n S= Chú ý: Bột cây trong ống l2
không nên cao hơn mức này
Ống B
Ống thông nhau E
Vién bi thủy tỉnh
Hình 3.7 Kỹ thuật chiết bằng máy Soxhlet
Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải dé dé lây bột cây ra khỏi máy Lưu ý đặt vài viên bi thủy tỉnh đưới đáy ống D đề tránh làm nghẹt lỗi ra vào của ống thông nhau E Không được đề lượng bột cây trong ống D cao vượt hơn mức cong của ông thông nhau E
Rót dung mơi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài (2), như thế dung môi sẽ thẫm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (thẻ tích dung mơi trong bình cầu không được vượt quá 2/3 thê tích bình cầu)
Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sơi nhẹ đều Khi
dung dịch trong bình cầu sôi, dung môi tỉnh khiết sẽ bốc hơi sao đó theo ống B lên
cao hơn rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa nhưng tại đây hơi đung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thê lỏng, rớt thắng xuống ống D đang chứa bột cây Dung môi ngẫm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hịa tan
vào dung mơi Theo q trình đun nóng, lượng dung mơi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E vì đây là ống thông nhau Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D
Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyên dung môi theo như mô tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung mơi
tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết Tiếp tục đến khi chiết
kiệt chất trong bột cây
Trang 36Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi thu
được cao chiết
Khi thực hiện chiết với dung mơi có nhiệt độ sơi thấp, phịng thí nghiệm ở xứ
nóng, cân lưu ý xem ống ngưng hơi có đủ sức làm ngưng tụ hơi hay không Nếu
thấy đầu trên cao của hệ thống ngưng hơi có khí bốc ra, cần tìm cách nỗi dài thêm
ống ngưng hơi nhưng khơng làm ống bị bít
Ưu điểm của kỹ thuật: Tiết kiệm dung môi, chỉ một lượng ít dung mơi mà
chiết kiệt được mẫu cây Không tốn công lọc và châm dung môi mới, chỉ cần cắm
điện, mở nước hoàn lưu là máy sẽ thực hiện sự chiết Chiết kiệt hợp chất trong bột
cây vì bột cây ln được liên tục chiết băng dung môi tỉnh khiết
Nhược điểm: Kích thước máy Soxhlet làm giới hạn lượng bột cây cần chiết Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột cây được trữ lại trong bình cầu A nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sơi của dung mơi, vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị hư hại Do toàn bộ hệ thống của máy đều bằng thủy tỉnh và được gia công thủ công nên giá thành một máy khá cao, dễ vỡ 3.4.2.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng
Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung địch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập riêng những hợp chất tỉnh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Người ta dùng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tinh phan cực khác nhau
Hình 3.8 Bình lóng
Trang 37Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ ete dầu hỏa) sẽ
hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo ), dung
môi phân cực trung bình (thí dụ dietyl ete, diclorometan ) hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ete -O—, aldehyd — CHO, ceton -CO- ester -COO- ) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ metanol, etanol ) hòa tan tốt các chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức —OH, -COOH )
Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại khơng hồ tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi)
Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ năm ở lớp
trên hoặc ở dưới so với pha nước
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung
môi phân cực thí dụ như: ete dầu hỏa hoặc hexan, diclorometan, etyl acetat,
butanol Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung mơi, chiết đến khi khơng cịn chất hịa tan vào dung mơi thì đổi sang chiết với dung mơi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần
chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na;SO¿,
MpgSO¿, CaS5O¿ , đuôi dung môi ta thu được cao chiết
Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn lại ở trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hồn tất có thể sử đụng phương pháp SKLM, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thê nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng khơng cịn nhìn thấy vết của chất đó trong pha
nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt
dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tắm kiếng sạch, sau khi bay hơi hết dung môi
nếu khơng cịn đề lại vết gì trên mặt kiếng chứng tỏ đã chiết kiệt
Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung mơi thì khả năng hịa tan của dung môi sẽ tăng lên và
nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi
Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau đung mơi trong bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp Khi dung mơi trong bình lóng tạo nhũ tương có thể sử dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào trong bình lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ
Trang 38xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp Cũng có thể phá bọt bằng cách ly tâm
dung dịch Cay tươi Vv Bot cay
- Rửa sạch, loại bỏ lá khô héo, sâu, bệnh
- Lay phan 14 va than 14 say khô, xay nhỏ
- Ngâm dầm với metanol
- Chiết lỏng — lỏng với diclorometan lay lớp dưới
-Cô quay thu hồi đung môi -Chiết lỏng — lỏng với ety] acetat lấy lớp trên
Cao Me tông | | Cao PE Lớp dưới
- Cô quay thu hồi dung môi
Vv
Cao DC Lop trén
! :
Cao Ea Cao n-Bu
SVTH Phan Thi Trinh - MSSV 2064027
Hình 3.9 Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các cao
Trang 393.5 Phương pháp xác định cẫu trúc
Việc xác định cấu trúc hóa học của hợp chất được thực hiện nhờ phương pháp hóa lý (đo điểm nóng chảy, khối phố MS, phổ hồng ngoại IR, phố cộng hưởng từ hạt nhân NMR ) Khối phố cung cấp thông tin về kích thước, cơng thức ngun của phân tử, phố hồng ngoại cung cấp thông tin về nhóm định chức, phơ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều giúp cho thấy rõ hơn về khung sườn
cacbon-hydrogen của hợp chất cần khảo sát Từ những đữ liệu phổ giải đoán cấu
trúc và so sánh với tài liệu của những chất có liên quan
Trang 404.1 Diéu ché cac loai cao
Khắc phục nhược điểm của phương pháp trích ly lỏng lỏng bằng bình lóng là hiện
tượng xuất hiện nhũ tương do lắc nhiều lần, ta thực hiện trích ly ran long bang sắc
kí cột nhanh đề điều chế các loại cao 4.1.1 Sắc kí cột nhanh
Sắc kí cột nhanh dùng áp suất kém để gia tăng gia tăng vận tốc giải ly của pha
động, được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được Dụng cụ gồm phếu lọc xốp bằng
thủy tỉnh Một hệ thống tạo áp suất thường dùng vòi nước hơn là máy bơm vì chỉ cần áp suất vừa phải Chất hấp phụ thường dùng là silica gel có độ hạt mịn (40- 50um), hoặc AlzOs dùng cho SKLM
Nạp chất hấp phụ vào phễu lọc dưới trạng thái khô, gán phễu vào hệ thống tạo áp suất kém, vừa gõ nhẹ vào thành phễu để chất hấp thụ được nén đều, tạo thành
một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng Chiều cao chất hấp phụ
sau khi được nén không được quá cao Nếu cần tách lượng chất nhiều thì dùng phễu có đường kính lớn hơn
Chất cần sắc kí được hịa tan trong dung mơi ít phân cực, nạp vào cột, gan ap suất kém, dung dịch mẫu sẽ được hút vào phần silica gel ở đầu cột thành một lớp mỏng đều Cũng có thể nạp mẫu ở dạng khô Dung dịch cao được trộn với một lượng chất hấp phụ, ta được bột rắn khô (có thể đi dung mơi bằng cô quay chân không), cho lớp bột này lên đầu cột để có một lớp mỏng và đều Nối với hệ thống tạo áp suất kém Đồ một thê tích dung môi nhất định lên bề mặt phếu, dung môi sẽ được rút xuống bình tam giác hứng phía dưới Sau khi dung môi được rút hết, ngưng áp suất, rót phần dung môi vừa giải ly ra khỏi cột vào một bình khác Lần
lượt triển khai từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực Theo dõi quá